Medición de hipofaringe tamaño de acino de glándula en trabajadores de la abeja (Apis mellifera)

Resumen

Tamaño de acino de glándula hipofaríngea es una medida robusta de enfermera nutrición de abejas de miel. Presentamos un protocolo detallado para disección, tinción, proyección de imagen y medición acinos de la glándula de enfermera abeja hipofaríngeo.

Resumen

Las enfermera las glándulas hipofaríngeas producen la fracción proteica del trabajador y la jalea real que se alimenta con el desarrollo de larvas y reinas. Estas glándulas apareadas que se encuentran en la cabeza de la abeja son muy sensibles a la cantidad y calidad de polen y polen sustituye que consume la abeja enfermera. Las glándulas consigue más pequeño cuando las enfermeras son alimentadas con dietas deficientes y son grandes cuando son alimentadas con dietas completas. Porque el tamaño de la glándula hipofaríngea enfermera es un indicador robusto de la enfermera de nutrición, es fundamental que quienes estudian miel abeja nutrición saben cómo medir estas glándulas. Aquí, ofrecemos métodos detallados para la disección, la coloración, la proyección de imagen y medición glándulas hipofaríngeas de enfermeras abeja. Presentamos las comparaciones de datos que se utilizaron para estudiar el impacto de polen en el tamaño de la glándula y tejido sin manchas y manchado. Este método se ha utilizado para probar cómo dieta afecta el tamaño de la glándula hipofaríngea pero tiene otro uso para la comprensión de la función de estas glándulas en la salud de la colmena.

Introducción

Miel de abejas es esenciales para la agricultura porque ellos polinizan una variedad de cultivos que son consumidos por los seres humanos y animales. Mucha atención se ha pagado a la declinación de las poblaciones de abejas como suspender las pérdidas de Colonia alrededor del 30-40% cada año en los Estados Unidos¹ y 10 – 15% en Europa^2,3. Múltiples factores, incluyendo el reducido acceso a la alta calidad de forraje, probable ley para afectar negativamente la salud de abejas de miel. Monocultivo, la sequía, las prácticas insostenibles de la apicultura y otros factores disminución de la diversidad y cantidad de polen natural disponible para las colonias^4,5. Porque abejas derivan casi todos su dieta proteínas y lípidos de polen, acceso reducido al polen puede limitar severamente la salud individual y Colonia.

Las glándulas de la hipofaringe son estructuras secretoras situadas en cabeza de la abeja entre los ojos y el cerebro⁶. En circunstancias normales, la trayectoria del desarrollo y funcional de las glándulas de la abeja se encuentran en espejo. En aproximadamente 5 – 10 días de edad, la abeja realiza comportamientos de enfermería en la colmena. En este mismo tiempo, las glándulas hipofaríngeas alcanzan su máximo tamaño y capacidad secretora, produciendo la fracción de la proteína importante del alimento de cría o alimentada al desarrollo de las larvas y otros adultos, como la reina de la jalea. En este tamaño de pico las glándulas se asemejan a un racimo de uvas donde cada uva es una estructura discreta lóbulo conocida como los acinos (plural: acinos). Como la abeja del trabajador envejece y adquiere diferentes tareas en la colmena, las glándulas de la hipofaringe se encogerán y asumir diferentes funciones, como romper azúcares en el néctar^7,8. Por lo tanto, las glándulas hipofaríngeas se correlacionan con la edad de la abeja y su tarea relacionado con la edad.

Tamaño de la glándula hipofaríngea enfermera es sensible a la cantidad y la calidad de la proteína en su dieta^9,10,11. Cuando las abejas de la enfermera están bien alimentadas, sus glándulas son grandes. Mientras que las glándulas son pequeñas cuando la abeja carece de polen, especialmente en la primera semana del desarrollo adulto. Para determinar el estado nutricional de una abeja de la enfermera, los investigadores suelen medir las glándulas hipofaríngeas, ya sea por medición directa de la glándula acino tamaño^11,12,13,14 o proteína^15,16 de contenido fresco peso¹⁷ de toda la cabeza donde se encuentran o midiendo la proteína contenido¹¹ . Cada método tiene sus propios pros y contras. Preferimos la resolución de la medición de los acinos de la glándula, aunque este método puede ser un desafío en dos formas principales. El primer desafío es identificar y disecar la glándula. La segunda es obtener una medida exacta de cada acino. Con un microscopio de disección ligero, las glándulas aparecen blanco claro o lechoso y las fronteras de los acinos pueden ser difíciles de definir. Tener herramientas para definir mejor el borde de los acinos y para aumentar la probabilidad de obtener mediciones precisas de la glándula es beneficioso para nadie estudiando nutrición de abejas de miel.

Aquí, mostramos investigadores interesados cómo diseccionar, mancha, imagen y medir glándulas hipofaríngeas por lo que pueden lograr mediciones precisas del tamaño de acinos. El método que describimos ofrece a los investigadores un método fácil, preciso y reproducible para la consecución de varias mediciones de la glándula en un período relativamente corto de tiempo una vez que el experimentador se practica lo suficiente. Uno podría medir con confianza las glándulas de casi 10 personas en poco más de una hora. Ofrecemos información sobre el método y los materiales necesarios para obtener estas medidas. Los aspectos más importantes de los métodos descritos a continuación son la adecuada disección y tinción de las glándulas. Aunque capturar las imágenes magnificadas y medimos los acinos con software comercial, los métodos que presentamos pueden ser fácilmente adaptados a otras plataformas¹⁸.

Protocolo

1. disección y tinción de las glándulas hipofaríngeas de trabajadores de la enfermera

1. Hacer una placa de disección cera derritiendo cera ajuste cool en un pequeño (60 mm x 15 mm) o placa de Petri de vidrio grande (100 x 15 mm). Enfríe la cera antes de usar la placa para disecciones.
2. Para que cada abeja a procesar, preparar 20 μl de una 1:20 solución Giemsa diluida (1:20 v/v del preparado mancha de Giemsa en solución salina tamponada con fosfato (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM de Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄)).
   PRECAUCIÓN: La mancha de Giemsa contiene metanol y es inflamable. Es tóxico si está tragado, inhalado, o si entra en contacto con la piel. Se deben eliminarse según los requisitos de la institución local.
   Nota: Haga siempre una solución fresca de trabajo sólo para el lote actual de muestras porque mancha de Giemsa se degrada rápidamente una vez que se diluye. Descartar el colorante diluido si se presenta un precipitado.
3. Tinción de Giemsa pipetee 20 μl a los pocillos de los portaobjetos de microscopio y 50 – 100 μl salino en la diapositiva junto al pozo.
4. Separar la cabeza de una abeja, con las tijeras micro-primavera de 10 mm e incorporar la cabeza parte frontal para arriba en la placa de disección de cera utilizando fórceps y un lápiz de cera-talla. Perno de la cabeza hacia abajo en la placa de cera para estabilidad adicional insertando alfileres en los ojos y uno en la boca.
5. Usando una cuchilla de frágil aguda en una prensa de tornillo pin, hacer un pequeño (~ 2-3 mm) incisión entre los ojos y mandíbulas a cada lado de la placa frontal. Ejecutar el micro tijeras debajo de la placa de cara y cortar el nervio antenal que discurre entre las antenas y el cerebro.
6. Con unas pinzas finas, agarrar la placa por la boca lo levante y pasador a la placa de cera con pinzas de punta fina y un pin. Si es necesario, retire la placa frontal completo.
7. Pipetee 20 μl PBS en el corte abierto sección de la cabeza.
   Nota: Las glándulas pueden flotar para arriba en este punto o uno debe buscarlos. Las glándulas parecen un collar de perlas y se encuentran en la parte superior del cerebro si intacto.
8. Utilizar pinzas de punta súper fina para eliminar suavemente una de las glándulas hipofaríngeas (la glándula puede romper, que requieren para ser quitado en segmentos) y transferir inmediatamente la glándula a la tinción de Giemsa en el portaobjetos de microscopía.
9. Permite la glándula para incubar en la solución de Giemsa durante 5 min y luego usar fórceps para transferir la glándula a la piscina de solución salina en la misma diapositiva. Si es necesario, cortar la glándula en trozos más pequeños con las tijeras micro.
   Nota: Esto ayuda a que las glándulas se encuentran en un plano más plano, así haciéndolo más fácil obtener imágenes claras de los acinos de la glándula.

2. medición de la hipofaringe acinos de la glándula

1. Abra en el microscopio y el programa de medición. Encienda la fuente de luz para el microscopio si no está ya en. Establece la ampliación del microscopio a 10 X.
2. Encontrar las glándulas y enfocar la imagen magnificada en el ocular, sin la computadora. La ampliación a 60 – 80 X de aumentar y enfocar la imagen en el ocular.
3. En la pestaña de 'adquisición', ajuste y las glándulas se centran en la imagen en directo en la computadora.
4. Tipo de imagen Descripción nombre/muestra en el cuadro 'Nombre de la imagen' y haga clic en 'Adquirir imagen' para tomar una imagen de las glándulas para otras medidas.
5. Seleccione la ficha 'Análisis' Seleccione la 'herramienta área' (resaltada en el suplementario Figura 1A) y deseleccionar 'valor' bajo 'Etiquetas de pantalla', que también será deseleccionar 'unidad'. Coloque todos los otros ajustes por defecto (suplementario Figura 1A).
   Nota: El software calibra automáticamente las mediciones de área según el nivel de ampliación para que el área de un aumento inferior es igual a la de un aumento mayor.
6. Medir cada acino continuamente o continuamente manteniendo pulsado el botón izquierdo del ratón mientras se trazado el perímetro de acino tan cuidadosamente como sea posible. Medir por lo menos 10 acinos por abeja.
   Nota: Más necesite dependiendo de la experiencia (ver discusión). Puede requerir múltiples imágenes/secciones de la glándula para encontrar suficiente acinos claros y correctamente orientados para la medición.
7. Una vez que se han medido todos los acinos de una única imagen, seleccione "Crear informe". Asegúrese de que opciones son seleccionadas como se muestra en la figura suplementaria 1B y haga clic en 'exportar'.
8. Guarde el informe como se desee. Si ya se ha creado un archivo para el conjunto de muestras y mediciones adicionales se agregan, asegúrese de que el archivo de informe no está abierto para que los nuevos datos se agregan al archivo existente.
9. Cuando haya terminado, apague la cámara de microscopio y fuente de luz. Limpie el líquido y las glándulas de los portaobjetos de microscopía y disponen con seguridad de cualquier material utilizado. Enjuague los portaobjetos con agua destilada y limpie con etanol (70% v/v en agua) para su reutilización.

Resultados

Glándulas hipofaríngeas fueron disectadas de los trabajadores de enfermería y visualizadas con y sin mancha en 60 – 80 X de ampliación (figura 1). En el tejido sin mancha, es difícil encontrar contraste apropiado enfocar y definir los bordes de los acinos. En el tejido manchado, las de los acinos están afiladas debido al mayor contraste entre el tejido manchado y el fondo blanco.

Discusión

Tamaño de la glándula hipofaríngea es sensible a la cantidad de proteínas y polen en la dieta y es un marcador importante de alimentación en abejas adultas jóvenes. Aquí, demostramos una forma económica y reproducible para analizar y medir este tejido. Estos tejidos pueden ser difíciles de disecar, pero con la práctica, se pueden obtener cada vez más limpiador disecciones con el tejido relativamente intacta. La principal ventaja del método presentado aquí es que el tejido se tiñe, que permite al investigado...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cool setting wax	Grobet USA	21.450
Glass petri dish, small	VWR	89000-310
Glass petri dish, large	VWR	89000-314
Super Max Wax Pen	Eurotool	PEN-520.00
Breakable razor blades	Electron Microscopy Sciences	72004
pin vise	BioQuip	4845
2A-SA flat/rounded tip forceps	Rubis/BioQuip	4522
Fine point forceps	Rubis/BioQuip	4523
5A-SA super fine point forceps	Rubis/BioQuip	4525
10 mm micro spring scissors	BioQuip	4715
3 mm micro spring Vannas scissors	Roboz	RS-5610
Glass Depression Slides, Single Cavity	GSC International	4-13057-DZ-12
PBS tablets	VWR	97062-730
Giemsa stain, modified solution	Sigma Aldrich	32884
Insect pins	ENTO SPHINX S.R.O.	02.02
Leica Applications Suite measurement software	Leica Microsystems		any measurement software, including free software, can be used