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Resumo

Este protocolo fornece um método para estabelecer ratos humanizados (hu-NSG) através da injeção de colestase de células estaminais hematopoiéticas em camundongos NSG neonatais condicionada por radiação. O mouse hu-NSG é suscetível à infecção pelo HIV e terapia anti-retroviral combinatória (carrinho) e serve como um modelo fisiopatológico apropriado para investigações de latência e a replicação do HIV.

Resumo

Normas éticas e desafios técnicos para a pesquisa em patologia humana, imunologia e desenvolvimento terapêutico colocaram modelos animais pequenos em alta demanda. Com uma estreita semelhança genética e comportamental aos seres humanos, animais pequenos, tais como o rato são bons candidatos para modelos de doenças humanas, através do qual podem ser instauradas respostas e sintomas parecidos com os humanos. Além disso, o fundo genético de rato pode ser alterado para acomodar demandas diversas. O NOD/SCID/IL2rγnula (NSG) é uma das variedades mais amplamente utilizado de rato imunocomprometidos; permite enxertia com células-tronco hematopoiéticas humanas e/ou tecidos humanos e o desenvolvimento posterior do sistema imunológico humano funcional. Este é um marco fundamental na compreensão do prognóstico e fisiopatologia das doenças de humanos específicos tais como HIV/AIDS e auxiliando a busca de uma cura. Neste documento, nós relatamos um protocolo detalhado para a geração de um modelo de mouse NSG humanizado (hu-NSG) pelo transplante de células-tronco hematopoiéticas para um rato NSG neonatal condicionada por radiação. O modelo do rato do hu-NSG mostra desenvolvimento multi linhagem de células-tronco humanas transplantadas e susceptibilidade à infecção viral do HIV-1. Ele também recapitula a principais características biológicas, em resposta à terapia anti-retroviral combinatória (carrinho).

Introdução

Porque estabelecer modelos animais apropriados para doenças humanas é a chave para encontrar uma cura, modelos animais apropriados tempo foram perseguidos e melhorados ao longo do tempo. Foram desenvolvidas múltiplas variedades de imunocomprometidos murino modelos que permitem a enxertia de células humanas e/ou tecidos e a subsequente execução de funções humanizada1,2. Tais modelos de rato humanizado são críticos para investigações de doenças de humanos específicos3,4,5.

Adquirida síndrome da imunodeficiência (AIDS) resultantes de infecção com o vírus de imunodeficiência humana (HIV) é um exemplo. Antes da criação de modelos de rato humanizado, limitações éticas e técnicas limita-se a estudos animais pré-clínicos de HIV/AIDS para primatas não-humanos3. No entanto, as despesas elevadas e requisitos para tratamento especializado para tal animal dificultam estudos de HIV/AIDS em configurações acadêmicos típicos. HIV, principalmente, infecta células humanas CD4 + T e impacto sobre o desenvolvimento e respostas imunes de outras células imunes humanas tais como as células B, macrófagos e células dendríticas6; Portanto, pequenos modelos animais transplantados com sistema de imunológico humano funcional estão em alta demanda.

Um grande avanço veio em 1988, quando os ratos CB17 -scid com uma mutação Prkdcscid foram desenvolvidos e mostrou a enxertia bem sucedida do sistema imunológico humano1. Os resultados de mutação Prkdcscid em funções de células T e B defeituosa e um ablated sistema imune adaptativo em camundongos, possibilitando a enxertia de periférico humano sangue células mononucleares (PBMC), células-tronco hematopoiéticas (linfócitos), e os tecidos hematopoiéticos fetais7,8. No entanto, níveis baixos de enxertia frequentemente são observados neste modelo; causas possíveis são 1) residual atividade imune inata modulada através de assassinas naturais (NK)-células e 2) o desenvolvimento de estágio final de rato - e B-células T (leakiness)5. O desenvolvimento posterior do diabético não-obesos (ASSENTIMENTO)-modelo de ratoscid alcançado dramática para baixo-regulação da atividade de células NK; assim, é capaz de suportar um nível mais alto e mais sustentável enxertia de de componentes do sistema imunológico humano9. Ainda mais inibem ou impedem o desenvolvimento da imunidade inata, modelos de rato tendo truncamento ou nocaute total da interleucina-2 receptor γ-cadeia (Il2rg) no (ASSENTIMENTO) - fundoscid foram estabelecidas. Il2rg, também conhecido como comum do cytokine receptor γ-cadeia, é um componente indispensável de várias citocinas receptores10,11,12,13. Cepas como NOD. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) e NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) apresentam interrupção robusta de rato citocinas sinalização e ablação completa do desenvolvimento de células NK, em Além de grave comprometimento da imunidade adaptativa14,15,16.

Três modelos de rato humanizado, tendo um scid , mutação e nocaute Il2rg são frequentemente empregados na pesquisa de HIV/AIDS: o modelo BLT (medula óssea/fígado/Timo), o modelo PBL (leucócitos de sangue periférico) e o modelo SRC (SCID repovoamento celular) 3. o BLT modelo é criado através de cirurgia transplante de fígado fetal humano e Timo sob a cápsula do rim de rato acompanhado com injeção intravenosa de linfócitos feto fígado3,17,18. O modelo do rato de BLT oferece eficácia de enxertia alta, desenvolvimento de células hematopoiéticas humanas em todas as linhagens e o estabelecimento de um forte sistema imunológico humano; Além disso, as células T são educadas em um timo humano autólogo e prova HLA-restrito imune respostas4,5,17,19. No entanto, a exigência de procedimentos cirúrgicos continua a ser a grande desvantagem do modelo BLT. O modelo do rato do PBL é estabelecido pela injeção intravenosa com células linfoides periféricas humanas. O modelo PBL oferece conveniência e rende bem sucedida enxertia de células T, mas sua aplicação é limitada devido à insuficiente da B-pilha e enxertia de células mieloides, níveis baixos de enxertia globais e o aparecimento de grave enxerto doença contra o hospedeiro (GVHD)3 ,20. O modelo do rato do SRC é estabelecido através de injeção de linfócitos humanos em ratos adultos jovens ou recém-nascidos do SCID. Ele exibe a eficiência da enxertia média acima de 25% (avaliada como sangue periférico CD45 porcentagem) e suporta o desenvolvimento de múltiplos-linhagem de linfócitos injetados e a elaboração de um sistema imune humano inato. No entanto, a limitação do modelo SRC é que a resposta de células T é mouse H2-restrito em vez de humano HLA-restrito14,21.

O modelo do rato do SRC é considerado um modelo fácil e confiável para HIV/AIDS pequenos animais estudos pré-clínicos, exemplificado pela enxertia consistente de um sistema imunológico humano e desenvolvimento bem sucedido hematopoiético. Nós anteriormente relatado o estabelecimento de um modelo de mouse NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) e descreveu a sua aplicação na replicação do HIV e latência estudos22,23,24. Este modelo de rato hu-NSG apresenta níveis elevados de hospedagens de medula óssea, susceptibilidade à infecção pelo HIV e recapitulação da infecção pelo HIV e patogênese. Além disso, o modelo do rato do hu-NSG responde adequadamente à terapia antiretroviral combinatória (carrinho) e recapitula rebote viral do plasma após retirada do carrinho, confirmando o estabelecimento de um HIV latência reservatório25,26 ,,27. Este reservatório de latência do HIV é secundado pela produção da replicação vírus HIV ex vivo induzida por humanos células CD4 + T-isoladas de ratos infectados e tratados com carrinho hu-NSG a descansar.

Aqui, descrevemos o protocolo detalhado para a criação do modelo do mouse hu-NSG de ratos NSG neonatais, incluindo os procedimentos relacionados ao tratamento de infecção e carrinho de HIV para desenvolvimento de latência. Esperamos que este protocolo para oferecer um novo conjunto de abordagens em estudos com animais HIV sobre virologia de HIV, latência e tratamento.

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Protocolo

Todos os cuidados com animais e os procedimentos foram realizados de acordo com protocolos revisto e aprovado pela cidade de esperança Animal cuidados institucionais e Comissão de utilização (IACUC) realizada pelo investigador principal deste estudo (Dr. John Rossi, IACUC #12034). Tecido do fígado fetal humano foi obtido de avançados recursos de Biociências (Alameda, CA), uma organização sem fins lucrativos, em conformidade com as regulamentações federais e estaduais. O fornecedor tem o seu próprio institucional Review Board (IRB) e está em conformidade com os requisitos de proteção do sujeito humano. PBMC humano é isolado de amostras de sangue periférico descartados de doadores saudáveis anônimos da cidade de Hope sangue doador Center (Duarte, CA), com nenhuma identificação em relação a idade, raça, sexo ou etnia. IRB #/ REF #: 97071/075546

1. general prática asséptica

  1. Realizar experimentos de cultura de tecidos em armários designado fluxo laminar.
  2. Manter o meio de cultura de tecido e suplementos em condições estéreis e filtrar usando um antes de unidade de filtração de 0,22 µm para usar.
  3. Linfócitos humanos preparados em tubos estéreis de preservar e manter no gelo até injeção.
  4. Como resultado de severa deficiência imunológica, lidar com ratos NSG assepticamente. Use um vestido de cirurgia descartável, touca, máscara facial, tampas da sapata e luvas para evitar contaminação. Limpar a superfície da bancada, titular da irradiação e câmara de indução de anestesia com esterilizante de à base de dióxido de cloro (por exemplo, Clidox) antes e depois de experiências.
  5. Aplica a pomada à base de petróleo após retrô-orbital de sangramento para evitar os olhos secos.
  6. Mudar de antibiótico contendo dieta para prevenir a infecção devido a sangramento retrô-orbital.

2. manipulação de vírus do HIV, infectados, roedores e amostras de sangue/tecido contendo vírus

Atenção: O HIV é um patógeno humano classe 3; as manipulação de regras devem ser seguidas exatamente.

  1. Lidar com amostras contendo vírus de HIV em um designado BSL2 + / espaço de laboratório 3. Bloquear vírus contendo reagentes firmemente em um recipiente secundário durante o transporte. Desinfecte a superfície exterior de todos os recipientes limpando completa com 10% de lixívia e isopropanol antes do transporte.
  2. Manter todos os resíduos que contenham vírus no contentor de lixo designado com 2-3 camadas de sacos de resíduos de risco biológico. Antes da eliminação de resíduos, desinfecte pulverizando generosamente os resíduos com solução de nonilfenol etoxilado/iodo (por exemplo, Wescodyne) e autoclave.
  3. Utilize equipamento de protecção pessoal: touca, capa de rosto, protetor de cara antirespingo, tampas da sapata, vestido de cirurgia descartáveis e luvas de camada dupla.
  4. Lidar com roedores infectados com extrema cautela. Conduta injeções e coleções de sangue, enquanto os ratos estão sob anestesia (etapas 5.1-5.2, 6.3-6.5, 7.3 e 8,1-8,2).

3. isolamento de células-tronco hematopoiéticas

  1. Prepare a solução de colagenase/dispase para a digestão do tecido.
    1. Dissolver o pó de colagenase/dispase para fazer a solução em uma concentração de 100 mg/mL e armazenar a solução-mãe de colagenase/dispase em 150 alíquotas µ l a-20 ° C.
    2. Para trabalhar a solução de colagenase, dilua 150 µ l de caldo de colagenase/dispase com 15 mL de RPMI 1640 suplementado com FCS de 10% e 1% penicilina/estreptomicina.
      Nota: A concentração final de colagenase/dispase para a digestão do tecido é de 1 mg/mL.
  2. Com uma lâmina de barbear estéril, corte tecido hepático fetal (16-24 semanas de gestação) em pedaços pequenos (aproximadamente 2-3 mm3 no tamanho) seguido de digestão com solução de colagenase/dispase (1 mg/mL) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Ajuste o volume da solução de digestão para que todas as peças de tecido são totalmente submerso. Use o back-end do êmbolo da seringa para suavemente moer a amostra de tecido para facilitar a digestão.
  3. Passe a mistura de digestão através de um filtro de malha de nylon estéril de 70 µm para adquirir uma suspensão de célula única.
  4. Enriquece para CD34 + linfócitos usando um sistema de MACS por instruções do fabricante.
  5. Contar a porcentagem viável de linfócitos CD34 + enriquecido usando um hemacytometer28 e proceder a injeção colestase neonatais ratos NSG.
  6. Congelar o restante enriquecido CD34 + linfócitos no congelamento de mídia (por exemplo, CryoStor CS2) e preservar as células em um tanque de nitrogênio líquido. Sobre o uso futuro, recontar a porcentagem viável de descongelado CD34 + linfócitos antes da injeção. Com o uso de meios de congelamento, pós-degelo viabilidade é entre 80 a 90%.

4. colestase injeção de linfócitos humanos CD34 + em camundongos NSG Neonatal

Nota: Ratos Neonatal NSG 2-3 dias do nascimento são mais adequados para este procedimento, como eles são fortes o suficiente para suportar a irradiação no metade-lethal dose, enquanto jovem suficiente para ter totalmente prejudicada sistemas imunitários. Sem anestesia é necessária para a injeção de HSC.

  1. Coloque a ninhada inteira de ratos NSG neonatais (tipicamente 5-10 ratos, ambos os sexos) em uma gaiola de irradiação estéril em forma de torta e expor a uma dose total de 200-250 cGy radiação de raios gama de uma fonte de radiação do césio-137. Certifique-se a dose de radiação está dentro do intervalo, como perda de peso significativa ou até mesmo a morte pode ser observada quando os ratos NSG estão expostos a altas doses de irradiação. 12
    Nota: A radiação é um perigo para a saúde, proteção pessoal contra a radiação deve ser tomada.
  2. Após a irradiação, injetar cada rato NSG neonatal com 5 x 105 viável humanas CD34 + linfócitos usando uma configuração de agulha/seringa (Figura 1). Diretamente, injete as células do fígado.

5. enxertia validação através de Retro-Orbital de sangramento e análise de citometria de fluxo

  1. A injeção de 10-12 semanas pós-HSC, anestesiamos ratos usando um aparelho de inalação de oxigênio/isoflurano. Ajuste o fluxo de oxigênio para manter a porcentagem de isoflurano em 4-5%. Anestesia leva 3-5 minutos, dependendo do mouse individual. Ratos anestesiados corretamente mostram um lento e padrão de respiração profunda e nenhuma reação à estimulação do dedo do pé-beliscar.
  2. Colete 50-100 µ l de sangue periférico de cada mouse através de de amostragem retrô-orbital28. Armazenar as amostras de sangue em K2EDTA ou tubos de colheita de sangue heparinizado para evitar a coagulação.
    Nota: Tubos de colheita de sangue são necessários ter revestimento anticoagulante para que o rato PBMCs podem ser isolados de sangue para análise de citometria de fluxo. EDTA é conhecido por inibir reações enzimáticas como a PCR e qRT-PCR; assim, se a jusante reações enzimáticas são necessárias, use um instrumento de coleta de sangue heparinizado.
  3. Centrifugar as amostras de sangue a 2.000 x g por 20 minutos a 4 ° C para as células do sangue de Pelotas.
    1. Transferi os sobrenadantes de plasma para novos tubos de microcentrifuga após centrifugação e loja a-80 ° C se a análise de citocinas é necessária.
    2. Lise os glóbulos vermelhos (hemácias) dentro o sangue centrifugado em temperatura ambiente por 10 minutos usando o tampão de lise de células vermelhas do sangue (Tabela de materiais).
      Nota: Se não exigidas, amostras de plasma lyse diretamente o sangue com a solução de Lise sem centrifugação.
  4. Pelota restantes células de sangue depois da lise de RBC a 300 x g por 5 minutos a 4 ° C; Aspire o sobrenadante. Lave as pelotas de célula com 0.01% BSA contendo DPBS, centrifugar 300 x g por 5 minutos a 4 ° C e aspire o sobrenadante. Repita a etapa de lavagem mais uma vez.
  5. Bloco de células com 100 µ l de 1 x bloqueio cocktail (tabela 3 para receita) por 20 minutos a 4 ° C.
  6. Após o bloqueio, diretamente adicionar cada solução de anticorpo para a suspensão de células em uma concentração de 2 µ l/106 células e incubar a 4 ° C por 30 minutos. Anticorpos para validação de enxertia são: anti-humanos CD45 (leucócitos, RRID: AB_2732068), anti-humano CD3 (células-T, RRID: AB_396896), anti-humano CD4 (auxiliar as células-T, RRID: AB_397037), anti-humano CD8 (células T citotóxicas, RRID: AB_2722501), anti-humano CD14 (monócitos, RRID: AB_10373536) e anti-humanos CD19 (células-B, RRID: AB_10373382). Para painel de fluxo sugerido, por favor consulte tabela 4 e Tabela de materiais para números de catálogo, RRIDs e muito.
    Nota: Mancha do anticorpo em solução de bloqueio elimina a ligação não-específica dos anticorpos anti-humanos na direção de marcadores de superfície do mouse, como vários marcadores de superfície compartilhar homologia entre humanos e mouse.
  7. Isolar PBMCs humanos de doadores saudáveis e preparar manchada único fluxo cytometry controles de compensação usando purificada PBMCs humano... como alternativa, use microesferas de fluorescência-etiquetada como compensação controla29.
  8. Analisar as amostras de sangue periférico usando um citômetro de fluxo e quantificar a percentagem de células humanas CD45 +, CD3 + células humanas, CD14 + células humanas e CD19 + células humanas totais periféricas das células do sangue.
    1. Para a infecção de HIV a jusante e estudos de latência, calcule a porcentagem de células T CD4 + e CD8 + células T dentro das células CD3 +.
      Nota: Normalmente, uma relação CD4:CD8 entre 1,5 e 2,5 é observada antes da infecção de HIV30.

6. análise da infecção pelo HIV de hu-NSG ratos e Plasma carga Viral usando qRT-PCR

  1. Propagar ações virais de HIV BaL em PBMC humano de doadores saudáveis, colheita de cada pós-infecção dia 10 e titula-se usando p24 ELISA kit31.
  2. Ratos de hu-NSG selecionar com mais de 20% humano CD45 + células no sangue periférico para a infecção pelo HIV.
  3. ANESTHETIZE ratos hu-NSG usando um aparelho de inalação de oxigênio/isoflurano (etapa 5.1).
  4. Depois de confirmar o animal é anestesiado, injetar o vírus HIV BaL na dose de 200 ng de p24 por rato por via intraperitoneal.
    Nota: Seja extremamente cauteloso com a agulha, não reutilizar agulhas e descartar imediatamente após o uso em recipiente ponto designado. Desinfecte o local da injeção após administração de vírus.
  5. Três semanas pós-infecção, anestesiar os ratos hu-NSG e coletar sangue periférico por meio retrô-orbital sangramento usando heparinizado tubos capilares e tubos de colheita.
  6. Plasma separado e as células do sangue por centrifugação a 2.000 x g por 20 minutos.
  7. Lisar hemácias. Block e mancha restantes células com anticorpos para análise de citometria de fluxo (seção 5.3-5.8).
    Nota: Análise de citometria de fluxo deve centrar-se em comparar a proporção de CD4:CD8 antes e após a infecção. Espera-se uma diminuição significativa na contagem de células CD4 +, como o CD4 antígeno serve como um receptor de co para a entrada viral.
  8. Utilização de amostras de plasma para analisar o HIV viral carregam usando qRT-PCR. Isole o RNA viral de amostras de plasma utilizando um kit mini do RNA viral. Executar qRT-PCR com primers específicos HIV-1 LTR e sonda define (detalhes de sequência na tabela 5), usando o protocolo do fabricante.

7. oral administração de carrinho e validação de Viral supressão (opcional)

Nota: Este passo é opcional para as investigações sobre o prognóstico do HIV, virologia ou fisiopatologia relacionados com infecção durante a fase aguda da infecção. tratamento de carrinho de hu-NSG infectados pelo HIV é usado para recapitular a latência de HIV entre pacientes humanos, recebendo o carrinho. Ratos infectados pelo HIV com êxito hu-NSG recebem carrinho durante 4 semanas. O regime de carrinho consiste tenofovir disoproxil fumarato (TDF; 300 mg/cápsula), emtricitabina (FTC; 200 mg/cápsula) e raltegravir (RAL; 400 mg/cápsula). A dose de carrinho para o tratamento de camundongos infectados pelo HIV hu-NSG é ajustada de acordo com o corpo de superfície (tabela 1, equação 1, tabela 2)32.

  1. Calcule a quantidade de cada medicação necessária para cada gaiola durante uma semana de tratamento, levando em consideração o volume da garrafa de água, o número de ratos em cada gaiola e uma ingestão média diária de água de 4 mL por rato.
    Nota: O ponto-chave nesta etapa é garantir que cada rato adquire sua dose diária dentro de 4 mL de água potável.
  2. Triture todos os três medicamentos com doses ajustadas em pó fino e dissolver a mistura do pó em água adoçada (por exemplo, Medidrop Suralose). Altere a garrafa de água semanalmente com cocktail fresco dissolvido carrinho fornecido em água adoçada.
    Nota: O pó de drogas não podem dissolver imediatamente, agitar vigorosamente para obter uma suspensão homogênea antes de retornar a garrafa para a gaiola de exploração.
  3. Coletar amostras de sangue periférico através de retro-orbital hemorragia a cada duas semanas e analisar os dois a relação de CD4:CD8 usando citometria de fluxo (seção 5.3-5.8) e a carga viral do plasma usando qRT-PCR (secção 6.6).
    Nota: Normalmente após 4 semanas de tratamento, a carga viral do plasma diminui para abaixo do limite de detecção e uma relação de CD4:CD8 típico é restaurada.

8. validação de rebote Viral em cima do carrinho de retirada (opcional)

Nota: Este passo é fundamental para validar o modelo de latência, como rebote viral após retirada do carrinho fornece evidência direta de um reservatório de latência. Também é recomendável para servir como um experimento de controle para investigações terapêuticas em HIV suppressants de rebote.

  1. Plano para a retirada do carrinho depois cargas virais de plasma das amostras de sangue periférico estão abaixo do limite de detecção e a relação CD4:CD8 é restaurada para um intervalo entre 1,5 e 2,5.
  2. Colete amostras de sangue periférico retrô-orbital sangrar a cada 2 semanas após a retirada do carrinho. Acompanhar de perto a mudança de cargas virais de plasma (secção 6.6) bem como a relação de CD4:CD8 (seção 5.3-5.8).

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Resultados

Análise de citometria de fluxo é frequentemente realizado para validar a pureza de linfócitos isolados, avaliar níveis de enxertia, perfil respostas imunes à infecção viral, vistoria e eficácia do carrinho. Um painel de anticorpos típica contém anticorpos fluorescente etiquetados individuais de 4-6; assim, um citômetro de fluxo com vários lasers e uma ampla seleção de filtros é crucial para alcançar resultados precisos.

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Discussão

Ratos imunodeprimidos incorporados com células/tecidos humanos apresentam características fisiológicas de humanos e são um enorme valor para estudos de patologia, fisiopatologia e Imunologia sobre doenças específicas de humanos. Entre várias cepas de ratos imunodeprimidos, o assentimento. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) modelo é o mais imunodeficientes devido à sua falta de imunidade inata e adaptativa, bem como retirada do mouse específicas citocinas sinalização

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Divulgações

Os autores divulgar sem conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health [conceder números R01AI29329, R01AI42552 e R01HL07470 para J.J.R.] e Instituto Nacional de câncer do institutos nacionais da saúde [número de concessão P30CA033572 para apoiar a cidade de Hope Integrative Genomics Farmacologia analítica e núcleos de análise Cytometry]. O reagente a seguir foi obtido através de NIH AIDS Programa de pesquisa e referência reagente, divisão de AIDS, NIAID, NIH: vírus HIV BaL.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
CD34 MicroBead Kit, humanMiltenyiBiotec130-046-703
CryoStor CS2Stemcell Technologies07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory005557Order breeders instead of experimental mice
IsoFloPatterson Veterinary07-806-3204Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectantFisher SicentificNC9189926
WescodyneFisher Sicentific19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needleHamilton80508Custom made
Blood collection tube (K2EDTA)BD Bioscience367843
Blood collection tube (Heparin)BD Bioscience365965
Capillary tube (Heparinized)Fisher Sicentific22-362574
Red Blood Cell Lysis BufferSigma Aldrich11814389001
QIAamp Viral RNA mini kitQiagen52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master MixThermofisher4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit)PerkinElmerNEK050B001KT
IgG from human serumSigma AldrichI4506-100MG
IgG from mouse serumSigma AldrichI5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30)BD Biosciences564586RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7)BD Biosciences557851RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4)BD Biosciences558116RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8)BD Biosciences563795RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4)ThermoFisherMHCD1427RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1)ThermoFisherMHCD1904RRID: AB_10373382, LOT 1725304B

Referências

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  4. Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
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