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摘要

该方案提供了一种方法, 建立人性化小鼠 (hu-nsg) 通过肝内注射人类造血干细胞到辐射条件下的新生儿 nsg 小鼠。hu-nsg 小鼠容易感染 hiv 感染和组合抗逆转录病毒疗法 (cart), 是治疗艾滋病毒复制和潜伏期调查的合适病理生理模型。

摘要

人类病理学、免疫学和治疗发展研究的伦理法规和技术挑战, 对小动物模型的需求很高。与人类有着密切的遗传和行为相似, 像老鼠这样的小动物是人类疾病模型的理想选择, 通过这些模型可以重述类似人类的症状和反应。此外, 可以改变小鼠的遗传背景, 以适应不同的需求。nod/scid/il2rγ null (nsg) 小鼠是应用最广泛的免疫功能低下小鼠菌株之一;它允许植入与人类造血干细胞和/或人体组织和随后的功能性人类免疫系统的发展。这是了解艾滋病毒/艾滋病等人类特有疾病的预后和病理生理学以及帮助寻找治愈方法的一个重要里程碑。在此, 我们报告了一个详细的方案, 以产生人性化的 nsg 小鼠模型 (hu-nsg) 造血干细胞移植到辐射条件下的新生儿 nsg 小鼠。hu-nsg 小鼠模型显示了移植的人的干细胞的多谱系发展和对 hiv-1 病毒感染的易感性。它还概述了与组合抗逆转录病毒疗法 (cart) 相响应的关键生物学特征。

引言

由于建立适合人类疾病的动物模型是找到治愈方法的关键, 随着时间的推移, 适当的动物模型早已得到追求和改进。已经开发出多种免疫功能低下的小鼠模型, 允许人体细胞和组织的雕刻, 并随后执行人性化的功能1,2。这种人性化的小鼠模型对于研究人类特有的疾病3、4、5至关重要。

因感染人体免疫机能丧失病毒 (hiv) 而引起的获得性免疫缺陷综合症 (aids) 就是一个例子。在建立人性化的小鼠模型之前, 伦理和技术限制将艾滋病毒/艾滋病临床前动物研究局限于非人类灵长类动物3。然而, 对这种动物进行专门护理的高昂费用和要求阻碍了典型学术环境中的艾滋病毒/艾滋病研究。hiv 主要感染人类 cd4 + t 细胞, 并影响其他人类免疫细胞的发育和免疫反应, 如 b 细胞、巨噬细胞和树突状细胞6;因此, 对移植功能人体免疫系统的小动物模型的需求很大。

1988年取得了突破, 当时 cb17-科学小鼠与 prkdc科学突变的开发, 并显示出成功的人类免疫系统1的雕刻。prkdc科学突变导致小鼠 t 细胞和 b 细胞功能缺陷和消融的适应性免疫系统, 从而能够植入人外周血单个核细胞 (pbmc)、造血干细胞 (hsc) 和胎儿造血组织7,8。尽管如此, 在这种模式中经常观察到低水平的雕刻;可能的原因是 1) 残留的先天免疫活性通过自然杀手 (nk) 细胞调制和 2) 小鼠 t-和 b 细胞 (泄漏)的后期发育。非肥胖糖尿病 (nod)-科学小鼠模型的后续发展实现了 nk 细胞活性的显著降低;因此, 它能够支持更高层次和更可持续的人类免疫系统组成部分9的雕刻。为了进一步抑制或阻碍先天免疫的发展, 建立了小鼠模型, 在 (nod)-科学背景中, 白细胞介素-2 受体γ链 (il2rg) 被截断或完全敲除。il2rg, 也被称为常见的细胞因子受体γ-链, 是各种细胞因子受体 10,11,12,13的不可缺少的组成部分。品种, 如 nod。cg-prkdcscidil2rgtm1wji (nsg) 和 nodshe.cg-prkdcscidil2rgtm1Wji (nog) 对小鼠细胞因子信号转导和 nk 细胞发育的完全消融造成了强大的干扰。此外, 适应性免疫有严重损伤,14, 15,16。

在艾滋病毒/艾滋病研究中经常使用三种具有科学突变和 il2rg 敲除的人的小鼠模型: blt (骨头 marrowyanglemesus) 模型、pbl (外周血白细胞模型) 和 src ( scid 反细胞模型)3. blt 模型是通过在小鼠肾囊下对人的胎儿肝脏和胸腺进行手术移植, 并伴有静脉注射胎儿肝 hsc3,17,18。blt 小鼠模型具有较高的雕刻效果, 在所有血统中开发人类造血细胞, 并建立强大的人体免疫系统;此外, t 细胞在人类自体胸腺中接受教育, 并表现出 hla 受 ha 限制的免疫反应4,5,17,19。然而, 外科手术的要求仍然是 blt 模型的主要缺点。通过与人外周淋巴细胞静脉注射建立 pbl 小鼠模型。pbl 模型提供了方便, 并产生了成功的 t 细胞雕刻, 但其应用有限, 由于不足的 b 细胞和骨髓细胞植皮, 较低的雕刻水平整体, 并开始严重的移植物抗宿主疾病 (gvhd)3 ,20。src 小鼠模型是通过向新生或年轻成人 scid 小鼠注射人 hsc 建立的。它表现出平均雕刻效率超过 25% (被评估为外周血 cd45 百分比), 并支持多系发展的注射 hsc 和制定一个先天的人体免疫系统。然而, src 模型的局限性在于 t 细胞响应是鼠标 h2 受限而不是人类 hla 受限14,21。

src 小鼠模型被认为是临床前艾滋病毒/艾滋病小动物研究的一个简单可靠的模型, 人类免疫系统的一致植入和造血发育的成功就是例证。我们以前报告了核供应国集团 hu-src-scid (hu-nsg) 小鼠模型的建立, 并介绍了其在艾滋病毒复制和延迟研究22、23、24 中的应用。这种 hu-nsg 小鼠模型显示了高水平的骨髓定位, 易感性的艾滋病毒感染, 并概述了 hiv 感染和发病机制。此外, hu-nsg 小鼠模型对组合抗逆转录病毒疗法 (cart) 作出适当反应, 并在 cart 退出后重述血浆病毒反弹, 确认建立了 25, 26 艾滋病毒潜伏期库 ,27岁。从受感染和 cot 治疗的 hu-nsg 小鼠身上分离出的人体外感染病毒的生产进一步证实了这一艾滋病毒潜伏期。

在此, 我们描述了从新生儿 nsg 小鼠建立 hu-nsg 小鼠模型的详细方案, 包括与 hiv 感染和 cart 治疗有关的潜伏期发展的程序。我们期望该协议在 hiv 动物研究中提供一套新的方法, 包括 hiv 病毒学、潜伏期和治疗。

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研究方案

所有动物护理和程序都是根据希望城市机构动物护理和使用委员会 (iacuc) 审查和批准的协议进行的, 该委员会由这项研究的主要调查员 (john rossi 博士, iacuc #12034) 持有。人类胎儿肝脏组织是根据联邦和州规定从高级生物科学资源 (加州阿拉米达) 获得的, 该资源是一个非营利组织。供应商有自己的机构审查委员会 (irb), 并符合人的主体保护要求。从希望市献血者中心 (加利福尼亚州杜阿尔特) 的匿名健康献血者的废弃外周血标本中分离出人类 pbmc, 但没有关于年龄、种族、性别或族裔的鉴定。irb #/ref #: 97071/075546

1. 一般无菌做法

  1. 在指定的层流柜中进行组织培养实验。
  2. 在无菌条件下保持组织培养培养基和补充剂, 并在使用前使用0.22μm 过滤装置进行过滤。
  3. 将人类 hsc 保存在无菌管中, 并保持在冰上, 直到注射。
  4. 由于严重的免疫缺陷, 无菌处理 nsg 小鼠。穿一次性手术礼服、头帽、面罩、鞋套和手套, 以防止污染。在实验前后, 用二氧化氯灭菌剂 (如clidox) 对工作台表面、辐照支架和诱导室进行麻醉。
  5. 术后眼眶出血后应用以石油为基础的眼药膏, 以防止眼睛干燥。
  6. 改变含有抗生素的饮食, 以防止因眼眶后出血引起的感染。

2. 处理 hiv 病毒、感染啮齿动物和含有病毒的血组织样本

注意: hiv 是人类的一种3类病原体;必须准确地遵循处理规则。

  1. 在指定的 BSL2+/3 实验室空间处理含有 hiv 病毒的样本。在运输过程中, 将含病毒试剂安全地锁定在辅助容器中。运输前, 用10% 的漂白剂和异丙醇彻底擦拭所有容器的外表面。
  2. 将所有含病毒废物存放在指定的废物容器中, 并装有2-3 层生物危险废物袋。在废物处置之前, 用碘/乙氧基非烷基酚溶液 (如wsocdyne) 和高压灭菌器慷慨喷洒废物进行消毒。
  3. 佩戴个人防护服: 发帽、面罩、防溅面罩、鞋套、一次性手术长袍和双层手套。
  4. 极其谨慎地处理受感染的啮齿类动物。在小鼠处于麻醉状态时进行注射和采血 (步骤5.1-5.2、6.3-6.5、7.3 和 8.1-8.2)。

3. 造血干细胞的分离

  1. 准备用于组织消化的胶原酶----------------------------------
    1. 溶解胶原酶粉, 使库存溶液浓度为 100 mg/ml, 并在-20°c 时将胶原酶溶解剂储存在150μl 的原料。
    2. 对于工作的胶原酶溶液, 用 15ml rpmi 1640 稀释150μl 的胶原酶-分离酶库存, 辅以10% 的 fcs 和1% 的青霉素/链霉素。
      注: 用于组织消化的胶原酶的最终浓度为 1 mg/ml。
  2. 使用无菌剃须刀片, 将胎儿肝脏组织 (怀孕 16-24周) 切成小块 (约2-3 毫米3大小), 然后在室温下用胶原酶溶液 (1 mg/ml) 消化30分钟。调整消化液的体积, 使所有的组织块完全淹没。使用注射器柱塞的后端轻轻研磨组织样品, 以促进消化。
  3. 通过70μm 无菌尼龙网过滤器将消化混合物通过, 以获得单个细胞悬浮液。
  4. 根据制造商的说明, 使用 macs 系统为 cd34+ hsc 进行丰富。
  5. 使用血液监测仪28计算富集 cd34+ hsc的存活百分比, 并对新生儿 nsg 小鼠进行肝内注射。
  6. 在冷冻介质 (如cryostor cs2) 中冷冻剩余的浓缩 cd34+ hsc, 并将细胞保存在液氮罐中。在将来使用时, 在注射前重新计算解冻的 cd34+ hsc 的可行百分比。随着冷冻介质的使用, 解冻后的生存能力在80% 至90% 之间。

4. 新生儿 nsg 小鼠肝内注射人 cd34+ hsc

注: 新生儿 nsg 小鼠出生2-3天后最适合这一程序, 因为它们的强度足以承受半致死剂量的照射, 而幼小的时候可以完全受损的免疫系统。hsc 注射不需要麻醉。

  1. 将新生儿 nsg 小鼠 (通常为5-10 个小鼠, 均为男性) 的整个垃圾放在一个无菌的馅饼形辐照笼子中, 并暴露在铯-137 辐射源的 2, 200 cgi 伽马射线总剂量下。确保辐射剂量在范围内, 因为当 nsg 小鼠受到高剂量的照射时, 可以观察到显著的体重减轻甚至死亡。12
    注: 辐射对健康有害, 应采取个人防护措施。
  2. 在照射后, 用注射器注射每个新生儿 nsg 小鼠 5 x 10 5 个可行的人类 cd34 + hsc (图 1)。直接向肝脏注射细胞。

5. 经后眼眶出血和流式细胞术分析的植入物验证

  1. 在 hsc 注射后 10-12, 使用异氟氧吸入装置麻醉小鼠。调整氧气流量, 使异氟醚百分比保持在4-5。麻醉需要 3-5分钟, 具体取决于单个鼠标。适当麻醉的小鼠表现出缓慢而深刻的呼吸模式, 对脚部的刺激没有反应。
  2. 通过眼眶后采样 28, 从每只小鼠收集50-100μl 外周血.将血液样本存放在 k2edta 或肝素化采血管中, 以防止凝血。
    注: 采血管必须有抗凝血涂层, 以便小鼠 pbmc 可以从全血中分离出来, 进行流式细胞仪分析。edta 被认为能抑制酶促反应, 如 pcr 和 qrt-pcr;因此, 如果需要下游酶反应, 请使用肝素化血液收集装置。
  3. 在4°c 条件下, 以 2, 000 x g 离心血液样本 20分钟, 以培养血细胞。
    1. 如果需要细胞因子分析, 在离心后将等离子体上清液转移到新的微离心管中, 并在-80°c 下储存。
    2. 使用红细胞裂解缓冲液 (材料表) 在室温下将血细胞颗粒中的红细胞 (rbc) 裂解10分钟。
      注: 如果不需要血浆样品, 直接裂解全血与裂解溶液, 而无需离心。
  4. 在4°c 下, 在 300 x g 的 rbc 裂解5分钟后, 颗粒剩余的血细胞;吸气上清液。用含有 dpbs 的 0.01% bsa 清洗细胞颗粒, 在4°c 下在 300 x g 下离心机 5分钟, 并吸入上清液。重复清洗步骤一次。
  5. 在4°c 下, 用100μl 的1x 阻滞鸡尾酒 (配方表 3 ) 将细胞块20分钟。
  6. 阻塞后, 在浓度为 2μl/106 的细胞下, 将每个抗体溶液直接添加到细胞悬浮液中, 并在4°c 孵育30分钟。雕刻抗体验证有: 抗人类 cd45 (白细胞, rrid: AB_2732068), 抗人类 cd3 (t 细胞, rrid: AB_396896), 抗人类 cd4 (帮助 t 细胞, rid: AB_397037), 抗人类 cd8 (细胞毒性 t 细胞, rrid: AB_2722501), 抗人类 cd14(单核细胞, rri:AB_10373536) 和抗人类 cd19 (b 细胞, rri:AB_10373382)。有关建议的流面板, 请参阅表 4和材料表, 了解目录号、rrid 和批号。
    注: 阻滞溶液中的抗体染色消除了抗人类抗体与小鼠表面标记的非特异性结合, 因为几个表面标记在人与小鼠之间共享同源性。
  7. 将人类 pbmc 与健康捐献者隔离, 并使用纯化的人 pbmc 准备单染色流式细胞术补偿控制, 或者使用荧光标记的微球作为补偿控制29。
  8. 使用流式细胞仪分析外周血样本, 并量化人类 cd45 + 细胞、人类 cd3+ 细胞、人类 cd14+ 细胞和人类 cd19 + 细胞来自总外周血细胞的百分比。
    1. 对于下游 hiv 感染和潜伏期研究, 计算 cd3 + 细胞中 cd4 + t 细胞和 cd8 + t 细胞的百分比。
      注: 通常情况下, 在艾滋病毒感染之前, cd4:cd8 的比例在1.5和2.5 之间。

6. 用 qrt-pcr 分析 hi-nsg 小鼠 hiv 感染和血浆病毒载量

  1. 利用 p24 elisa 试剂盒 31, 从健康的捐献者身上传播人类 pbmc 中的 hiv bal 病毒库,在感染后第10天收获, 并进行滴定。
  2. 选择在外周血中具有20% 以上人类 cd45 + 细胞的 hu-nsg 小鼠进行 hiv 感染。
  3. 使用异氟氧吸入装置对 h-nsg 小鼠进行麻醉 (步骤 5.1)。
  4. 确认动物被麻醉后, 通过腹腔途径以每只小鼠200纳克的剂量注射 hiv bal 病毒。
    注: 对针头要格外小心, 不要重复使用针头, 使用后立即丢弃到指定的锋利容器中。病毒给药后对注射部位进行消毒。
  5. 感染后三周, 用肝素化毛细血管和收集管麻醉 h-nsg 小鼠, 并通过眼眶后出血收集外周血。
  6. 以 2, 000 x 克离心分离血浆和血细胞20分钟。
  7. lyse rbc. 用抗体阻止和染色剩余的血细胞, 用于流式细胞仪分析 (第5.3-5.8 节)。
    注: 流式细胞术分析应侧重于比较感染前后的 cd4:cd8 比例。cd4 + 细胞计数预计显著减少, 因为 cd4 抗原是病毒进入的共同受体。
  8. 使用血浆样本使用 qrt-pcr 分析 hiv 病毒载量。使用病毒 rna 迷你试剂盒从血浆样本中分离病毒 rna。使用制造商的协议, 使用 hiv-1 ltr 特定引物和探针集 (表 5中的序列详细信息) 执行 qrt-pcr。

7. cart 的口头管理和病毒抑制的验证 (可选)

注: 此步骤对于在急性感染阶段的 hiv 预后、病毒学或与感染相关的病理生理学的调查是可选的。对感染艾滋病毒的 hu-nsg 进行 cart 治疗, 以重述接受 cart 的人类患者的艾滋病毒潜伏期。成功感染艾滋病毒的 hi-nsg 小鼠给予 cart 4周。cart 方案包括富马酸替诺福韦异丙酯 (tdf; 300 mgl 细胞)、恩曲他滨 (ftc; 200 mgsocp) 和 raltegravir (ral; 400 mg/spa)。根据体表面积 (表 1, 公式 1, 表2) 32 调整治疗感染艾滋病毒的 hi-nsg 小鼠的 cart 剂量.

  1. 计算每个笼子在一周的治疗中所需的每种药物的数量, 同时考虑到水瓶的体积、每个笼子里的老鼠数量, 以及每只老鼠平均每天的4毫升水摄入量。
    注: 此步骤的关键点是确保每只小鼠在4毫升的饮用水范围内获得其每日剂量。
  2. 将所有三种药物的调整剂量研磨到细粉中, 并将粉末混合物溶解在加糖的水中 (例如, medidrop suralose)。每周更换水瓶, 用加糖的水供应新鲜溶解的 cart 鸡尾酒。
    注: 药粉不得立即溶解, 在将瓶子送回保持架之前, 用力摇晃以达到均匀的悬浮。
  3. 每两周通过后眼眶出血收集外周血液样本, 并使用流式细胞术 (第5.3-5.8 节) 和血浆病毒载量 (第6.6 节) 分析 cd4:cd8 比率。
    注: 通常情况下, 经过4周的治疗后, 血浆病毒载量降低到低于检测极限, 并恢复典型的 cd4:cd8 比率。

8. cart 退出时病毒恢复的验证 (可选)

注: 此步骤对于验证延迟模型至关重要, 因为 cart 退出时的病毒反弹提供了延迟库的直接证据。它也被推荐作为 hiv 反弹抑制剂的治疗调查的控制实验。

  1. 外周血样本中血浆病毒载量低于检测限值后的 cart 提取计划, cd4:cd8 的比例恢复到1.5 至2.5 之间。
  2. 在 cart 戒断后的每2周通过眼眶后出血收集外周血液样本。密切监测血浆病毒载量的变化 (第6.6 节) 以及 cd4:cd8 比率 (第5.3-5.8 节)。

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结果

流式细胞术分析经常进行, 以验证分离的 hsc 的纯度, 评估雕刻水平, 对病毒感染的特征免疫反应, 并调查相符的疗效。一个典型的抗体面板包含4-6 个荧光标记抗体;因此, 具有多个激光器和多种滤波器的流式细胞仪对于获得准确的结果至关重要。

对于初始雕刻验证, 人类 cd45 + 细胞计数可以从20% 到80% 不等, 人类白细胞的子集应该?...

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讨论

免疫损伤的小鼠与人的细胞组织一起存在着人类的生理特征, 对人类特有疾病的病理、病理生理学和免疫学研究具有巨大的价值。在免疫功能低下的多株小鼠中, nod。cg-prkdc科学il2rgtm1wji (nsg) 模型是最免疫缺陷的, 因为它缺乏先天免疫和适应性免疫, 以及消融的鼠特异性细胞因子信号 3,12, 19.因此, nsg 小鼠?...

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披露声明

提交人没有透露利益冲突。

致谢

这项工作得到了国家卫生研究院 [赠款编号 r01ai29329、r01ai42552 和 r01hl07470 至 j. r.) 和国家卫生研究院国家癌症研究所 [赠款编号 p30ca033572 以支持希望城市综合基因组学] 的支持, 分析药理学和分析细胞计芯]。以下试剂是通过国家卫生研究院艾滋病研究和参考试剂方案、艾滋病司、niaid、nih 获得的: hiv bal 病毒。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
CD34 MicroBead Kit, humanMiltenyiBiotec130-046-703
CryoStor CS2Stemcell Technologies07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory005557Order breeders instead of experimental mice
IsoFloPatterson Veterinary07-806-3204Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectantFisher SicentificNC9189926
WescodyneFisher Sicentific19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needleHamilton80508Custom made
Blood collection tube (K2EDTA)BD Bioscience367843
Blood collection tube (Heparin)BD Bioscience365965
Capillary tube (Heparinized)Fisher Sicentific22-362574
Red Blood Cell Lysis BufferSigma Aldrich11814389001
QIAamp Viral RNA mini kitQiagen52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master MixThermofisher4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit)PerkinElmerNEK050B001KT
IgG from human serumSigma AldrichI4506-100MG
IgG from mouse serumSigma AldrichI5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30)BD Biosciences564586RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7)BD Biosciences557851RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4)BD Biosciences558116RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8)BD Biosciences563795RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4)ThermoFisherMHCD1427RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1)ThermoFisherMHCD1904RRID: AB_10373382, LOT 1725304B

参考文献

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