蜂蜜蜂 (api 蜜蜂) 中下咽腺性腺泡大小的测定

摘要

下咽腺性腺泡大小是护理蜂蜜蜂营养的有力措施。在这里, 我们提供了一个详细的协议解剖, 染色, 成像和测量护士蜂下咽腺腺泡细胞。

摘要

护士下咽腺体产生的蛋白质分数的工人和蜂王浆, 是喂养发展幼虫和皇后。这些位于蜂头的配对腺体对护士蜂所消耗的花粉和花粉替代品的数量和质量非常敏感。当护士喂养不足的饮食时, 腺体变得更小, 当他们喂养完完全的饮食时就会变大。由于护士下咽腺大小是护士营养的有力指标, 研究蜂蜜蜂营养的人知道如何测量这些腺体至关重要。在这里, 我们提供详细的方法, 解剖, 染色, 成像, 并测量护士蜂下咽腺。我们现在比较无瑕和染色组织和数据, 用于研究花粉对腺体大小的影响。该方法已被用来测试饮食如何影响下咽腺大小, 但进一步使用, 以了解这些腺体在蜂巢健康的作用。

引言

蜂蜜蜜蜂对农业是必不可少的, 因为它们授粉了人类和动物所消耗的各种农作物。蜜蜂种群数量的下降引起了人们的广泛关注, 因为殖民地的损失每年在美国的30-40% 左右徘徊在¹和欧洲的 10–15%^2,3。多种因素, 包括减少获得高质量的饲料, 可能会一起行动, 对蜂蜜蜜蜂的健康产生负面影响。单一、干旱、不可持续的养蜂做法以及其他因素减少了^4、5殖民地的天然花粉的多样性和数量。由于蜂蜜蜜蜂几乎从花粉中获得所有的膳食蛋白质和脂质, 因此减少花粉的摄入会严重限制个体和群体的健康。

下咽腺是位于蜜蜂头部之间的分泌结构, 介于眼睛和大脑之间⁶。在正常情况下, 腺体的发育和功能轨迹反映出它们所在的蜂。在大约5–10天的时候, 蜜蜂在蜂巢中执行护理行为。同时, 下咽腺体达到其峰值大小和分泌能力, 产生的主要蛋白质分数的育雏食品或果冻喂养发展幼虫和其他成人, 如皇后。在这个峰值的大小腺体类似一串葡萄, 其中每一个葡萄是一个离散的叶结构称为性腺泡 (复数: 腺泡细胞)。当工作者蜂年龄和承担不同的任务在蜂巢, 下咽腺收缩并且采取不同的作用, 象分解糖在花蜜^7,8。因此, 下咽腺与蜜蜂的年龄及其与年龄相关的任务相关。

护士下咽腺大小是敏感的数量和质量的蛋白质在他们的饮食^9,10,11。当护士蜜蜂营养良好, 他们的腺体很大。然而, 当蜜蜂被剥夺花粉时, 腺体很小, 特别是在成人发育的第一周。为了确定护士蜂的营养状况, 研究人员通常测量下咽腺体, 无论是直接测量腺体性腺泡大小^11,12,13,14或蛋白质含量^15,16或通过测量蛋白质含量¹¹或新鲜重量¹⁷的整个头部, 他们的位置。每个方法都有其优缺点。我们更喜欢从测量腺体腺泡细胞获得的分辨率, 尽管这种方法有两种主要的挑战。第一个挑战是正确识别和解剖腺体。第二个是对每个性腺泡的精确测量。在解剖光显微镜下, 腺体看起来清晰或乳白色, 腺泡细胞的边界很难定义。有工具, 以更好地定义腺泡细胞的边缘, 并增加获得准确的腺体测量的可能性, 有利于任何研究蜂蜜蜜蜂营养。

在这里, 我们向感兴趣的研究人员展示如何解剖, 染色, 图像和测量咽腺, 以便准确测量性腺泡大小可以达到。我们描述的方法为研究人员提供了一种简单、准确和可复制的方法, 在实验者充分练习后, 在相对较短的时间内实现多腺体测量。在短短一个多小时内, 人们可以自信地测量近10人的腺体。我们提供了获得这些测量所需的方法和材料的详细信息。下面概述的方法最重要的方面是正确的解剖和染色腺体。虽然我们捕获的放大图像和测量腺泡细胞与商业软件, 我们目前的方法可以很容易地适应其他平台¹⁸。

研究方案

1. 从护士工作者身上解剖和染色下咽腺

1. 通过熔化冷却设置蜡成一个小 (60 毫米 x 15 毫米) 或大 (100 毫米 x 15 毫米) 玻璃培养皿制成蜡夹层板。在使用钢板进行解剖前, 完全冷却蜡。
2. 要处理的每只蜜蜂, 准备20µL 1:20 工作姬姆萨溶液 (1:20 伏/五的磷酸盐缓冲盐水 (PBS: 137 毫米氯化钠, 2.7 毫米氯化钾, 10 毫米 Na₂HPO₄, 1.8 毫米, 2 PO₄).
   注意: 姬姆萨染色含有甲醇, 易燃。它是有毒的, 如果吞下, 吸入, 或如果它接触到皮肤。应根据当地机构的要求处理。
   注: 始终为当前批次的样品做一个新的工作解决方案, 因为姬姆萨染色一旦稀释, 很快就会降解。如果沉淀物发育, 就丢弃稀释的污渍。
3. 吸管20µL 姬姆萨在显微镜滑梯的水井中着色, 50–100µL 盐水贴在井旁的滑梯上。
4. 用10毫米的微弹簧剪刀将头从蜜蜂中分离出来, 用镊子和蜡雕笔将头前侧嵌入蜡夹层板中。将头部钉在蜡板中, 通过在眼睛和嘴中插入针脚来增加稳定性。
5. 使用锋利的易碎剃刀刀片固定在一个别针钳, 做一个小 (~ 2–3毫米) 切口之间的眼睛和下颚两侧的脸板。轻轻地在面板下运行微剪刀, 并切断在触角和大脑之间运行的触角神经。
6. 使用精钳, 抓住嘴上的面板, 翻转它, 并把它钉在蜡板与细点钳和别针。如有需要, 完全取下面板。
7. 吸管20µL PBS 上的切口开放部分的头部。
   注: 此时腺体可能浮起来, 或者必须搜索它们。腺体看起来像一串珍珠, 并位于大脑的顶端, 如果完好无损。
8. 使用超细点钳轻轻移除其中的下咽腺体 (腺体可能会折断, 要求它被删除的片段), 并立即转移腺体到姬姆萨染色显微镜幻灯片。
9. 允许腺体在姬姆萨溶液中孵化5分钟, 然后用镊子将腺体转移到同一张幻灯片上的盐水池中。如果需要, 用微剪刀把腺体切成小块。
   注意: 这有助于使腺体位于平坦的平面上, 从而更容易获得腺体腺泡细胞的清晰图像。

2. 测量下咽腺腺泡细胞

1. 打开显微镜, 开启测量程序。打开显微镜的光源, 如果它尚未打开。将显微镜放大倍数设置为10X。
2. 找到腺体, 聚焦放大的图像在目镜, 没有计算机。增大放大倍数以 60–80X, 并将图像聚焦在目镜中。
3. 在 "获取" 标签下, 调整并聚焦计算机上的实时图像上的腺体。
4. 在 "图像名称" 框中键入图像名称/样本描述, 然后单击 "获取图像" 以获取腺体的图像以进行进一步测量。
5. 选择 "分析" 选项卡. 选择 "区域工具" (在补充图 1A中突出显示), 并取消选中 "显示标签" 下的 "值", 这也将取消选中 "单位"。将所有其他设置设置为默认值 (补充图 1A)。
   注意: 软件根据放大倍数自动校准区域测量, 以便从较低的放大倍数获得的面积与从更高的放大倍数获得的区域相同。
6. 通过连续单击或连续按住鼠标左键来测量每个性腺泡, 同时尽可能仔细地跟踪性腺泡周长。每只蜜蜂测量至少10腺泡细胞。
   注: 可能需要更多的根据实验 (见讨论)。它可能需要多个图像/部分的腺体, 以找到足够清晰, 正确的定向腺泡细胞测量。
7. 一旦测量了单个图像中的所有腺泡细胞, 请选择 "创建报告"。确保选择的选项如补充图 1B所示, 然后单击 "导出"。
8. 按需要保存报表。如果已为示例集创建了文件, 并且正在添加其他度量值, 请确保报表文件未打开, 以便将新数据添加到现有文件中。
9. 完成后, 关闭显微镜摄像机和光源。擦拭显微镜下的液体和腺体, 并安全地处理任何使用过的材料。用蒸馏水冲洗滑梯, 用乙醇 (70% 伏/v) 擦拭干净以供重复使用。

结果

从护士工作者身上解剖咽喉腺, 并在60–80X 放大 (图 1) 上可视化并无染色。在无瑕组织中, 很难找到合适的对比度来充分聚焦和定义腺泡细胞的边缘。在染色的组织中, 腺泡细胞的边缘是尖锐的, 因为染色组织和白色背景的对比度有所改善。

讨论

下咽腺大小对饮食中的蛋白质和花粉量敏感, 是幼蜂营养的重要标志。在这里, 我们展示了一种廉价和重现的方法来解剖和测量这个组织。这些组织可能很难解剖, 但随着实践, 你可以得到越来越干净的解剖与组织相对完好。这里提出的方法的主要优点是, 组织染色, 使研究者能够清楚地可视化每个腺体性腺泡的边界。如果没有污点, 这些腺泡细胞的边界很难想象和聚焦在显微镜下, 从而降低了研究者...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cool setting wax	Grobet USA	21.450
Glass petri dish, small	VWR	89000-310
Glass petri dish, large	VWR	89000-314
Super Max Wax Pen	Eurotool	PEN-520.00
Breakable razor blades	Electron Microscopy Sciences	72004
pin vise	BioQuip	4845
2A-SA flat/rounded tip forceps	Rubis/BioQuip	4522
Fine point forceps	Rubis/BioQuip	4523
5A-SA super fine point forceps	Rubis/BioQuip	4525
10 mm micro spring scissors	BioQuip	4715
3 mm micro spring Vannas scissors	Roboz	RS-5610
Glass Depression Slides, Single Cavity	GSC International	4-13057-DZ-12
PBS tablets	VWR	97062-730
Giemsa stain, modified solution	Sigma Aldrich	32884
Insect pins	ENTO SPHINX S.R.O.	02.02
Leica Applications Suite measurement software	Leica Microsystems		any measurement software, including free software, can be used