Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu iletişim kuralı radyasyon şartına yenidoğan NSG fareler içine insan hematopoetik kök hücre intrahepatic enjeksiyon yoluyla insanlaşmış fareler (hu-NSG) kurmak için bir yöntem sağlar. Hu-NSG fare duyarlı HIV enfeksiyonu ve kombinatorik antiretroviral tedavi (sepet) ve HIV çoğaltma ve gecikme süresi incelemeler için uygun bir patofizyolojik model olarak hizmet vermektedir.

Özet

Etik kuralları ve teknik sorunlar için araştırma insan patoloji, immünoloji ve terapötik geliştirme küçük hayvan modelleri yüksek talep soktuk. Yakın bir genetik ve davranışsal benzerlik ile insanlar, fare gibi küçük hayvan insan hastalık modelleri, hangi aracılığıyla insan benzeri belirtiler ve yanıt-e doğru recapitulated için iyi adaylardır. Ayrıca, fare genetik arka plan çeşitli talepleri karşılamak için değiştirilebilir. NOD/SCID/IL2rγnull (NSG) fare en çok kullanılan immün fare suşları biridir; engraftment ile insan hematopoetik kök hücre ve/veya insan doku ve işlevsel bir insan bağışıklık sisteminin sonraki geliştirme sağlar. Bu prognoz ve insan özgü hastalıklar HIV/AIDS gibi Patofizyoloji anlama ve tedavi için arama yardım önemli bir kilometre taşıdır. Burada, hematopoetik kök hücre transplantasyonu radyasyon şartına yenidoğan NSG fare içine tarafından bir insanlaşmış NSG fare modeli (hu-NSG) oluşturmak için ayrıntılı bir protokol rapor. Hu-NSG fare modeli çoklu soy gelişme HIV-1 viral enfeksiyon duyarlılık ve transplante insan kök hücreleri gösterir. Ayrıca Kombinatorik antiretroviral tedavi (sepeti) karşılık olarak anahtar biyolojik özellikleri beyannamedir.

Giriş

İnsan hastalıkları uygun hayvan modellerinde kurulması için bir çare bulma anahtar olduğundan, uygun hayvan modelleri uzun edilmiş takip ve zaman içinde geliştirilmiş. Birden fazla immün fare modelleri suşların engraftment insan hücreleri ve/veya doku ve insanlaşmış işlevleri1,2sonraki yürütülmesine izin veren geliştirdik. İnsanlaşmış fare modelleri gibi insan özgü hastalıklar3,4,5araştırmalar için kritik öneme sahiptir.

Edinilmiş bağışıklık yetersizliği Sendromu (AIDS) enfeksiyon human Immunodeficiency virus (HIV) ile sonuçlanan bir örnektir. İnsanlaşmış fare modelleri kurulması önce etik ve teknik sınırlamalar HIV/AIDS preklinik hayvan çalışmaları insan dışı primatlar3sınırlı. Ancak, yüksek gider ve bu tür hayvan için özel bakım için gereksinimleri normal akademik ayarlar çalışmalarda HIV/AIDS engel. HIV öncelikle insan CD4 + T-hücreleri bozar ve gelişme ve bağışıklık yanıtı B-hücreler, makrofajlar ve dendritik hücreleri6gibi diğer insan bağışıklık hücrelerinin etkiler; Bu nedenle, fonksiyonel insan bağışıklık sistemleri ile nakledilen küçük hayvan yüksek talep modellerdir.

Bir atılım CB17 -scid fareler Prkdcscid mutasyon ile geliştirilmiş olup, insan bağışıklık sistemi1' in başarılı engraftment gösterdi otelde 1988'de geldi. Arızalı T ve B hücre fonksiyonları Prkdcscid mutasyon sonuçlarında ve farelerde ablated edinilmiş bağışıklık sistemi, böylece insan periferik engraftment etkinleştirme kan mononükleer hücreler (PBMCs), hematopoetik kök hücre (HSCs), ve Fetal hematopoetik doku7,8. Yine de, engraftment seviyesinin düşük sık sık bu modelde gözlenen; olası nedenleri şunlardır 1) kalan doğuştan gelen bağışıklık etkinlik doğal öldürücü (NK) yolu ile modüle-hücreleri ve 2) fare T ve B hücreleri (leakiness)5son aşama geliştirilmesi. Obez olmayan diyabetik (NOD) sonraki gelişimi-scid fare modeli elde dramatik aşağı-Yönetmeliğin NK hücre faaliyet; Böylece, daha yüksek bir seviyeye ve insan bağışıklık sistemi bileşenleri9daha fazla sürdürülebilir engraftment desteklemek yapabiliyor. Daha fazla bastırmak veya kesilmesi veya interleukin-2 reseptör γ-zinciri (Il2rg) Toplam nakavt (sallama) taşıyan fare modelleri doğuştan gelen bağışıklık, gelişimine engel -scid arka plan kuruldu. Il2rg, olarak da bilinen ortak sitokin reseptör γ-zinciri, çeşitli sitokin reseptörleri10,11,12,13, vazgeçilmez bir bileşenidir. Suşları başını sallamak gibi. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) ve NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (takoz) mevcut fare sitokin sinyal sağlam bozulma ve tam ablasyon NK hücre gelişimi içinde edinilmiş bağışıklığın14,15,16ağır bozukluğu için ek.

Mutasyon ve Il2rg nakavt scid taşıyan üç insanlaşmış fare modelleri sık HIV/AIDS araştırma istihdam edilmektedir: BLT (kemik iliği/karaciğer/timus) model PBL (periferik kan lökosit) model ve SRC (SCID kullanıma hücre) modeli 3. BLT modeli insan fetal karaciğer ve timus fetal karaciğer HSCs3,17,18İntravenöz enjeksiyon ile eşlik fare böbrek kapsülü altında cerrahi nakli yoluyla oluşturulur. BLT fare modeli yüksek engraftment yeterlik, Bütün soy insan hematopoetik hücrelerin gelişimi ve güçlü bir insan bağışıklık sistemi kurulması sunar; Ayrıca, T-hücreleri bir insan otolog timus eğitimli ve HLA-sınırlı bağışıklık yanıtı4,5,17,19sergi. Ancak, cerrahi işlemler gereksinimini BLT modelinin önemli dezavantajı kalır. PBL fare modeli ile insan periferik lenfoid hücreleri Intravenöz enjeksiyon tarafından kurulmuştur. PBL modeli kolaylık sunuyor ve başarılı T-hücre engraftment verir, ancak uygulama yetersiz B-hücre ve myeloid hücre engraftment, düşük engraftment seviyeleri genel ve ağır graft - versus - host hastalığı (GVHD)3 başlangıçlı nedeniyle sınırlıdır ,20. SRC fare modeli insan HSCs enjeksiyonuyla yeni doğan veya Genç Yetişkin SCID fareler içine kuruldu. Bu ortalama engraftment verimliliği % 25 (periferik kan CD45 yüzde değerlendirildi) yukarıda sergiler ve enjekte HSCs çoklu-lineage gelişimi ve doğuştan gelen bir insan bağışıklık sistemi hazırlama destekler. Ancak, SRC model T hücreli yanıt olduğunu fare olduğunu H2 tarafından kısıtlanmış insan HLA-sınırlı14,21yerine kısıtlamasıdır.

SRC fare modeli tarafından bir insan bağışıklık sistemi ve başarılı hematopoetik geliştirme engraftment tutarlı örneği preklinik HIV/AIDS küçük hayvan çalışmaları için facile ve güvenilir bir model olarak kabul edilir. Biz daha önce bir NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) fare modeli kurulması bildirdi ve HIV çoğaltma ve gecikme süresi çalışmaları22,23,24kendi uygulamasında açıklanan. Bu hu-NSG fare modeli kemik iliği posta, HIV enfeksiyonu duyarlılık düzeyi yüksek ve HIV enfeksiyonu ve Patogenez Rekapitülasyon sergiler. Ayrıca, hu-NSG fare modeli uygun şekilde Kombinatorik antiretroviral tedavi (sepeti) yanıt verir ve plazma viral rebound sepeti çekilmesi, bir HIV gecikme süresi rezervuar25,26 kurulması teyit üzerine tablodur ,27. Bu HIV gecikme süresi rezervuar daha fazla insan CD4 + T-hücreleri enfekte ve sepeti tedavi hu NSG fareler izole dinlenme tarafından indüklenen çoğaltma yetkili HIV virüs ex vivo üretim tarafından kanıtlanmış.

Burada, yenidoğan NSG fare gecikme süresi Kalkınma HIV enfeksiyonu ve sepeti tedavisi ile ilgili yordamları da dahil olmak üzere, hu-NSG fare modelinden kurulması için detaylı protokolü açıklar. Yeni HIV hayvan çalışmaları HIV Viroloji, gecikme süresi ve tedavi ile ilgili yaklaşımlar sunar için bu iletişim kurallarını bekliyoruz.

Protokol

Tüm hayvan bakımı ve yordamları gözden geçirilmiş ve şehir, umut hayvan Kurulusları tarafından onaylanmış iletişim kuralları ve kullanım Komitesi (IACUC) (Dr. John Rossi, IACUC #12034) Bu çalışmada yürütücü tarafından düzenlenen göre gerçekleştirilmiş. İnsan fetal karaciğer dokusu gelişmiş Bioscience kaynaklardan (Alameda, CA), kar amacı gütmeyen bir organizasyon, federal ve eyalet düzenlemelerine uygun olarak elde edildi. Satıcının kendi kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) ve insan konu koruma gereksinimleriyle uyumlu. İnsan PBMCs atılan periferik kan örnekleri ile ilgili yaş, ırk, cinsiyet ya da etnik kimliği ile şehir umut kan bağış Merkezi (Duarte, CA), anonim sağlıklı donör etkilenmezsiniz. IRB #/ REF #: 97071/075546

1. general içinde aseptik uygulama

  1. Doku kültürü deneyleri belirlenen laminer akış kabinleri içinde gerçekleştirin.
  2. Doku kültürü orta ve takviyeleri Steril koşullar altında tutmak ve kullanmak için bir 0,22-µm filtrasyon ünitesi önceden kullanarak filtre uygulama.
  3. Steril tüpler hazır insan HSCs korumak ve buza enjeksiyon kadar tutun.
  4. Şiddetli bağışıklık yetersizliği sonucunda, aseptik NSG fareler başa. Tek kullanımlık cerrahi önlük, saç kap, yüz maskesi, galoş ve kontaminasyonu önlemek için eldiven giymek. Tezgah yüzeyine, ışınlama tutucu ve klor dioksit dayalı sterilant (Örneğin, Clidox) ile anestezi indüksiyon odası öncesi ve deney sonrası sterilize.
  5. Petrol bazlı göz merhem kuru göz önlemek için retro-orbital kanama sonra uygulanır.
  6. Değiştirmek için antibiyotik içeren diyet retro-orbital kanama nedeniyle enfeksiyonu önlemek için.

2. işleme HIV virüsü, enfekte kemirgenler ve virüs içeren kan/doku örnekleri

Dikkat: 3. sınıf insan patojen HIV olduğunu; işleme kuralları tam olarak izlenmesi gerekir.

  1. HIV virüsü içeren örneklerinde belirlenmiş bir BSL2 başa +/ 3 laboratuvar alanı. Virüs içeren reaktifler ikincil bir kap içinde güvenli bir şekilde taşıma sırasında kilitleyin. Tüm kapsayıcılara dış yüzeyinin % 10 çamaşır suyu ve isopropanol ulaşım önce ayrıntılı silerek dezenfekte.
  2. 2-3 kat biyolojik atık torbaları ile belirlenen atık kaplarda tüm virüs içeren atıkların tutmak. Atık bertaraf önce cömertçe iyot/ethoxylated nonylphenol çözüm (Örneğin, Wescodyne) ve otoklav ile atık püskürtme dezenfekte.
  3. Kişisel koruyucu donanımları: saç kap, yüz kapağı, Anti-splash yüz kalkan, galoş, tek kullanımlık ameliyat elbisesi ve çift katmanlı eldiven.
  4. Çok dikkatli ile enfekte kemirgenler başa. Fareler (adım 5.1-5.2, 6,3-6.5, 7.3 ve 8.1 8.2) anestezi altında iken iğne ve kan koleksiyonları yürütmek.

3. yalıtım hematopoetik kök hücre

  1. Collagenase/dispase çözüm doku sindirim için hazırlayın.
    1. 100 mg/mL konsantrasyonu hisse senedi çözüm yapmak collagenase/dispase toz geçiyoruz ve collagenase/dispase hisse senedi çözüm 150 µL aliquots-20 ° C'de depolayın
    2. Collagenase çözüm çalışmak için collagenase/dispase hisse senedi 150 µL ile RPMI % 10 FCS ve % 1 penisilin/streptomisin ile 1640 15 mL seyreltik.
      Not: Collagenase/dispase doku sindirim için son konsantrasyonu 1 mg/mL ' dir.
  2. Steril bir tıraş bıçağı ile Oda sıcaklığında 30 dakika collagenase/dispase çözüm (1 mg/mL) ile sindirim ardından fetal karaciğer dokusu (16-24 hafta gebelik) (yaklaşık 2-3 mm3 boyutunda) küçük parçalara kesilmiş. Böylece tüm doku parçaları tamamen sular altında sindirim çözüm ses düzeyini ayarlayın. Arka uç şırınga pistonu hafifçe sindirimi kolaylaştırmak için doku örneği öğütmek için kullanın.
  3. Sindirim karışımı bir tek hücre süspansiyon elde etmek için bir 70 µm steril naylon mesh filtreden geçmek.
  4. CD34 + HSCs bir Mac sistem üreticisinin yönerge başına kullanarak için zenginleştirmek.
  5. Zenginleştirilmiş CD34 + HSCs bir hemacytometer28 kullanarak uygun yüzdesi saymak ve neonatal NSG fareler içine intrahepatic enjeksiyon devam edin.
  6. Kalan zenginleştirilmiş CD34 + medya (Örneğin, CryoStor CS2) dondurma HSCs donma ve sıvı azot tankı hücreleri korumak. İleride kullanmak çözdürülen CD34 + HSCs enjeksiyon önceki uygulanabilir yüzdesi anlattıklarında. Ortam buz gibi kullanılmasıyla, arasında % 80-90 sonrası tezcan canlılığı var.

4. yenidoğan NSG farelerde HSCs insan CD34 + intrahepatic enjeksiyon

Not: bağışıklık sistemleri tamamen engelliler için genç iken yarı-öldürücü doz, ışınlama dayanmak güçlü oldukları gibi Neonatal NSG fareler doğumdan 2-3 gün bu yordam için en uygundur. Anestezi yok HSC enjeksiyon için gereklidir.

  1. Yenidoğan NSG fareler (genellikle 5-10 fareler, her iki cinsiyette) tüm çöp steril turta şekilli ışınlama kafese koyun ve 200-250 cGy Gama-ışın radyasyon toplam bir doz sezyum-137 radyasyon kaynağından bulaşmasına neden. Önemli kilo kaybı ya da ölüm bile NSG fareler için yüksek doz radyoterapi otelde sunulan görülebilir gibi bu radyasyon doz aralığı içinde olduğundan emin olun. 12
    Not: Radyasyon bir sağlık tehlikesi, radyasyona karşı kişisel koruma alınmalıdır.
  2. Işınlama, her yenidoğan NSG fare 5 x 105 ile enjekte uygun insan CD34 + bir şırınga/iğne kurulumu (Şekil 1) kullanarak HSCs. Doğrudan hücre karaciğer enjekte.

5. engraftment doğrulama Retro-Orbital kanama ve Akış Sitometresi Analizi

  1. 10-12 hafta sonrası HSC enjeksiyon fareler bir isoflurane/oksijen solunum cihazı kullanarak anestezi. Oksijen akışı İsoflurane yüzde 4-%5 korumak için ayarlayın. Anestezi bireysel fare bağlı olarak 3-5 dakika sürer. Düzgün imzalat fareler bir yavaş ve derin nefes alma desen ve parmak pinching stimülasyon tepki vermiyor göster.
  2. 50-100 µL periferik kan her fare retro-orbital örnekleme28ile toplamak. Kan örnekleri K2EDTA ya da heparinized kan toplama tüpler koagülasyon önlemek için saklayın.
    Not: Kan toplama tüpler için fare PBMCs-ebilmek var olmak tam kan Akış Sitometresi Analizi için yalıtılmış antikoagülan kaplama olması gereklidir. EDTA PCR ve qRT-PCR gibi Enzimatik reaksiyonları inhibe olduğu bilinmektedir; aşağı akım Enzimatik reaksiyonları gerekiyorsa, böylece, bir heparinized kan toplama aparatı kullanın.
  3. Kan örnekleri 2.000 x g de 4 ° C'de kan hücreleri cips için 20 dakika süreyle santrifüj kapasitesi.
    1. Sitokin analiz gerekli ise plazma supernatants yeni microcentrifuge tüpler Santrifüjü ve mağaza-80 ° C'de sonra aktarın.
    2. Kırmızı kan hücreleri (RBCs) içinde kan hücresi Pelet oda sıcaklığında 10 dakika kırmızı kan hücre lizis tampon (Tablo reçetesi) kullanarak parçalayıcı.
      Not: Plazma numuneleri gerekli değilse, doğrudan lizis çözüm olmadan Santrifüjü tam kan parçalayıcı.
  4. 300 x g de RBC lizis 4 ° C'de 5 dakika sonra kalan kan hücreleri cips; süpernatant Aspire edin. DPBS, 4 ° C'de 5 dakika santrifüj 300 x g de içeren % 0,01 BSA ile hücre topakları yıkama ve süpernatant Aspire edin. Çamaşır bir kez daha yineleyin.
  5. 1 x engelleme 100 µL kokteyl tarifi için (Tablo 3 ) 4 ° C'de 20 dakikadır Hücrelerle taşı
  6. Engelleme sonra doğrudan bir konsantrasyon 2 µL/106 hücre, hücre süspansiyon içine her antikor çözüm ekleyin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca kuluçkaya. Engraftment doğrulama için antikor vardır: Anti-insan CD45 (lökosit, RRID: AB_2732068), Anti-insan CD3 (T-hücreleri, RRID: AB_396896), Anti-insan CD4 (yardımcı T hücreleri, RRID: AB_397037), Anti-insan CD8 (sitotoksik T hücreleri, RRID: AB_2722501), Anti-insan CD14 (monosit, RRID: AB_10373536) ve anti-insan CD19 (B-hücreleri, RRID: AB_10373382). Önerilen akışı panel için Tablo 4 ve Tablo reçetesi katalog numaraları, RRIDs ve lot numaraları için lütfen bakın.
    Not: Çözüm engelleme antikor boyama non-spesifik bağlama fare yüzey işaretleri doğru anti-insan antikorların ortadan kaldırır, çeşitli yüzey imleyicileri Homoloji insan arasında paylaşmak ve fare.
  7. İnsan PBMCs sağlıklı bağışçılardan yalıtmak ve tek lekeli akış sitometresi tazminat kontroller arıtılmış insan PBMCs. alternatif olarak kullanarak hazırlamak, tazminat29kontrolleri gibi floresan etiketli mikroküreler kullanın.
  8. Akış Sitometresi kullanarak periferik kan örnekleri analiz ve insan CD45 + hücreleri, insan CD3 + hücreleri, insan CD14 + hücreleri ve insan hücreleri CD19 + toplam periferik kan hücreleri yüzdesi ölçmek.
    1. Aşağı akım HIV enfeksiyonu ve gecikme süresi çalışmalar için T hücreleri CD4 + ve CD8 + T-hücrelerin CD3 + hücrelerin içindeki yüzdesini hesaplamak.
      Not: Genellikle, HIV enfeksiyonu30önce CD4:CD8 oranı 1,5 ve 2,5 arasında görülmektedir.

6. analiz HIV enfeksiyonu hu-NSG fareler ve plazma Viral yük qRT-PCR kullanarak

  1. İnsan PBMCs sağlıklı bağışçılardan HIV BaL viral stok yaymak, hasat 10 gün sonrası enfeksiyon ve titre p24 kullanarak ELISA kiti31.
  2. Seçme hu-NSG fareler ile % 20'den fazla insan CD45 + HIV enfeksiyonu için periferik kan hücreleri.
  3. Hu-NSG fareler isoflurane/oksijen solunum aparatı (adım 5.1) kullanarak anestezi.
  4. Hayvan anestezi, teyit sonra 200 doz, HIV BaL virüs enjekte p24 mayi rota üzerinden fare başına ng.
    Not: iğne ile son derece dikkatli olun, değil iğne yeniden ve hemen sonra kullanım belirlenen keskin konteyner içine atmak. Virüs yönetim sonra enjeksiyon alanı dezenfekte.
  5. Üç hafta sonrası enfeksiyon, hu-NSG fareler anestezi ve retro-orbital ile periferik kan toplamak kullanarak kanama heparinized kılcal tüpler ve koleksiyon tüpler.
  6. Ayrı plazma ve kan hücreleri tarafından 2.000 x g de Santrifüjü 20 dakikadır.
  7. RBCs. blok parçalayıcı ve kalan kan hücreleri antikorları için Akış Sitometresi Analizi (Bölüm 5.3-5,8) ile leke.
    Not: Akış Sitometresi Analizi öncesi ve sonrası enfeksiyon CD4:CD8 oranı karşılaştırma üzerinde odaklanmalıdır. CD4 + hücre sayısı önemli azalma bekleniyor, CD4 antijeni viral giriş için ortak bir reseptör olarak hizmet vermektedir.
  8. HIV viral analiz etmek için kullanım plazma numuneleri qRT-PCR kullanarak yükleyin. Plazma numuneleri bir viral RNA mini kit kullanarak üzerinden viral RNA yalıtmak. QRT-PCR HIV-1 lt. özgü astar ile gerçekleştirmek ve sonda ayarlar ( Tablo 5sıra ayrıntılarda), üreticinin iletişim kuralını kullanarak.

7. oral yönetim sepeti ve doğrulama, Viral bastırma (isteğe bağlı)

Not: Bu akut enfeksiyon aşamasında HIV prognoz, Viroloji veya enfeksiyon ile ilgili patofizyolojisi ile ilgili araştırmalar için isteğe bağlı bir adımdır. HIV enfekte hu-NSG sepeti tedavisi HIV gecikme insan hasta arabası alma özetlemek için kullanılır. Başarıyla HIV enfekte hu-NSG fareler sepeti 4 hafta süreyle verilir. Sepeti rejimi tenofovir disoproxil fumarat (TDF; 300 mg/kapsül), emtricitabine (MTK; 200 mg/kapsül) ve raltegravir (RAL; 400 mg/kapsül) oluşur. HIV enfekte hu-NSG fareler tedavisi için sepeti doz vücut yüzey alanı (Tablo 1, denklem 1, Tablo 2)32göre ayarlanır.

  1. Su şişesi, fareler her kafes sayısı ve ortalama bir fare başına 4 mL ve su alımı günlük hacmi dikkate alınarak tedavinin bir hafta boyunca her kafes için gerekli her ilaç miktarını hesaplamak.
    Not: Bu adımda anahtar nokta her fare onun günlük doz 4 mL içme suyu içinde edinme sağlamaktır.
  2. Tüm üç ilaçlar ayarlanmış dozlarda ince toz haline eziyet ve şekerli su (Örneğin, Medidrop Suralose) toz karışımı geçiyoruz. Su şişesi her hafta taze çözünmüş sepeti şekerli su verilen kokteyl ile değiştirin.
    Not: Uyuşturucu toz olmayabilir hemen çözülür, holding kafese şişe döndürmeden önce homojen bir süspansiyon ulaşmak için şiddetle çalkalanır.
  3. Retro-orbital iki haftada kanama ile periferik kan örnekleri toplamak ve her ikisi de CD4:CD8 oranı akış sitometresi (Bölüm 5.3-5,8) ve qRT-PCR (Bölüm 6,6) kullanarak plazma viral yük kullanarak çözümleyebilirsiniz.
    Not: Genellikle tedavi 4 hafta sonra plazma viral yük için algılama sınırın altına azalır ve tipik CD4:CD8 oranı geri yüklenir.

8. Viral Rebound sepeti çekilme (isteğe bağlı) üzerine doğrulama

Not: viral rebound sepeti çekilmesi üzerine doğrudan bir gecikme süresi rezervuar kanıtı olarak bu adımı gecikme süresi modeli doğrulanırken kritik olur. Ayrıca HIV rebound suppressants üzerine tedavi araştırmalar için bir denetim deney olarak hizmet etmek için önerilir.

  1. Sepeti çekilmesi için periferik kan örneklerinden plazma viral yük algılama sınırın altına ve CD4:CD8 oranı 1,5 ve 2,5 arasında bir Aralık için geri yüklendikten sonra planı.
  2. Retro-orbital sepeti çekilmesinden sonra 2 haftada kanama ile periferik kan örnekleri toplamak. Yakından plazma viral yük (Bölüm 6,6) değişikliği CD4:CD8 oranı (Bölüm 5.3-5,8) yanı sıra monitör.

Sonuçlar

Akış Sitometresi Analizi sık izole HSCs saflığı doğrulamak, engraftment seviyesini, viral enfeksiyon, profil bağışıklık yanıtlarını ve sepeti etkinliği anket yapılır. Tipik antikor panelinde 4-6 bireysel fluorescently etiketli antikorlar bulunur; Böylece, bir akış sitometresi birden çok lazerler ve filtreleri geniş bir seçki ile doğru sonuçlar elde edilmesi için önemlidir.

İlk engraftment doğrulama,...

Tartışmalar

İmmün fare insan hücreleri/dokusu ile engrafted insan benzeri fizyolojik özellikleri sunmak ve insan özgü hastalıklar ile ilgili patoloji, patofizyolojisi ve İmmünoloji çalışmalar için çok büyük bir değeri vardır. İmmün fareler, NOD birden fazla suşları arasında. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) modelidir en immünyetmezligi3,12,19 sinyal ablated fare özgü sitokin yanı sıra doğ...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları ifşa.

Teşekkürler

Bu eser Ulusal [numaraları R01AI29329, R01AI42552 ve R01HL07470 J.J.R. için vermek] Sağlık Enstitüleri ve Ulusal Sağlık Enstitüleri [grant numarası P30CA033572 şehir umut bütünleştirici genomik desteklemek için Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir Analitik Farmakoloji ve analitik sitometresi çekirdek]. Aşağıdaki reaktif NIH AIDS araştırma ve başvuru reaktif Program, bölünme AIDS, NIAID, NIH elde edildi: HIV BaL virüs.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
CD34 MicroBead Kit, humanMiltenyiBiotec130-046-703
CryoStor CS2Stemcell Technologies07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory005557Order breeders instead of experimental mice
IsoFloPatterson Veterinary07-806-3204Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectantFisher SicentificNC9189926
WescodyneFisher Sicentific19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needleHamilton80508Custom made
Blood collection tube (K2EDTA)BD Bioscience367843
Blood collection tube (Heparin)BD Bioscience365965
Capillary tube (Heparinized)Fisher Sicentific22-362574
Red Blood Cell Lysis BufferSigma Aldrich11814389001
QIAamp Viral RNA mini kitQiagen52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master MixThermofisher4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit)PerkinElmerNEK050B001KT
IgG from human serumSigma AldrichI4506-100MG
IgG from mouse serumSigma AldrichI5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30)BD Biosciences564586RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7)BD Biosciences557851RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4)BD Biosciences558116RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8)BD Biosciences563795RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4)ThermoFisherMHCD1427RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1)ThermoFisherMHCD1904RRID: AB_10373382, LOT 1725304B

Referanslar

  1. Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. SCID mouse models of human stem cell engraftment. Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).
  2. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature. 32 (4), 364-372 (2014).
  3. Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual review of pathology. 12, 187-215 (2017).
  4. Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
  5. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature reviews. Immunology. 7, (2007).
  6. Moir, S., Fauci, A. S. B cells in HIV infection and disease. Nature reviews. Immunology. 9 (4), 235-245 (2009).
  7. McCune, J. M., et al. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
  8. Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335, 256 (1988).
  9. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. Journal of immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
  10. Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87 (3), 956-967 (1996).
  11. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  12. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  13. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  14. Watanabe, Y., et al. The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice). International immunology. 21 (7), 843-858 (2009).
  15. McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
  16. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature. 9 (7), 959-963 (2003).
  17. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12, 1316 (2006).
  18. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  19. Brehm, M. A., Bortell, R., Verma, M., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized Mice in Translational Immunology. Translational Immunology. , 285-326 (2016).
  20. King, M. A., et al. Hu-PBL-NOD-scid IL2rgnull mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host MHC. Clinical & Experimental Immunology. 157, 104-118 (2009).
  21. Halkias, J., et al. Conserved and divergent aspects of human T-cell development and migration in humanized mice. Immunology and cell biology. 93 (8), 716-726 (2015).
  22. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of virology. , (2018).
  23. Zhou, J., et al. Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1. Theranostics. 8 (6), 1575-1590 (2018).
  24. Zhou, J., et al. Cell-specific RNA aptamer against human CCR5 specifically targets HIV-1 susceptible cells and inhibits HIV-1 infectivity. Chemistry & biology. 22 (3), 379-390 (2015).
  25. Brechtl, J. R., Breitbart, W., Galietta, M., Krivo, S., Rosenfeld, B. The use of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with advanced HIV infection: impact on medical, palliative care, and quality of life outcomes. Journal of pain and symptom management. 21 (1), 41-51 (2001).
  26. Richman, D. D., Margolis, D. M., Delaney, M., Greene, W. C., Hazuda, D., Pomerantz, R. J. The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection. Science. 323 (5919), 1304-1307 (2009).
  27. Pace, M. J., Agosto, L., Graf, E. H., O'Doherty, U. HIV reservoirs and latency models. Virology. 411 (2), 344-354 (2011).
  28. Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory animals. 35 (2), 131-139 (2001).
  29. Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry. 77 (5), 410-419 (2010).
  30. Lu, W., Mehraj, V., Vyboh, K., Cao, W., Li, T., Routy, J. -. P. CD4:CD8 ratio as a frontier marker for clinical outcome, immune dysfunction and viral reservoir size in virologically suppressed HIV-positive patients. Journal of the International AIDS Society. 18, 20052 (2015).
  31. van't Wout, A. B., Schuitemaker, H., Kootstra, N. A. Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells. Nature protocols. 3, 363 (2008).
  32. Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 22 (3), 659-661 (2008).
  33. Han, Y., Wind-Rotolo, M., Yang, H. -. C., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. Experimental approaches to the study of HIV-1 latency. Nature reviews. Microbiology. 5 (2), 95-106 (2007).
  34. Marsden, M. D., et al. HIV Latency in the Humanized BLT Mouse. Journal of virology. 86 (1), 339-347 (2012).
  35. Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
  36. Durand, C. M., Blankson, J. N., Siliciano, R. F. Developing strategies for HIV-1 eradication. Trends in immunology. 33 (11), 554-562 (2012).
  37. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
  38. Xu, L., Zhang, Y., Luo, G., Li, Y. The roles of stem cell memory T cells in hematological malignancies. Journal of hematology & oncology. 8, 113 (2015).
  39. Chun, T. -. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  40. Redel, L., et al. HIV-1 regulation of latency in the monocyte-macrophage lineage and in CD4+ T lymphocytes. Journal of leukocyte biology. 87 (4), 575-588 (2010).
  41. Laird, G. M., et al. Rapid Quantification of the Latent Reservoir for HIV-1 Using a Viral Outgrowth Assay. PLoS pathogens. 9 (5), e1003398 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve enfeksiyonsay 143Neonatal NSG farefareHSCsHIVinsanla m sepetigecikme s resi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır