JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

حجم أسينوس الغدة هيبوفارينجيل تدبير قوي الممرضة عسل النحل التغذية. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لتشريح وتلطيخ، والتصوير، وقياس ممرضة النحل هيبوفارينجيل الغدة أسيني.

Abstract

تنتج الغدد هيبوفارينجيل ممرضة الجزء من البروتين للعامل والملكات التي يتم تغذية لوضع اليرقات والملكات. هذه الغدد المزدوجة الموجودة في رأس النحلة حساسة للغاية للكمية ونوعية من حبوب اللقاح وحبوب اللقاح البدائل أن يستهلك النحل ممرضة. الغدد تحصل على أصغر عند الممرضات ويتم تغذية حمية ناقصة وهي كبيرة عندما يتم تغذيتها الوجبات الغذائية كاملة. نظراً لأن حجم الغدة هيبوفارينجيل ممرضة مؤشرا قويا للتغذية ممرضة، من الضروري أن أولئك الذين يدرسون عسل النحل التغذية يعرفون كيفية قياس هذه الغدد. هنا، نحن نقدم طرق مفصلة لتشريح وتلطيخ، والتصوير، وقياس الغدد هيبوفارينجيل النحل ممرضة. نحن نقدم مقارنات بين البيانات التي استخدمت لدراسة تأثير حبوب اللقاح على حجم الغدة والأنسجة أونستاينيد والملون. وقد تم استخدام هذا الأسلوب لاختبار كيف يؤثر حجم الغدة هيبوفارينجيل نظام غذائي ولكن بزيادة استخدام لفهم دور هذه الغدد في خلية الصحة.

Introduction

نحل العسل ضرورية للزراعة نظراً لأنها تلقح مجموعة متنوعة من المحاصيل التي يتم استهلاكها بواسطة البشر والحيوانات. قد أولى الكثير من الاهتمام لانخفاض السكان نحلة العسل كمستعمرة خسائر تحوم حوالي 30-40% سنوياً في الولايات المتحدة1 و 10-15 في المائة في أوروبا2،3. عوامل متعددة، بما في ذلك الوصول إلى انخفاض جودة عالية العلف، قانون يحتمل معا تؤثر تأثيراً سلبيا على صحة نحلة العسل. الأحادية، والجفاف، وممارسات تربية النحل التي لا يمكن تحملها، وعوامل أخرى تقلل من التنوع وكمية من حبات الطلع الطبيعية المتاحة للمستعمرات4،5. لأن عسل النحل تنبع كلها تقريبا من الدهون والبروتينات الغذائية من حبوب اللقاح، انخفاض الوصول إلى لقاح يمكن أن تحد بشدة صحة الفرد ومستعمرة.

الغدد هيبوفارينجيل هياكل الافرازية الموجودة في رأس النحلة بين العينين و الدماغ6. في ظل الظروف العادية، مسار التنموية والوظيفية الغدد مرآة للنحل وهي تقع في. في 5-10 أيام تقريبا من العمر، ينفذ النحلة سلوكيات التمريض في الخلية. هذا وفي الوقت نفسه، الغدد هيبوفارينجيل الوصول إلى ذروة الحجم والقدرة الافرازية، تنتج في الجزء من البروتين الرئيسية من غذاء الحضنة أو هلام تغذية لوضع اليرقات وغيرهما من الكبار، مثل الملكة. في هذا الحجم الذروة تشبه الغدد حفنة من العنب حيث كل العنب بنية فص منفصلة تعرف باسم أسينوس (الجمع: أسيني). كما النحلة عامل الإعمار ويأخذ في مهام مختلفة في الخلية، الغدد هيبوفارينجيل يتقلص وتولى وظائف مختلفة، مثل تحطيم السكريات في رحيق7،8. ولذلك ترتبط الغدد هيبوفارينجيل بسن النحل ومهمتهم المرتبطة بالعمر.

حجم الغدة هيبوفارينجيل الممرضة حساسة لكمية ونوعية من البروتين في النظام الغذائي9،عن10،11. عند النحل ممرضة يحصلون على تغذية جيدة، كبيرة الغدد. بينما الغدد الصغيرة عندما النحل حرمان من حبوب اللقاح، خاصة في الأسبوع الأول من التنمية الكبار. من أجل تحديد الحالة التغذوية لنحلة ممرضة، قياس الباحثين عادة في الغدد هيبوفارينجيل، أما عن طريق قياس مباشرة الغدة acinus الحجم11،12،،من1314 أو البروتين محتوى15،16 أو بقياس البروتين محتوى11 أو الطازجة الوزن17 من الرأس كله تقع فيها. يحتوي كل أسلوب على إيجابيات وسلبيات. ونحن نفضل أن القرار تم الحصول عليها من قياس acini الغدة، على الرغم من أن هذا الأسلوب يمكن أن يكون تحديا في طريقتين الرئيسية. التحدي الأول هو تحديد بشكل صحيح وتشريح الغدة. والثاني هو الحصول على مقياس دقيق لكل أسينوس. تحت مجهر تشريح خفيفة، الغدد تظهر واضحة أو حليبي أبيض وحدود acini يمكن أن يكون من الصعب تحديد. وجود أدوات تحديد حافة أسيني بشكل أفضل، وزيادة احتمال الحصول على قياسات دقيقة الغدة مفيد لأي شخص يدرس عسل النحل التغذية.

هنا، نعرض الباحثين المهتمين كيفية تشريح ووصمة عار، الصورة، وقياس الغدد هيبوفارينجيل حتى يمكن تحقيق قياسات دقيقة لحجم أسينوس. يوفر الأسلوب يصف لنا الباحثين طريقة سهلة ودقيقة وقابلة للتكرار لتحقيق متعددة الغدة القياسات في فترة قصيرة نسبيا من الزمن بمجرد المجرب يمارس بما فيه الكفاية. واحد يمكن قياس ثقة في الغدد لما يقرب من 10 أفراد في أكثر من ساعة. ونحن نقدم تفاصيل حول كل أسلوب والمواد اللازمة للحصول على هذه القياسات. أهم جوانب من الأساليب المذكورة أدناه هي تشريح سليم وتلطيخ الغدد. على الرغم من أننا التقاط الصور المكبرة وقياس acini مع البرمجيات التجارية، يمكن بسهولة أن الأساليب التي نقدم تكييف مناهج أخرى18.

Protocol

1-تشريح وتلطيخ في الغدد هيبوفارينجيل من العاملين في مجال التمريض

  1. جعل لوحة تشريح شمع بذوبان الشمع باردة الإعداد إلى الصغيرة (60 ملم × 15 ملم) أو الزجاج الكبيرة (100 ملم × 15 ملم) طبق بيتري. بارد الشمع تماما قبل استخدام اللوحة لتشريح.
  2. لكل نحلة إلى معالجتها، وإعداد 20 ميليلتر من 01:20 يعمل الحل جيمسا (01:20 v/v من إعداد جيمسا وصمة عار في مخزنة الفوسفات المالحة (برنامج تلفزيوني: 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل، 10 مم نا2هبو4، 1.8 مم خ2ص4)).
    تنبيه: وصمة عار جيمسى تحتوي على الميثانول وهو قابل للاشتعال. أنها سامة إذا ابتلعت، استنشاق، أو إذا كان الأمر في اتصال مع الجلد. فإنه ينبغي التخلص من وفقا لمتطلبات المؤسسة المحلية.
    ملاحظة: دائماً جعل حل عمل جديدة فقط للدفعة الحالية من العينات لأنه وصمة عار Giemsa يتحلل بسرعة مرة واحدة هي تضعف. تجاهل وصمة عار المخفف إذا لم يطور متسرعا.
  3. بيبيت 20 ميليلتر Giemsa وصمة عار في آبار الشرائح مجهر و 50 – 100 ميليلتر الملحية على شريحة المتاخمة للبئر.
  4. فصل الرأس من نحلة، استخدام المقص الصغير-الربيع 10 ملم، وتضمين الجهة الأمامية الرأس يصل إلى لوحة تشريح الشمع باستخدام الملقط وقلم نحت الشمع. دبوس الرأس في لوحة الشمع للاستقرار إضافية عن طريق إدراج دبابيس في العيون، وواحدة في الفم.
  5. باستخدام شفرة حلاقة حادة قابلة لكسر ثابتة في القبضة دبوس، جعل صغيرة (~ 2-3 مم) شق بين العينين ومانديبليس على كل جانب من لوحة الوجه. بلطف تشغيل المقص الصغير تحت صفيحة الوجه وقطع العصب باللوامس الذي يمتد بين الهوائيات والدماغ.
  6. استخدام الملقط غرامة، الاستيلاء على لوحة الوجه بالفم وتصل الوجه ودبوس للوحة الشمع مع الملقط نقطة غرامة ورقم pin. إذا لزم الأمر، قم بإزالة لوحة الوجه تماما.
  7. فتح بيبيت ميليلتر 20 برنامج تلفزيوني على القص مقطع الرأس.
    ملاحظة: الغدد قد تعدت حتى عند هذه النقطة، أو أحد يجب البحث عنها. تبدو وكأنها سلسلة من اللؤلؤ الغدد وتقع أعلى الدماغ في حالة سليمة.
  8. استخدام الملقط نقطة السوبر غرامة بلطف إزالة إحدى الغدد هيبوفارينجيل (الغدة قد كسر، التي تتطلب إزالتها في شرائح)، ونقل فورا الغدة Giemsa وصمة عار على شريحة مجهرية.
  9. السماح للغدة لاحتضان في حل جيمسى لمدة 5 دقائق، وثم استخدم الملقط لنقل الغدة إلى تجمع المياه المالحة على الشريحة نفسها. إذا لزم الأمر، قطع الغدة إلى أجزاء أصغر مع المقص الصغير.
    ملاحظة: وهذا يساعد على جعل الغدد تكمن في طائرة تملق، مما يجعل من الأسهل للحصول على صور واضحة من أسيني الغدة.

2-قياس هيبوفارينجيل "الغدة أسيني"

  1. قم بتشغيل المجهر وافتح برنامج القياس. قم بتشغيل مصدر الضوء للمجهر إذا لم يتم بالفعل على. تعيين التكبير المجهر إلى 10 X.
  2. العثور على الغدد وتركيز الصورة المكبرة في العدسة، دون الكمبيوتر. قم بزيادة التكبير إلى X 60 – 80 وتركز الصورة في العدسة.
  3. ضمن علامة التبويب 'الحصول على' ضبط والتركيز في الغدد على الصورة الحية على جهاز الكمبيوتر.
  4. اكتب وصف الاسم/عينة الصورة في المربع '"اسم الصورة"' وانقر فوق '"اكتساب صورة"' التقاط صورة الغدد لمزيد من القياسات.
  5. حدد علامة التبويب 'تحليل' تحديد 'منطقة أداة' (الضوء في "تكميلية الشكل" 1A) وإلغاء تحديد 'قيمة' تحت 'عرض تسميات'، الذي سيتم أيضا إلغاء تحديد 'الوحدة'. تعيين كافة الإعدادات الأخرى إلى الافتراضي ("تكميلية الشكل" 1A).
    ملاحظة: معايرة البرنامج تلقائياً قياسات المجال وفقا لمستوى التكبير حيث أن المنطقة التي تم الحصول عليها من تكبير أقل هي نفسها التي تم الحصول عليها من تكبير أعلى.
  6. قياس كل أسينوس باستمرار النقر أو الضغط باستمرار زر الماوس الأيسر باستمرار أثناء تتبع محيط acinus بعناية ممكنة. قياس أسيني على الأقل 10 كل النحل.
    ملاحظة: أكثر وقد يلزم اعتماداً على التجربة (انظر المناقشة). قد يتطلب الأمر عدة صور/مقاطع الغدة لإيجاد ما يكفي أسيني واضحة وموجهة بشكل صحيح للقياس.
  7. مرة واحدة وقد تم قياس كل من أسيني من صورة واحدة، حدد 'إنشاء تقرير'. تأكد من أن الخيارات المحددة كما هو موضح في "الشكل تكميلية" 1B ، وانقر فوق 'تصدير'.
  8. حفظ التقرير كما هو مطلوب. إذا تم بالفعل إنشاء ملف لمجموعة العينات ويتم إضافة قياسات إضافية، تأكد من أن ملف التقرير ليس مفتوحة حتى أن تتم إضافة البيانات الجديدة إلى ملف موجود.
  9. عند الانتهاء، قم بإيقاف تشغيل الكاميرا مجهر ومصدر الضوء. مسح السائل والغدد قبالة الشرائح المجهرية والتخلص الأمن من أي المواد المستخدمة. شطف الشرائح مع الماء المقطر ويمسح نظيفة مع الإيثانول (70% v/v في الماء) لإعادة استخدامها.

النتائج

الغدد هيبوفارينجيل تم تشريح من العاملين في مجال التمريض وتصور مع أو بدون وصمة عار في 60 – 80 X التكبير (الشكل 1). في الأنسجة أونستينيد، من الصعب إيجاد التباين المناسب تماما التركيز وتحديد حواف أسيني. في النسيج الملون، حواف أسيني حادة بسبب التباين محسنة بين ال...

Discussion

حجم الغدة هيبوفارينجيل حساسة لكمية البروتين وحبوب اللقاح في النظام الغذائي وعلامة حاسمة للتغذية في النحل البالغين الشباب. هنا، علينا أن نظهر بطريقة غير مكلفة واستنساخه تشريح وقياس هذا النسيج. يمكن أن يكون من الصعب على تشريح هذه الأنسجة، ولكن مع الممارسة، يمكنك الحصول على تشريح أنظف متزا?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

هذا العمل كان تدعمها أموال داخلية من وزارة الزراعة-جمعية الإغاثة اﻷرمنية (رقم المشروع: 2022-21000-017-00-د). تم أرس/وزارة الزراعة أساس تكافؤ الفرص وموفر.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cool setting waxGrobet USA21.450
Glass petri dish, smallVWR89000-310
Glass petri dish, largeVWR89000-314
Super Max Wax PenEurotoolPEN-520.00
Breakable razor bladesElectron Microscopy Sciences72004
pin viseBioQuip4845
2A-SA flat/rounded tip forcepsRubis/BioQuip4522
Fine point forcepsRubis/BioQuip4523
5A-SA super fine point forcepsRubis/BioQuip4525
10 mm micro spring scissorsBioQuip4715
3 mm micro spring Vannas scissorsRobozRS-5610
Glass Depression Slides, Single CavityGSC International4-13057-DZ-12
PBS tabletsVWR97062-730
Giemsa stain, modified solutionSigma Aldrich32884
Insect pinsENTO SPHINX S.R.O.02.02
Leica Applications Suite measurement softwareLeica Microsystemsany measurement software, including free software, can be used

References

  1. Kulhanek, K., et al. A national survey of managed honey bee 2015-2016 annual colony losses in the USA. Journal of Apicultural Research. 56 (4), 328-340 (2017).
  2. Jacques, A., et al. A pan-European epidemiological study reveals honey bee colony survival depends on beekeeper education and disease control. PLoS One. 12 (3), e0172591 (2017).
  3. Zee, R. v. d., et al. Results of international standardised beekeeper surveys of colony losses for winter 2012-2013: analysis of winter loss rates and mixed effects modelling of risk factors for winter loss. Journal of Apicultural Research. 53 (1), 19-34 (2014).
  4. Decourtye, A., Mader, E., Desneux, N. Landscape enhancement of floral resources for honey bees in agro-ecosystems. Apidologie. 41 (3), 264-277 (2010).
  5. Vaudo, A. D., Tooker, J. F., Grozinger, C. M., Patch, H. M. Bee nutrition and floral resource restoration. Current Opinion in Insect Science. 10, 133-141 (2015).
  6. Snodgrass, R. E. . Anatomy of the Honey Bee. , (1984).
  7. Winston, M. L. . The Biology of the Honey Bee. , (1987).
  8. Johnson, B. R. Division of labor in honeybees: form, function, and proximate mechanisms. Behavioral Ecology and Sociobiology. 64 (3), 305-316 (2010).
  9. Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1989).
  10. Pernal, S. F., Currie, R. W. Pollen quality of fresh and 1-year-old single pollen diets for worker honey bees (Apis mellifera L). Apidologie. 31 (3), 387-409 (2000).
  11. DeGrandi-Hoffman, G., Chen, Y., Huang, E., Huang, M. H. The effect of diet on protein concentration, hypopharyngeal gland development and virus load in worker honey bees (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 56 (9), 1184-1191 (2010).
  12. Corby-Harris, V., Snyder, L., Meador, C., Ayotte, T. Honey bee (Apis mellifera) nurses do not consume pollens based on their nutritional quality. PLoS One. 13 (1), e0191050 (2018).
  13. Corby-Harris, V., et al. Transcriptional, translational, and physiological signatures of undernourished honey bees (Apis mellifera) suggest a role for hormonal factors in hypopharyngeal gland degradation. Journal of Insect Physiology. 85, 65-75 (2016).
  14. Corby-Harris, V., Jones, B. M., Walton, A., Schwan, M. R., Anderson, K. E. Transcriptional markers of sub-optimal nutrition in developing Apis mellifera nurse workers. BMC Genomics. 15, 134 (2014).
  15. Sagili, R. R., Pankiw, T., Zhu-Salzman, K. Effects of soybean trypsin inhibitor on hypopharyngeal gland protein content, total midgut protease activity and survival of the honey bee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 51 (9), 953-957 (2005).
  16. Sagili, R. R., Pankiw, T. Effects of protein-constrained brood food on honey bee (Apis mellifera L.) pollen foraging and colony growth. Behavioral Ecology and Sociobiology. 61 (9), 1471-1478 (2007).
  17. Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671 (2012).
  19. Jack, C. J., Uppala, S. S., Lucas, H. M., Sagili, R. R. Effects of pollen dilution on infection of Nosema ceranae in honey bees. Journal of Insect Physiology. 87, 12-19 (2016).
  20. Crailsheim, K. The protein balance of the honey bee worker. Apidologie. 21, 417-429 (1990).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

139 Apis mellifera acini

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved