Измерения гортаноглотки железы Ацинус размера медоносной пчелы (Apis mellifera) рабочих

Резюме

Гортаноглотки железы Ацинус размер является надежной мерой медсестра мед пчелы питания. Здесь мы предоставляем подробный протокол для рассечения, окрашивание, изображений и измерение медсестра пчел гортаноглотки железы Ацинусы.

Аннотация

Медсестра гортаноглотки железы производят белковые фракции работника и маточное молочко, которое подается для развивающихся личинок и королев. Эти парные железы, которые находятся в голове пчелы очень чувствительны к количество и качество пыльцы и пыльцы заменяет, что медсестра пчела потребляет. Желез уменьшаются, когда медсестры кормят недостаточно диеты и велики, когда они кормили полной диеты. Потому, что медсестра гортаноглотки железы размер является надежным показателем медсестра питания, важно, что тех, кто обучается мед пчелы питания знают как измерить эти железы. Здесь мы предоставляем подробные методы для рассечения, окрашивание, изображений и измерение медсестра пчел гортаноглотки желез. Мы представляем сравнения окрашенных и неокрашенных ткани и данных, которые использовались для изучения влияния пыльцы на размер железы. Этот метод был использован для тестирования как диета влияет на размер гортаноглотки железы, но имеет дальнейшего использования для понимания роли этих желез в улье здоровья.

Введение

Медоносных пчел имеют важное значение для сельского хозяйства, потому что они опыляют различных культур, которые потребляются людьми и животными. Большое внимание было уделено сокращение популяций пчел мед как колонии потери парить около 30-40% каждый год в Соединенных Штатах¹ и 10 – 15%, в Европе^2,3. Несколько факторов, включая сокращение доступа к высокому качеству корма, вероятно, действовать сообща в целях негативно сказаться на здоровье пчел мед. Монокультуры, засуха, неустойчивых пчеловодства практики и других факторов уменьшение разнообразия и количества природных пыльца для колоний^4,5. Потому, что пчелы получают почти все их пищевых белков и липидов из пыльцы, сокращение доступа к пыльцы может серьезно ограничить здоровья личности и колонии.

Гортаноглотки железы являются секреторной структур, расположенных в голове пчелы между глаз и мозга⁶. При нормальных обстоятельствах траекторию развития и функциональных желез зеркало, что пчелы, когда они находятся в. В возрасте примерно дней 5 – 10 пчела выполняет кормящих поведения в улье. В это же время гортаноглотки железы достигают их пикового размера и секреторную потенциала, производить крупные белковые фракции пищу расплода или желе, кормили развивающихся личинок и других взрослых, такие, как королева. На этот пик размер желез напоминают гроздь винограда, где каждый виноград является дискретной доли структуры, известной как Ацинус (во множественном числе: ацинусов). Как пчела рабочих возрастов и принимает различные задачи в улье, гортаноглотки желез сокращаться и брать на себя различные функции, как разрушение сахара в нектар^7,,⁸. Гортаноглотки желез таким образом коррелирует с возрастом пчелы и их возраста связанные задачи.

Медсестра гортаноглотки железы размер чувствителен к количеству и качеству белка в их диета^9,10,11. Когда медсестра пчел хорошо питаться, их желез являются большими. В то время как желез являются небольшими когда пчела лишен пыльцы, особенно в первую неделю взрослых развития. Чтобы определить состояние питания медсестра пчел, исследователи обычно измеряют гортаноглотки желез, либо непосредственно измерения железы Ацинус размер^11,12,,1314 или белка содержание^15,16 или путем измерения протеин содержание¹¹ или свежие вес¹⁷ всю голову, где они расположены. Каждый метод имеет свои плюсы и минусы. Мы предпочитаем резолюции, полученные от измерения железы ацинусов, хотя этот метод может быть сложным в два основных пути. Первая задача – правильно идентифицировать и анализировать железы. Второй является получение точное измерение каждого Ацинус. Под микроскопом рассечения света железы появляются четкие или молочно белый и границы Ацинусы может быть трудно определить. Имея инструменты лучше определить края ацинусов и увеличить вероятность получения точных железы измерения выгодно кому изучать питание мед пчелы.

Здесь мы показать заинтересованным исследователям как вскрыть, пятно, изображения и измерить гортаноглотки желез, так что точных измерений Ацинус размера может быть достигнуто. Метод, который мы описываем предлагает исследователям легко, точные и воспроизводимые метод для достижения нескольких измерений железы в относительно короткий период времени после того, как экспериментатор практикуется достаточно. Один уверенно можно измерить желез почти 10 лиц в чуть более часа. Мы предлагаем детали на как метода, так и материалы, необходимые для получения этих измерений. Самые важные аспекты методов, описанных ниже, надлежащего вскрытия и пятнать желез. Хотя мы захватить увеличенного изображения и измерить Ацинусы с коммерческим программным обеспечением, методы, которые мы представляем может быть легко адаптирована для других платформ¹⁸.

протокол

1. разбор и пятнать гортаноглотки желез от медсестра рабочих

1. Сделайте плиты рассечение воск плавления воска прохладно параметр в малых (60 x 15 мм) или больших (100 x 15 мм) стекла Петри. Воск полностью остыть перед использованием пластины для вскрытия.
2. Для каждой пчелы для обработки, подготовить 20 мкл рабочего раствора Гимзы 1:20 (1:20 v/v подготовленных Гимзе в фосфат амортизированное saline (PBS: 137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10 мм Na₂HPO₄, 1.8 мм х₂PO₄)).
   Предупреждение: Гимзе содержит метанола и является легковоспламеняемым. Он токсичен при проглатывании и вдыхании, или если она приходит в контакт с кожей. Она должна удаляться согласно требованиям местные учреждения.
   Примечание: Всегда сделайте свежий рабочий раствор только для текущего пакета образцов, потому что Гимзе быстро снижается после того, как она растворяется. Если осадок развивается отказаться от разбавленных пятно.
3. Накапайте 20 мкл Гимзе в скважины Микроскоп слайды и 50 – 100 мкл saline на слайд, прилегающих к колодцу.
4. Снимите головку с пчелой, используя ножницы микро Весна 10 мм и вставлять голову лицевой стороне вверх воск рассечение пластину с помощью щипцов и воск резьба пера. Придавить голову в пластину воск для дополнительной стабильности, вставив ПИН в глаза и в рот.
5. Использование резкого бьющихся лезвием бритвы фиксированной в тиски PIN-код, сделать небольшой (~ 2-3 мм) разрез между глазами и мандибулы на каждой стороне лицевой панели. Осторожно запустить микро ножницы под лицевой и вырезать усиков нерв, который проходит между антеннами и мозг.
6. С помощью тонкой щипцы, захватить лицевой рот, переверните его вверх, и закрепите его на пластину воск с тонкой точке щипцы и ПИН-код. При необходимости полностью удалите пластину лицо.
7. Накапайте 20 мкл PBS на срезе открыть раздел головы.
   Примечание: Желез может плавать вверх на данный момент, или один должны искать их. Желез выглядят как нитка жемчуга и расположены на верхней части мозга, если нетронутыми.
8. Используйте супер тонкой точке щипцами осторожно удалить одну из гортаноглотки железы (железы может сломаться, требуя его будут удалены в сегментах) и немедленно передать железы Гимзе на слайде микроскопии.
9. Разрешить железы для инкубации в раствор Гимза 5 минут, а затем использовать щипцы для передачи в железе в пул физиологического раствора на тот же слайд. При необходимости, сократить железы на более мелкие куски с микро ножницами.
   Примечание: Это помогает сделать железы лежат в плоскости льстить, что облегчает для получения четких изображений Ацинусы железы.

2. Измерение гортаноглотки Ацинусы железы

1. Включите микроскопом и открыть программу измерений. Включите источник света для микроскопа, если это уже не на. Набор микроскоп увеличением до 10 X.
2. Найдите желез и сосредоточиться увеличенное изображение в окуляр, без компьютера. Увеличить масштаб до 60-80 X и резкость изображения в окуляр.
3. На вкладке «получить» корректировать и сосредоточиться желез на живой изображения на компьютере.
4. Введите описание имя/образец изображения в поле «Имя образа» и нажмите «Приобрести изображение» принимать изображение желез для дальнейших измерений.
5. Выберите вкладку «Анализа» выберите «области инструмента (выделены Дополнительные рис. 1A) и снимите флажок «значение» в разделе «Отображать метки», который будет также отменить «блок». Установите все остальные настройки по умолчанию (Дополнительные рис. 1A).
   Примечание: Программное обеспечение автоматически калибрует области измерений согласно уровень увеличения, так, что площадь, полученные из нижней увеличение же, что полученные с большим увеличением.
6. Измерьте каждый Ацинус, постоянно нажимая или непрерывно удерживая нажатой левую кнопку мыши во время трассировки Ацинус периметру так же тщательно, как можно скорее. Измерения по меньшей мере 10 Ацинусы на пчел.
   Примечание: Более может потребоваться в зависимости от эксперимент (см. обсуждение). Это может потребовать несколько изображений/секций железы найти достаточно четко, правильно ориентированные Ацинусы для измерения.
7. После того, как были измерены все Ацинусы с одного изображения, выберите «Создать отчет». Убедитесь, что параметры выбраны, как показано в дополнительном Рисунок 1B и нажмите кнопку «Экспорт».
8. Сохраните отчет как желаемого. Если файл уже был создан для набора образцов и добавляются дополнительные измерения, убедитесь, что файл отчета не открыт, так что новые данные будут добавлены в существующий файл.
9. Закончив, выключите камеры микроскопа и источник света. Протрите жидкости и желез у микроскопии слайды и безопасно распоряжаться любой используемый материал. Промойте слайды с дистиллированной водой и протрите этанола (70% v/v в воде) для повторного использования.

Результаты

Гортаноглотки железы были расчленены от медсестра рабочих и визуализированы с и без пятен на 60-80 X увеличением (рис. 1). В неокрашенных ткани трудно найти надлежащий контраст полностью сосредоточиться и определить края Ацинусы. В окрашенные ткани края А?...

Обсуждение

Гортаноглотки железы размер чувствителен к количество белков и пыльцы в рационе питания и критических маркер питания в молодых взрослых пчел. Здесь мы демонстрируем недорогой и воспроизводимые способ вскрыть и измерения этой ткани. Эти ткани может быть трудно анализировать, но с прак?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cool setting wax	Grobet USA	21.450
Glass petri dish, small	VWR	89000-310
Glass petri dish, large	VWR	89000-314
Super Max Wax Pen	Eurotool	PEN-520.00
Breakable razor blades	Electron Microscopy Sciences	72004
pin vise	BioQuip	4845
2A-SA flat/rounded tip forceps	Rubis/BioQuip	4522
Fine point forceps	Rubis/BioQuip	4523
5A-SA super fine point forceps	Rubis/BioQuip	4525
10 mm micro spring scissors	BioQuip	4715
3 mm micro spring Vannas scissors	Roboz	RS-5610
Glass Depression Slides, Single Cavity	GSC International	4-13057-DZ-12
PBS tablets	VWR	97062-730
Giemsa stain, modified solution	Sigma Aldrich	32884
Insect pins	ENTO SPHINX S.R.O.	02.02
Leica Applications Suite measurement software	Leica Microsystems		any measurement software, including free software, can be used