꿀 꿀벌 (Apis mellifera) 노동자의 Hypopharyngeal 동맥 Acinus 크기 측정

요약

Hypopharyngeal 선 acinus 크기 간호사 꿀 꿀벌 영양의 강력한 척도 이다. 여기, 우리는 해 부, 얼룩, 이미징, 및 간호사 꿀벌 hypopharyngeal 선 acini 측정에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

초록

간호사 hypopharyngeal 땀 샘 작업자 및 애벌레와 퀸 즈 개발을 먹이 로얄 젤리의 단백질 분수를 생성 합니다. 꿀벌의 머리에 있는이 쌍된 샘 수량 매우 민감합니다 그리고 꽃가루와 꽃가루의 품질 대체 간호사 꿀벌 소비. 샘의 얻을 때 간호사 결핍 다이어트를 먹이 큰 때 그들은 완벽 한 다이어트를 먹이 작은. 간호사 hypopharyngeal 동맥 크기 간호사 영양의 강력한 지표 이기 때문에 그 꿀 꿀벌 영양 공부이 동맥을 측정 하는 방법을 알고 필수적 이다. 여기, 우리는 해 부, 얼룩, 이미징, 및 간호사 비 hypopharyngeal 분 비 측정에 대 한 자세한 방법을 제공 합니다. 우리는 흠 없는 스테인드 조직과 선 크기에 꽃가루의 영향을 공부 하는 데 사용 된 데이터의 비교를 제시. 이 방법은 어떻게 다이어트 hypopharyngeal 선 크기에 미치는 영향 하지만 하이브 건강에서이 동맥의 역할을 이해 하기 위한 추가 사용은 테스트에 사용 되었습니다.

서문

그들은 인간과 동물에 의해 소비 작물의 다양 한 꽃가루 때문에 꿀벌은 농업 필수품입니다. 많은 관심 지급 되었습니다 꿀 꿀벌 인구 쇠퇴에 식민지 손실 가져가 약 30-40%로 미국¹ 년 및 유럽^2,3에서 10-15%. 다 수 요인, 높은 품질에 감소 등 마 초, 꿀 꿀벌 건강에 부정적인 영향을 줄 가능성이 함께 행동. 단, 가뭄, 지속 양 봉 관행, 및 다른 요인 감소 자연 꽃가루 식민지^4,5수의 양과 다양성. 꿀벌 꽃가루에서 거의 모든 그들의 규정식 단백질과 지질을 파생, 때문에 꽃가루를 감소 액세스 심각 하 게 개인 및 식민지 상태를 제한할 수 있습니다.

Hypopharyngeal 땀 샘 분 비 구조 꿀벌의 머리는 눈과 뇌⁶사이 위치 하 고 있습니다. 정상적인 상황에서 동맥의 발달 및 기능 궤적에 있는 꿀벌의 거울. 나이의 대략 5-10 일에 꿀벌 통에 간호 동작을 수행합니다. 이 동시에 hypopharyngeal 땀 샘의 피크 크기와 가만히 음식이 나 애벌레 및 여왕 같은 다른 성인 개발 먹이 젤리의 주요 단백질 분수 생산 분 비 용량에 도달. 이 최대 크기에는 땀 샘 닮은 각 포도 개별 엽 구조는 acinus로 알려진 포도의 무리 (복수: acini). 작업자 꿀벌 세 고 하이브에 다른 작업에, hypopharyngeal 분 비 축소와 설탕 꿀^7,8에 뜨 같은 다른 기능에 걸릴. Hypopharyngeal 땀 샘은 따라서 꿀벌과 그들의 나이 관련 된 작업의 시대와 상관 된다.

간호사 hypopharyngeal 선 크기는 그들의 다이어트^9,,1011에 단백질의 품질과 수량에 민감합니다. 간호사 꿀벌 잘 영양은 때 그들의 분 비는 큽니다. 반면, 동맥은 작은 때 꿀벌은 박탈 꽃가루의 성인 개발의 첫 번째 주에 특히. 간호사 꿀벌의 영양 상태를 파악 하기 위해 연구자는 일반적으로 hypopharyngeal 동맥, 동맥 acinus 크기^11,12,,1314 를 직접 측정 하 여 측정 또는 단백질은 단백질을 측정 하 여¹¹ 콘텐츠 또는 신선한¹⁷ 그들이 있는 전체 머리의 무게^15,16 콘텐츠. 각 메서드는 그것의 자신의 찬 부 양론. 이 메서드는 두 가지 주요 방법으로 도전 될 수 있지만 선 acini 측정에서 얻은 해상도 선호 하 고. 첫 번째 과제는 제대로 파악 하 고 선 해 부입니다. 두 번째는 각 acinus의 정확한 측정을 얻는 이다. 해 빛 현미경 동맥 명확 하 고 또는 밀키 화이트 나타나고는 acini의 국경을 정의 하기 어려울 수 있습니다. 도구가 더 나은 acini의 가장자리를 정의 하 고 정확한 선 측정을 얻기의 가능성을 증가 꿀 꿀벌 영양 공부 하는 사람에 게 도움이 됩니다.

여기, 우리가 관심이 연구원은 해 부, 얼룩, 이미지, acinus 크기의 정확한 측정을 얻을 수 있도록 hypopharyngeal 동맥을 측정 하는 방법을 보여줍니다. 우리가 설명 하는 방법에서 일단 고 실험은 충분히 연습 시간의 상대적으로 짧은 기간에 여러 선 측정을 달성 하기 위한 쉽게, 정확 하 고 복제할 방법을 연구를 제공 합니다. 하나 자신 있게 한 시간에 거의 10 개인의 분 비를 측정할 수 있습니다. 우리는 방법 및 재료이 측정을 얻는 데 필요한 정보를 제공 합니다. 아래에 설명 된 방법 중 가장 중요 한 측면은 적절 한 해 부와 땀 샘의 얼룩 있습니다. 비록 우리가 확대 이미지 캡처하고 acini 상용 소프트웨어와 측정, 우리가 제시 하는 방법을 쉽게 다른 플랫폼¹⁸에 적용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 해 부하 고 간호사 노동자에서 Hypopharyngeal 땀 얼룩

1. 작은 (60 m m x 15 m m) 또는 대형 (100 m m x 15 m m) 유리 페 트리 접시에 멋진 설정 왁 스를 용 해 하 여 왁 스 해 부 접시를 확인 합니다. 해에 대 한 접시를 사용 하기 전에 왁 스를 완전히 냉각 하십시오.
2. 처리에 각 벌 준비 Giemsa 솔루션 작업 1시 20분의 20 µ L (1: 20의 v/v 준비 인산 염 버퍼 식 염 수에 Giemsa 얼룩 (PBS: 137 m NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나₂HPO₄, 1.8 m m KH₂포₄m)).
   주의: Giemsa 얼룩 메탄올을 포함 하 고 가연성 이다. 그것은 삼, 흡입, 또는 그것은 피부와 접촉할 경우에 독성입니다. 그것은의 지역 기관의 요구에 따라 처분 한다.
   참고: 항상 Giemsa 얼룩 빠르게 희석은 일단 저하 하기 때문에 그냥 샘플의 현재 일괄 처리에 대 한 신선한 작업 솔루션을 확인 합니다. 침전 물은 개발 하는 경우 희석된 얼룩을 삭제 합니다.
3. 현미경 슬라이드와 슬라이드 우물에 인접 한에 50-100 µ L 염 분의 우물에 피펫으로 20 µ L Giemsa 얼룩.
4. 10 m m 마이크로 봄이 위를 사용 하 여, 꿀벌에서 머리를 분리 하 고 집게와 왁 스 조각 펜을 사용 하 여 왁 스 해 부 격판덮개로 머리 전면을 포함. 눈과 입에 하나에 핀을 삽입 하 여 추가 안정성을 위한 왁 스 격판덮개로 머리 핀.
5. 작은 게 핀 바이스로 고정 날카로운 깨뜨릴 면도날을 사용 하 여 (~ 2-3 m m) 눈과 얼굴 격판덮개의 각 측에 mandibles 사이 절 개. 부드럽게 얼굴 플레이트 아래 마이크로 위를 실행 하 고 안테나와 뇌 사이 더듬이 신경 절단.
6. 미세 집게를 사용 하 여 입으로 얼굴 플레이트를 잡아, 그것을 뒤집어 고 좋은 포인트 집게와 핀 왁 스 플레이트에 고정. 필요한 경우 완전히 얼굴 플레이트를 제거 합니다.
7. 피펫으로 20 µ L PBS 컷에는 머리의 섹션을 엽니다.
   참고: 분 비 수 있습니다 플 로트를 시점에서 또는 한 그들을 위해 검색 해야 합니다. 샘의 진주의 문자열 처럼 모양과 경우 그대로 뇌 위에 있습니다.
8. 슈퍼 괜 찮 포인트 집게를 사용 하 여 부드럽게 hypopharyngeal 동맥 (동맥 수 있습니다 휴식, 세그먼트에 제거 요구), 중 하나를 제거 하 고 즉시 현미경 슬라이드에 선 Giemsa 얼룩에 전송.
9. 5 분, Giemsa 솔루션에 품 어에 선 허용 하 고 집게를 사용 하 여 동일한 슬라이드에 선 염 분의 풀에 전송. 필요한 경우, 마이크로 위 선 더 작은 조각으로 잘라.
   참고:이 동맥에 따라서 선 acini의 투명 한 이미지를 쉽게 아첨 비행기를 만들 수 있습니다.

2. 측정 hypopharyngeal 선 Acini

1. 켜고 현미경 측정 프로그램을 엽니다. 그것이 이미에 현미경의 광원 설정 합니다. 10 배 현미경 배율을 설정 합니다.
2. 땀 샘을 찾아서 컴퓨터 없이 접 안 렌즈에서 확대 된 이미지 초점. 60-80 x 배율 증가 하 고 접 안 렌즈에서 이미지를 초점.
3. '취득' 탭에서 조정 하 고 컴퓨터에 라이브 이미지에 초점을 분 비 합니다.
4. ' 이미지 이름 ' 상자에 이미지 이름/샘플 설명을 입력 하 고 ' 이미지 획득 ' 더 측정에 대 한 땀 샘의 이미지를 클릭 하십시오.
5. '분석' 탭 선택 '영역 도구' ( 보충 그림 1A강조 표시)을 선택 하 고 선택을 취소 '값' '레이블 표시', 또한 '단위'의 선택을 취소 합니다. 다른 모든 설정을 기본 (보충 그림 1A) 설정.
   참고:는 낮은 배율에서 얻은 지역 높은 배율에서 얻은 것과 같은 소프트웨어는 자동으로 수준 확대에 따라 지역 측정을 보정.
6. 지속적으로 클릭 하거나 지속적으로 acinus 경계를 최대한 신중 하 게 추적 하는 동안 마우스 왼쪽된 버튼을 누른 하 여 각 acinus를 측정 합니다. 벌 당 적어도 10 acini 측정 합니다.
   참고: 더 많은 실험에 따라 필요할 수 있습니다 ( 토론참조). 그것은 측정에 대 한 충분 한 명확 하 고 제대로 방향이 acini 찾을 수 동맥의 여러 이미지/섹션 필요할 수 있습니다.
7. 일단 모든 단일 이미지에서 acini 측정 '보고서 작성'을 선택 합니다. 확인 옵션 추가 그림 1B 와 같이 선택 하 고 '내보내기'를 클릭 합니다.
8. 원하는 대로 보고서를 저장 합니다. 파일이 이미 만들어졌는지 샘플 집합에 대 한 추가 측정 추가 되 고 하는 경우 새 데이터는 기존 파일에 추가 되도록 보고서 파일이 오픈 되지 않으면 확인 합니다.
9. 완료 되 면, 현미경 카메라와 광원을 해제 합니다. 액체와 현미경 슬라이드에서 땀 닦 고 안전 하 게 사용 된 자료의 처리. 증류수와 슬라이드를 헹 구 고 깨끗 한 에탄올 (물에 70 %v / v) 다시 닦아.

결과

Hypopharyngeal 땀 샘 간호사 노동자에서 해 부 되었고 60-80 X 확대 (그림 1)에서 얼룩 없이 시각. 흠 없는 조직에 완전히 집중 하 고는 acini의 가장자리를 정의 적절 한 대비를 찾을 하기가 어렵습니다. 얼룩진된 조직에는 acini의 가장자리는 스테인드 조직과 흰색 배경 사이의 향상 된 명암으로 인해 날카로운.

토론

Hypopharyngeal 선 크기 단백질과 다이어트에 꽃가루의 금액에 민감한 이며 젊은 성인 꿀벌 영양의 중요 한 표식입니다. 여기, 우리는 부하이 조직을 측정 하는 저렴 하 고 재현할 수 방법을 보여 줍니다. 이 조직, 해 부 하기 어려울 수 있습니다 하지만 연습, 하나 상대적으로 그대로 조직으로 점점 청소기 해를 얻을 수 있습니다. 여기에 제시 된 방법의 주요 장점은 그 조직 이다 스테인드, 각 선 acinus?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cool setting wax	Grobet USA	21.450
Glass petri dish, small	VWR	89000-310
Glass petri dish, large	VWR	89000-314
Super Max Wax Pen	Eurotool	PEN-520.00
Breakable razor blades	Electron Microscopy Sciences	72004
pin vise	BioQuip	4845
2A-SA flat/rounded tip forceps	Rubis/BioQuip	4522
Fine point forceps	Rubis/BioQuip	4523
5A-SA super fine point forceps	Rubis/BioQuip	4525
10 mm micro spring scissors	BioQuip	4715
3 mm micro spring Vannas scissors	Roboz	RS-5610
Glass Depression Slides, Single Cavity	GSC International	4-13057-DZ-12
PBS tablets	VWR	97062-730
Giemsa stain, modified solution	Sigma Aldrich	32884
Insect pins	ENTO SPHINX S.R.O.	02.02
Leica Applications Suite measurement software	Leica Microsystems		any measurement software, including free software, can be used