Medição de hipofaringe glândula Acinus tamanho em trabalhadores de abelhas (Apis mellifera)

Resumo

Hipofaringe glândula acinus tamanho é uma medida robusta de nutrição de abelhas de mel de enfermeira. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para dissecar, coloração, imagem e medição ácinos de glândula enfermeira abelha hipofaringe.

Resumo

As enfermeira hipofaringe glândulas produzem a fração proteica do trabalhador e geleia real que é alimentada para desenvolver as larvas e as rainhas. Estas glândulas pareadas localizadas na cabeça da abelha são altamente sensíveis à quantidade e qualidade de pólen e pólen substitutos que a enfermeira abelha consome. As glândulas ficam menores quando as enfermeiras são alimentadas com dietas deficientes e são grandes, quando eles são alimentados com dietas completas. Porque a enfermeira hipofaringe glândula tamanho é um indicador robusto da enfermeira nutrição, é essencial que os que estudam a nutrição de abelhas de mel sabem como medir essas glândulas. Aqui, nós fornecemos métodos detalhados para dissecando, coloração, imagem latente e glândulas de hipofaringe enfermeira abelha de medição. Apresentamos as comparações de dados que foram usados para estudar o impacto do pólen no tamanho da glândula e tecido imaculado e manchado. Este método tem sido usado para testar como dieta afeta o tamanho de glândula de hipofaringe, mas tem mais uso para compreender o papel dessas glândulas na saúde de colmeia.

Introdução

As abelhas são essenciais para a agricultura porque eles polinizam uma variedade de culturas que são consumidos por seres humanos e animais. Muita atenção para o declínio das populações de abelhas de mel como focalizar de perdas de colônia em torno de 30-40% anualmente no Estados Unidos¹ e 10-15% na Europa,^2,3. Múltiplos fatores, incluindo o acesso reduzido a alta qualidade de forragem, provável ato juntos para afetar negativamente a saúde das abelhas de mel. Monocultura, seca, práticas insustentáveis de apicultura e outros fatores diminuem a diversidade e a quantidade de pólens naturais disponíveis para colônias^4,5. Porque as abelhas derivam quase todas as suas proteínas dietéticas e lipídios de pólen, acesso reduzido ao pólen pode limitar severamente a saúde individual e colônia.

As glândulas de hipofaringe são estruturas secretoras, localizadas na cabeça da abelha, entre os olhos e o cérebro⁶. Em circunstâncias normais, a trajetória do desenvolvimento e funcional das glândulas espelho que da abelha estão localizados no. Com aproximadamente 5-10 dias de idade, a abelha realiza comportamentos de enfermagem na colmeia. Neste mesmo momento, as glândulas de hipofaringe atingir seu pico e capacidade secretora, produzindo a fração de proteína principal do alimento ninhado ou geleia alimentado para o desenvolvimento de larvas e outros adultos, como a rainha. Neste tamanho de pico as glândulas se assemelhar a um cacho de uvas, onde cada uva é uma estrutura discreta lobo conhecida como o acinus (plural: acinar). Como a abelha operária, idades e assume diferentes tarefas na colmeia, as glândulas de hipofaringe encolhem e assumem diferentes funções, como quebrar açúcares no néctar^7,8. As glândulas de hipofaringe, portanto, estão correlacionadas com a idade da abelha e sua tarefa associada a idade.

Tamanho de glândula enfermeira hipofaringe é sensível à quantidade e qualidade de proteína em sua dieta^9,10,11. Quando a enfermeira abelhas são bem nutridas, suas glândulas são grandes. Considerando que, as glândulas são pequenas quando a abelha é privada de pólen, particularmente na primeira semana do desenvolvimento adulto. Para determinar o estado nutricional de uma abelha de enfermeira, pesquisadores normalmente medem as glândulas de hipofaringe, ou medindo diretamente a glândula acinus tamanho^11,12,13,14 ou proteína^15,16 de conteúdo ou medindo-se a proteína¹¹ de conteúdo ou peso fresco¹⁷ de cabeça inteira onde eles estão localizados. Cada método tem suas próprias vantagens e desvantagens. Nós preferimos a resolução Obtida de medição ácinos da glândula, embora esse método pode ser um desafio de duas maneiras principais. O primeiro desafio é identificar e dissecar a glândula corretamente. O segundo é a obtenção de uma medida exata de cada acinus. Sob um microscópio de luz dissecação, as glândulas aparecem transparente ou leitoso branco e as fronteiras dos ácinos podem ser difícil de definir. Ter ferramentas para definir melhor a borda da acinar e aumentar a probabilidade de obter medições precisas da glândula é benéfica a ninguém estudar nutrição de abelha de mel.

Aqui, nós mostramos pesquisadores interessados como dissecar, mancha, imagem e medir a hipofaringe glândulas para que as medidas exatas de tamanho acinus podem ser alcançadas. O método que descrevemos oferece pesquisadores um método fácil, preciso e replicável para alcançar várias medições de glândula em um período relativamente curto de tempo, uma vez que o experimentador é suficientemente praticado. Um com confiança poderia medir as glândulas de quase 10 pessoas em mais de uma hora. Oferecemos detalhes sobre o método e materiais necessários para obter estas medidas. Os aspectos mais importantes dos métodos indicados abaixo são a dissecação adequada e coloração das glândulas. Apesar de capturar as imagens ampliadas e medir os ácinos com software comercial, os métodos que apresentamos podem ser facilmente adaptados para outras plataformas,¹⁸.

Protocolo

1. dissecando e manchando as glândulas de hipofaringe de trabalhadores de enfermeira

1. Fazer uma placa de dissecação de cera derretendo cera de definição legal em uma pequena (60 mm x 15 mm) ou um copo grande (100 x 15 mm) placa de Petri. Esfrie a cera completamente antes de usar a placa para as dissecções.
2. Para cada abelha para serem processados, prepare-se 20 µ l de uma 01:20 Giemsa solução de trabalho (01:20 v/v de preparado o corante de Giemsa em tampão fosfato salino (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄)).
   Cuidado: Giemsa mancha contém metanol e é inflamável. É tóxico se ingerido, inalado, ou se ele entra em contato com a pele. -Deve ser descartada de acordo com os requisitos da instituição local.
   Nota: Sempre faça uma solução fresca de trabalho apenas para o lote atual de amostras porque mancha Giemsa degrada rapidamente uma vez que está diluído. Descarte a mancha diluída se desenvolve de um precipitado.
3. Pipetar 20 µ l Giemsa uma mancha nos poços de corrediças do microscópio e salina de 50 a 100 µ l a lâmina adjacente ao poço.
4. Retire a cabeça de uma abelha, usando a tesoura de micro-Primavera de 10mm e incorporar o lado da frente da cabeça a placa de dissecação de cera usando fórceps e uma caneta de escultura de cera. Segure a cabeça na placa de cera para estabilidade adicional, inserindo os pinos nos olhos e um na boca.
5. Usando uma lâmina de barbear afiada quebrável fixa no torno de bancada pino, fazer uma pequena (~ 2-3 mm) incisão entre os olhos e mandíbulas de cada lado da placa de cara. Delicadamente, executar a tesoura micro sob a placa de cara e cortou o nervo da antena que se estende entre a antena e o cérebro.
6. Usando a pinça fina, pegar a placa de cara pela boca, flip-la e fixá-lo à placa de cera, com pinça de ponta fina e um pin. Se necessário, remova a placa de cara completamente.
7. Pipetar 20 µ l PBS para o corte abre a seção da cabeça.
   Nota: As glândulas podem flutuar acima neste ponto ou um deve procurá-los. As glândulas se parece com um colar de pérolas e estão localizadas na parte superior do cérebro se intacto.
8. Use pinça ponto super fino para remover suavemente uma das glândulas de hipofaringe (glândula pode quebrar, obrigá-la a ser removidas em segmentos) e transferir imediatamente a glândula para a mancha de Giemsa do slide de microscopia.
9. Permitir que a glândula a incubar na solução de Giemsa por 5 min e então usar fórceps para transferir a glândula para o pool de soro no mesmo slide. Se necessário, corte a glândula em pequenos pedaços com uma tesoura de micro.
   Nota: Isso ajuda a tornar as glândulas mentir em um avião mais plano, tornando assim mais fácil de obter imagens claras dos ácinos da glândula.

2. medir a hipofaringe glândula acinar

1. Ligue o microscópio e abrir o programa de medição. Ligue a fonte de luz para o microscópio, se ainda não estiver na. Defina a ampliação do microscópio para 10 X.
2. Encontrar as glândulas e focar a imagem ampliada na ocular, sem o computador. Aumentar a ampliação de 60 – 80 X e focar a imagem na ocular.
3. Na guia 'adquirir', ajustar e focar as glândulas a imagem ao vivo no computador.
4. Digite a descrição do nome/amostra de imagem na caixa 'Nome de imagem' e clique em 'Adquirir imagem' para criar a imagem de glândulas para medições ainda mais.
5. Selecione a guia 'Análise' a 'área ferramenta Selecionar' (destacada na Figura suplementar 1A) e desmarque 'valor' sob 'Exibir rótulos', que também irá desmarcar 'unidade'. Como todas as outras configurações padrão (Supplemental figura 1A).
   Nota: O software calibra automaticamente as medições de área, de acordo com o nível de ampliação para que a área Obtida de uma baixa ampliação é o mesmo que obtidos de uma maior ampliação.
6. Medir cada acinus continuamente clicando ou continuamente mantendo pressionado o botão esquerdo do mouse enquanto o perímetro acinus de rastreamento tão cuidadosamente quanto possível. Medir pelo menos 10 acinar por abelha.
   Nota: Mais podem ser necessárias dependendo do experimento (veja a discussão). Pode exigir várias imagens/seções da glândula encontrar suficiente acinar clara e corretamente orientado para medição.
7. Uma vez que todos os ácinos de uma única imagem foram medidos, selecione 'Criar relatório'. Certifique-se que as opções são selecionadas, como mostrado na Figura suplementar 1B e clique em 'Exportar'.
8. Salve o relatório como desejado. Se um arquivo já foi criado para o conjunto de amostras e medições adicionais estão sendo adicionadas, certifique-se de que o arquivo de relatório não está aberto para que os novos dados são adicionados ao arquivo existente.
9. Quando terminar, desligue a câmera do microscópio e a fonte de luz. Limpar o líquido e glândulas fora as lâminas de microscopia e eliminar de forma segura de qualquer material usado. Lave os slides com água destilada e limpe com álcool etílico (70% v/v em água) para reusar.

Resultados

Glândulas de hipofaringe foram dissecadas da enfermeira trabalhadores e visualizadas com e sem mancha na ampliação de 60 – 80 X (Figura 1). No tecido imaculado, é difícil encontrar o contraste adequado totalmente foco e definir as bordas dos ácinos. No tecido manchado, as bordas dos ácinos são nítidas devido o melhor contraste entre o tecido manchado e o fundo branco.

Discussão

Tamanho de glândula de hipofaringe é sensível à quantidade de proteína e pólen na dieta e um marcador crítico de nutrição em abelhas adultas jovens. Aqui, vamos demonstrar uma maneira barata e reprodutível para dissecar e medir este tecido. Estes tecidos podem ser difíceis de dissecar, mas com a prática, um pode obter cada vez mais limpas dissecações com o tecido relativamente intacta. A principal vantagem do método apresentado aqui é que o tecido é manchado, o que permite que o pesquisador Visualizar cl...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cool setting wax	Grobet USA	21.450
Glass petri dish, small	VWR	89000-310
Glass petri dish, large	VWR	89000-314
Super Max Wax Pen	Eurotool	PEN-520.00
Breakable razor blades	Electron Microscopy Sciences	72004
pin vise	BioQuip	4845
2A-SA flat/rounded tip forceps	Rubis/BioQuip	4522
Fine point forceps	Rubis/BioQuip	4523
5A-SA super fine point forceps	Rubis/BioQuip	4525
10 mm micro spring scissors	BioQuip	4715
3 mm micro spring Vannas scissors	Roboz	RS-5610
Glass Depression Slides, Single Cavity	GSC International	4-13057-DZ-12
PBS tablets	VWR	97062-730
Giemsa stain, modified solution	Sigma Aldrich	32884
Insect pins	ENTO SPHINX S.R.O.	02.02
Leica Applications Suite measurement software	Leica Microsystems		any measurement software, including free software, can be used