ミツバチ (セイヨウミツバチ) 労働者の下咽頭腺 Acinus サイズを測定

要約

下咽頭腺 acinus サイズは看護師蜂蜜蜂栄養の堅牢なメジャーです。ここでは、解離性、染色、イメージング、および看護師ミツバチの下咽頭腺房を測定詳細なプロトコルを提供します。

要約

看護師の下咽頭腺は、労働者と幼虫とクイーンズの開発にフィードバックされるローヤル ゼリーのタンパク質画分を生成します。蜂の頭の中にあるこれらの一対の腺が量に非常に敏感、花粉、花粉の品質看護婦蜂が消費します。腺は、看護師が欠乏飼料飼料度が完全なときが多いと小さくなります。看護師下咽頭腺サイズは、看護栄養の強力な指標は、これらの蜂蜜蜂栄養の勉強はこれらの腺を測定する方法を知っていることが不可欠です。ここでは、解離性、染色、イメージング、および看護師ミツバチの下咽頭腺を測定手法の詳細を提供します。無染色・ ステンド グラス組織と腺のサイズに花粉の影響を研究に使用されたデータとの比較を紹介します。このメソッドは、どのようにダイエット下咽頭腺のサイズに影響を与えますが、ハイブ健康でこれらの腺の役割を理解するためのそれ以上の使用は、テストに使用されています。

概要

彼らは様々 な人間や動物によって消費される作物を受粉するので、ミツバチは農業に不可欠です。注目されて蜂蜜のミツバチの人口の減少にコロニー損失ホバー約 30-40% として毎年アメリカ合衆国¹ヨーロッパ^2,3で 10-15%。高品質への減らされたアクセスを含む複数の要因、飼料、可能性が高い行動を共に、ミツバチの健康に悪影響を及ぼします。モノカルチャー、干ばつ、持続不可能な養蜂の実践、および他の要因は、多様性と植民地^4,5に利用可能な自然の花粉の量を減らします。蜂蜜の蜂は、花粉から彼らの食餌療法蛋白質および脂質のほとんどすべてを派生しているので花粉への減らされたアクセスは厳しく個人と植民地の健康を制限できます。

下咽頭腺は、目と脳の⁶の間に蜂の頭にある分泌型の構造です。通常の状況下で腺の発達と機能の軌道にある蜂のそれを映します。時代の約 5-10 日で蜂は、ハイブの看護動作を実行します。この同じ時に、それぞれのピーク サイズとひな食品やゼリーが幼虫や女王など他の大人を開発する供給の主要なタンパク質画分を生産、分泌能下咽頭腺に達する。このピークのサイズで腺それぞれのブドウが、acinus と呼ばれる離散葉構造をブドウの房のように (複数: 腺)。働き蜂が年齢、ハイブの別のタスクにかかる下咽頭腺が縮小し、蜜^7,8糖を打ち破るようなさまざまな機能を取る。下咽頭腺したがってミツバチとその加齢に伴うタスクの年齢と関連しています。

看護師の下咽頭腺のサイズは、そのダイエット^9,10,11タンパク質の質と量に敏感です。看護婦に蜂が栄養状態が良く、その腺が多い。腺が小さいに対し、とき大人の開発の最初の週で特にミツバチは、花粉の奪われました。看護婦の蜂の栄養の状態を決定するために研究者は通常下咽頭腺腺 acinus サイズ^11,12,13,14を直接測定することによっていずれかを測定またはタンパク質^15,16コンテンツ タンパク質を測定することによってコンテンツ¹¹または新鮮な重量¹⁷頭全体どこにあるの。各メソッドには、独自の長所と短所があります。我々 は、このメソッドは 2 つの主要な方法で挑戦することができますが、腺房の測定から得られる解像度を好みます。最初の課題は、適切に識別し腺の解剖です。2 番目が各 acinus の正確な測定を取得します。解剖顕微鏡の下で腺はクリアまたは乳白色の白を表示され、腺の境界を定義すること困難にすることができます。ツールより、房の端を定義し、腺の正確な測定値を得る可能性を高めることは、蜂蜜蜂栄養を勉強して誰にも有益です。

ここで、興味のある研究者を解剖、染色、イメージ、および acinus サイズの正確な測定を達成することができますので、下咽頭腺を測定する方法を紹介します。について述べる方法では、研究者、実験者は十分に練習したら、比較的短い期間で複数の腺の測定を達成するための簡単、正確、かつ複製可能なメソッドを提供しています。1 つは、わずか 1 時間でほぼ 10 人の腺を自信を持って測定でした。これらの測定値を得るために必要な素材と方法の両方についての詳細を提供しています。下記の方法の最も重要な側面は、適切な郭清と腺の染色です。拡大された画像をキャプチャし、商用ソフトウェアに房を測定、提案方法簡単に¹⁸他のプラットフォームに適応できます。

プロトコル

1. 解離性と看護師の労働者から下咽頭腺の染色

1. 小 (60 mm × 15 mm) または大 (100 mm × 15 mm) ガラス シャーレにクールな設定ワックスを溶かすことによってワックス剥離プレートを作る。解剖のプレートを使用する前に、ワックスを完全にクールします。
2. 各蜂を処理するには、準備、1:20 作業ギムザ ソリューションの 20 μ L (1:20 v/v の準備ギムザ染色リン酸緩衝生理食塩水 (PBS: 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM ナ₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄))。
   注意: ギムザ染色は含みメタノール可燃性です。皮膚に触れた場合、吸入飲み込んだ場合または有毒です。それは、地方機関の要件に従って処分すべき。
   注: は常にギムザ染色は急速に低下したらそれが希釈されるのでサンプルの現在のバッチのためにだけ新鮮な作業ソリューションをください。沈殿物が生じた場合は、希薄化後の染色を破棄します。
3. ピペット 20 μ L ギムザ染色顕微鏡スライドとも隣接するスライドに 50-100 μ L の生理食塩水の井戸に。
4. 蜂、10 mm のマイクロ スプリングはさみを使ってから頭を外し、鉗子とワックス彫刻ペンを使用してワックス剥離プレートをヘッドのフロント側に埋め込みます。目と口の中に 1 つのピンを挿入することによって追加の安定性のワックス板に頭をピンします。
5. ピン万力に固定、鋭い壊れやすいかみそりの刃を使用すると、小さな (~ 2-3 mm) 目とフェイス プレートのそれぞれの側の下顎骨の切開。優しくフェイス プレートの下でマイクロはさみを実行し、アンテナと脳との間を実行する触角神経をカットします。
6. 微細鉗子を使用して、口でフェイス プレートをつかむ、それをフリップ アップとピンと細かい点鉗子ワックス プレートにピン留め。必要な場合は、完全にフェイス プレートを取り外します。
7. カットにピペット 20 μ L の PBS は、頭のセクションを開きます。
   注: 腺がこの時点でフロートをまたは 1 つは、それらを検索する必要があります。腺の真珠の文字列のように見える場合はそのまま脳の上にある.
8. 優しく下咽頭腺 (腺しなくなり、セグメント内で削除するそれを必要とする) の 1 つを削除する超微細ポイント鉗子を使用し、すぐに顕微鏡のスライドにギムザ染色する腺を転送します。
9. 5 分、エオジンでインキュベートする腺を許可し、同じスライド上腺を生理食塩水のプールに転送する鉗子を使用します。必要な場合は、小さな断片に腺をマイクロのハサミで切断します。
   注: これはできるようになり、簡単に腺房の鮮明な画像を得るため、平坦な平面内腺をさせるのに役立ちます。

2. 下咽頭腺房の測定

1. 顕微鏡、測定プログラムを開きます。いない場合に、顕微鏡用光源の電源入れます。顕微鏡の倍率を 10 倍に設定します。
2. 腺を見つけるし、コンピューターなしの接眼レンズで拡大に焦点を当てます。60-80 X を拡大し、接眼レンズのイメージに焦点を当てます。
3. '取得' タブの下を調整し、腺コンピューター上のライブ イメージに焦点を当てます。
4. 'イメージ名ボックスにイメージ名/サンプルの説明、さらに測定の腺のイメージを取得する' イメージの取得 ' をクリックします。
5. '分析' タブ選択 '面積ツール' (補足図 1 aの強調表示) を選択し、'値''表示ラベル'も'ユニット' に選択を解除しまの下の選択を解除します。その他のすべての設定を既定 (補足図 1 a) に設定します。
   注: ソフトウェアの中には、低倍率から得られた領域は高倍率から得られる同じ自動的に倍率のレベルに応じて面積を調整します。
6. 継続的にクリックするか、できるだけ慎重に acinus 境界をトレースしながらマウスの左ボタンを押し続けて各 acinus を測定します。蜂あたり少なくとも 10 房を測定します。
   注: 詳細必要があります実験によって (ディスカッションを参照してください)。それは測定のため十分な明確な適切な方向の房を見つけるに腺の複数の画像/セクションを必要があります。
7. すべての単一のイメージから房を測定した、'レポートの作成」を選択します。オプション補足図 1 bに示すように、選択をエクスポート] をクリックするを確認します。
8. 必要に応じて、レポートを保存します。サンプルのセットのファイルが既に作成されていて、追加の計測が追加されているので、新しいデータは既存のファイルに追加されます、レポート ファイルが開いていないことを確認します。
9. 完了したら、顕微鏡カメラと光源をオフします。液体を拭いてくださいと腺顕微鏡スライドをオフし使用される材料を安全に破棄します。蒸留水とスライドを洗い、再利用のためエタノール (水 70 %v/v) で拭いてください。

結果

下咽頭腺はナース ワーカーから解剖され、60-80 X 倍率 (図 1) で染色と可視化します。無染色の組織に完全に焦点を当てるし、房のエッジを定義する適切なコントラストを見つけることは困難です。ステンド グラスの組織染色組織と白い背景の改良されたコントラストのため、腺管構造のエッジが鋭角で。

ディスカッション

下咽頭腺サイズはタンパク質と国会で花粉の量に敏感で、若い大人のミツバチの栄養の重要なマーカー。ここでは、分析し、この組織を測定する安価で再現性のある方法を示す.これらの組織は、解剖することは困難することができますが、練習では、相対的に無傷のティッシュでますますクリーナー解剖が取得できます。ここで紹介した方法の主な利点は、組織の染色可能各腺 acinus の境界?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cool setting wax	Grobet USA	21.450
Glass petri dish, small	VWR	89000-310
Glass petri dish, large	VWR	89000-314
Super Max Wax Pen	Eurotool	PEN-520.00
Breakable razor blades	Electron Microscopy Sciences	72004
pin vise	BioQuip	4845
2A-SA flat/rounded tip forceps	Rubis/BioQuip	4522
Fine point forceps	Rubis/BioQuip	4523
5A-SA super fine point forceps	Rubis/BioQuip	4525
10 mm micro spring scissors	BioQuip	4715
3 mm micro spring Vannas scissors	Roboz	RS-5610
Glass Depression Slides, Single Cavity	GSC International	4-13057-DZ-12
PBS tablets	VWR	97062-730
Giemsa stain, modified solution	Sigma Aldrich	32884
Insect pins	ENTO SPHINX S.R.O.	02.02
Leica Applications Suite measurement software	Leica Microsystems		any measurement software, including free software, can be used