JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هو ارتفاع ضغط الدم المزمن في العين الناجمة عن تطبيق خياطة سيركومليمبال في الجرذان والفئران، مما أدى إلى تدهور خلايا العقدة الشبكية متسقة مع الزرق الوظيفية والهيكلية.

Abstract

خياطة سيركومليمبال تقنية لحفز الزرق التجريبية في القوارض بأمراض مزمنة لرفع الضغط داخل مقلة العين (IOP)، أحد عوامل الخطر معروفة الزرق. هذا البروتوكول يوضح دليل خطوة بخطوة في هذا الأسلوب في "إيفانز طويلة" الجرذان والفئران C57BL/6. تحت التخدير العام، ويتم تطبيق خياطة "محفظة-سلسلة" على الملتحمة، حول خط الاستواء، وخلف ليمبوس العين. العين زميل يعمل كعنصر تحكم غير معالجة. خلال مدة الدراسة، التي كانت فترة 8 أسابيع للفئران و 12 أسبوعا للفئران، IOP ظلت مرتفعة، مقيسة بانتظام بانتعاش tonometry في الحيوانات واعية دون تخدير موضعي. في كلا من الأنواع، أظهرت العينين ستورد ميزات اليكتروريتينوجرام متسقة مع خلل الشبكية الداخلية تفضيلية. وأظهر التصوير المقطعي التماسك البصري الانتقائي ترقق طبقة الألياف العصبية الشبكية. علم الأنسجة الشبكية الفئران في المقطع العرضي العثور على تخفيض كثافة الخلايا في طبقة خلايا العقدة، ولكن أي تغيير في الطبقات الخلوية الأخرى. وأكد فقدان خلايا العقدة تلطيخ من ريتين الماوس تحميل مسطحة مع علامة خلية العقدة محددة (رببمس). خياطة سيركومليمبال هو بسيط، والحد الأدنى الغازية وفعالة من حيث التكلفة وسيلة لحمل العين ارتفاع ضغط الدم الذي يؤدي إلى إصابة خلايا العقدة في الجرذان والفئران.

Introduction

نماذج حيوانية توفير منصة هامة للتحقيق في المختبر الخلوية العمليات المرضية الكامنة وراء الزرق، كذلك فيما يتعلق بتقييم التدخلات العلاجية المحتملة. وضعت عدة نماذج إيندوسيبلي لإنتاج ارتفاع ضغط العين المستمر (IOP)، أهم عامل خطر الزرق. وتشمل الأساليب التي تم تطبيقها لرفع IOP: الأوردة حقن المالحة مكثف في ابيسكليرال1، الليزر الضوئي trabecular meshwork2 أو الأوردة حوفي3، وحقن إينتراكاميرال من المواد مثل خلايا الدم الحمراء شبح4، ميكروبيدس،من56 ولزج مطاطي وكلاء7. وقد نهج كل مزايا وقيود.

ينبغي أن تحاكي نموذج جيد الزرق عملية المرض، مع الحد الأدنى من المضاعفات مثل نسبة تظليل الصدمة والتهاب ووسائط الإعلام. هذه المضاعفات هي كثيرا ما يرتبط مع الإجراءات المستخدمة للحث على ارتفاع IOP، ويمكن الخلط بين تفسير النتائج. على سبيل المثال، بزل الغرفة الأمامية، حتى عندما لا يتم الأخذ بالمؤثرات الخارجية، قد ثبت أن تسبب الصدمات والالتهابات التي لا يمثل التغيير جلوكوماتوس النموذجي8،9. بالإضافة إلى أهمية تجنب التهاب، يسهل الحفاظ على الوضوح البصري في فيفو التصوير والكهربية لرصد تطور المرض. على الرغم من أنه ليس من الواضح إلى أي مدى هذه المضاعفات قد يؤثر على التحقيقات المرض، قد يكون من الأفضل لتجنب اختراق العين خلال التعريف النموذجي. نهج خياطة سيركومليمبال يتجنب الاختراق من أنحاء العالم، ويسهل في فيفو التقييم طولية الشبكية هيكل ووظيفة. الأهم من ذلك، هذا النموذج يختلف عن سابقيه في قدرته على العودة IOP إلى قيم الأساس بإزالة خياطة عند الاقتضاء. تطبيع IOP قد تكون مفيدة لدراسة الخلوية ويرتبط الجزيئية للعقدة عكسها ولا رجعة فيها الخلية إصابة10،11،12،،من1314.

تركز هذه المقالة على تقنية لنموذج التعريفي. يمكن الاطلاع على وصف إصابة الشبكية الناجمة عن هذا النموذج في الجرذان والفئران بمزيد من التفصيل في مكان آخر15،،من1617،،من1819.

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات التجريبية وفقا "قانون الممارسة الأسترالية" لرعاية واستخدام الحيوانات "أغراض علمية"، حددها الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية في أستراليا. تم الحصول على الموافقة الأخلاقية من "لجنة الأخلاقيات الحيوان معهد هوارد فلوري" (الموافقة رقم 13-044-أم و 13-068-أم للفئران والجرذان، على التوالي).

1-قياس ضغط العين في الفئران واعية

  1. تعيين tonometer انتعاش المختبر إلى إعداد الفئران. قماط الفئران مستيقظا بقطعة من القماش الناعم لتهدئة الحيوان. كشف الرأس والرقبة. عقد الجذع في يد واحدة، مع عودة هذا الحيوان يستريح ضد الصدر المحقق بلطف.
    ملاحظة: تخدير موضعي غير مطلوب.
  2. استخدام اليد الأخرى لإحضار tonometer انتعاش قرب العين في الفئران، حيث يكون غيض المسبار IOP حوالي 2-3 ملم بعيداً عن وعمودي إلى ذروة القرنية. استخدام اليد اليمنى لقياس IOP الحيوان العين اليمنى، واليد اليسرى للعين اليسرى.
  3. انتظر بضع ثوان للفئران الهدوء، واضغط على زر القياس مرة واحدة. التقيد بلطف ضرب غيض المسبار IOP ابيكس القرنية مرة واحدة؛ وسماع صوت تنبيه tonometer انتعاش مرة واحدة.
    ملاحظة: يؤكد إشارة صوتية واحدة من تونوميتير قياس النجاح، والتي يمكن قراءتها من شاشة LCD. صوت تنبيه مزدوج يشير إلى وجود خطأ في قياس. يمكن أن تنشأ أخطاء القياس من العوامل مثل المسافة العمل غير مناسبة بين التحقيق والقرنية، ميل مفرط في التوجه تونوميتير، أو التحقيق ضرب الجفن أو جزء غير المركزي من القرنية. أرجع إلى دليل tonometer انتعاش من الشركة المصنعة لمزيد من التفصيل فيما يتعلق بأخطاء القياس.
  4. كرر الخطوة 1.3 عشر مرات في الفترة الفاصلة الثانية 1-2، وتستمد من هذه القياسات قيمة IOP متوسطة لهذه النقطة الزمنية. إعادة تعيين تونوميتير بعد قراءةال 5.
  5. لرصد المسلسل، قياس IOP في نفس الوقت من اليوم وتحت ظروف الإضاءة متسقة للتقليل من التباين بسبب دورة IOP الدافيء20،21.

2-قياس ضغط العين في الفئران واعية

  1. تعيين tonometer ارتدت إلى إعداد الماوس وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. لكبح جماح الماوس باليد، ضع الماوس على قمة قفص شواية واجذب الذيل إلى الوراء.
    ملاحظة: وهذا سيدفع إلى الحيوان إلى قبضة على الشواية المعدنية بالأرجل الأمامية ومحاولة سحب نفسه إلى الأمام، الذي سوف تمتد قليلاً في الجسم.
    1. استخدام اليد الأخرى لفهم الجلد فضفاضة مباشرة خلف الأذنين. تأمين الجزء الأسفل من الجسم من الحيوان بعقد الذيل بين خاتم الإصبع والإصبع الأوسط (أو بين الإصبع الصغير ويدك).
      ملاحظة: ليس محاولة لفهم الجلد ضيق جداً، لتجنب الاختناق وتطبيق الضغط على العينين.
  3. مع اليد الحرة الآن (في البداية عقد الذيل)، جلب tonometer انتعاش قرب العين للماوس، حيث يكون غيض المسبار IOP حوالي 2-3 مم من وعمودي إلى ذروة القرنية. لقياس العين الأخرى، قم بتدوير الماوس حيث أن العين الأخرى الآن أمام تونوميتير.
  4. انتظر الماوس للهدوء، واضغط على زر القياس مرة واحدة. مراقبة غيض المسبار IOP ضرب بلطف ابيكس القرنية؛ مع إشارة صوتية واحدة تؤكد قياس النجاح.
    ملاحظة: يشير إشارة صوتية مزدوجة خطأ قياس. قد تساعد ليكون المجرب القراءة الثانية والوثيقة قراءات IOP حين المجرب الأول يأخذ القياسات.
  5. كرر الخطوة 2، 4 للحصول على عشرة قراءات ناجحة لاستخلاص IOP. إعادة تعيين تونوميتير بعد قراءةال 5. السماح بفترة من 1-2 ثانية بين القراءات.
  6. حسب المسلسل القياس في الفئران، قياس الماوس IOP في نفس الوقت من اليوم وتحت ظروف الإضاءة متسقة.

3-تنظيم دورات تعريفية لارتفاع ضغط العين في تخديره من الجرذان والفئران

  1. تنظيف مقاعد البدلاء الجراحية مع الكلورهيكسيدين 0.5% في الإيثانول 70%. وتغطي على مقاعد البدلاء مع الستائر العقيمة. اﻷوتوكﻻف جميع المعدات الجراحية مسبقاً. ضمان جميع المجربون ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (الأقنعة والأردية وقفازات معقمة).
  2. للحث على التخدير العام، وضع الحيوان في دائرة للحث. تسليم 3 إلى 3.5% isoflurane مع س2 بمعدل تدفق 3 لتر في الدقيقة.
    1. المحافظة على التخدير مع isoflurane 1.5 في المائة في تسليم 2 لتر في الدقيقة عن طريق قناع وجه القوارض طوال عملية جراحية. ضمان العمق الكافي للتخدير بسبب غياب منعكس قرصه مخلب.
    2. تجنب الاكتئاب الجهاز التنفسي عن طريق ضبط معدل تدفق عند الضرورة للحفاظ على معدل التنفس في حوالي 60 نفسا بالدقيقة.
  3. حدد عشوائياً عين واحدة للحث على ارتفاع ضغط الدم والعين بالعين كونترالاتيرال ليكون بمثابة عنصر تحكم غير معالجة. غرس قطره واحدة من 0.5% بروكسيميتاكيني حل العيون لتخدير موضعي. لتنظيف سطح العين، شطف العين مع 3 مل من المحلول الملحي العادي العقيمة.
  4. وتشمل الحيوانات مع ثني جراحية المعقمة، فينيستراتيد، تعريض العين لتكون خياطة.
  5. أداء خياطة محفظة سلسلة على الملتحمة الصلبية حول العالم. بالنسبة للفئران، نسج خياطة نايلون موازية 7-0 و 2 مم الخلفي إلى ليمبوس (الشكل 1). في الفئران، مكان خياطة نايلون 10-0 في 1 مم الخلفي ليمبوس.
    1. الحرص على عدم اختراق الصلبة العينية. تمدد الحدقة مفاجئة أثناء العملية الجراحية يشير إلى قد المحتمل قد اخترقت الصلبة العينية.
    2. مرساة الخياطة في الملتحمة استخدام 5-6 نقاط الربط في الفئران، و 4-5 نقاط الربط في الفئران.
    3. تجنب ضغط مباشر على الأوردة الرئيسية ابيسكليرال بخيوط الخياطة أسفل الملتحمة في نقطة العبور هذه الأوردة.
      ملاحظة: بينما نحن نوصي بتجنب ضغط الوريد ابيسكليرال الرئيسية في الفئران، لم يتم بشكل روتيني ذلك في الفئران بسبب انخفاض الرؤية لهذه الأوردة في عيون الماوس. حتى ولو لم يتم ضغط الأوردة الرئيسية مباشرة، فمن المحتمل أن تكون سفن أصغر حجماً في الضفيرة الوريد ابيسكليرال تحت الضغط، التي قد تكون عاملاً مساهما في ارتفاع IOP المستدام (انظر مناقشة للآلية IOP من الارتفاع).
  6. ربط خياطة محفظة السلسلة بربط العقدة ثم تليها عقده بسيطة ثانية (الشكل 1). لتجنب سبايك IOP مفرطة في ارتفاع بعد جراحة، يكون مساعدا قياس IOP الفور قبل ابزيم العقدة الثانية.
    1. إذا تم العثور IOP مرتفعة للغاية، ضبط عقده كشف جزئيا الإفراج عن التوتر في نهاية واحدة من الخياطة (السهم في الشكل 1ألف).
    2. بعد تحقيق IOP المطلوب (من الناحية المثالية 30-60 ملم زئبقي في الفئران أو 30-40 مم زئبق في الفئران)، تعادل إيقاف العقدة الثانية مع الحفاظ على قوة شد مستمرة في ذلك النهاية للخياطة (السهم في الشكل 1).
    3. بعد الثانية وقد تم تشديد عقده، وتشذيب نهايات خياطة للتقليل من الإحساس بأي جسم غريب. مراقبة الحيوان أثناء التعافي من التخدير العام.
      ملاحظة: من المهم استخدام العقدة عند ربط العقدة الأولى لضمان ضغط داخلية كافية في العين. وبعد عدة أسابيع عادة لوحظ أن ينتهي تصبح جزءا لا يتجزأ من الملتحمة.

4-رصد IOP

  1. أن قياس IOP الأولى في دقيقتين قد تحت التخدير إيسوفلوراني. وفي وقت لاحق، رصد IOP عند القوارض وقد استعاد وعيه وفقا للخطوات المذكورة آنفا 1 و 2.
    ملاحظة: رصد IOP مرتين خلال اليوم الأول (2 دقيقة و 1 ساعة)، يوميا في الأسبوع الأول ومرة أو مرتين في الأسبوع بعد ذلك.

5-فحص الشبكية هيكل ووظيفة

  1. في المطلوب التجريبية نقطة النهاية (في هذه الحالة بعد 8 أسابيع في الفئران و 12 أسبوعا في الفئران)، تحت التخدير العام باستخدام الحقن داخل مع الكيتامين/إكسيلازيني، قياس وظيفة الشبكية مع اليكتروريتينوجرام داركادابتيد (ERG) كما هو موضح بمزيد من التفصيل في مكان آخر15،،من1617.
    ملاحظة: لقد وجدنا قوية العقدة خلية اختلال وظيفي، وترقق طبقة الألياف العصبية الشبكية، والعقدة الخلية خسارة لمدد تتراوح بين 8-12 أسابيع. الآخرين قد استخدمت بنجاح فترات أطول من IOP ارتفاع14،15.
  2. فورا بعد قياس أرج، وقياس سماكة طبقة الألياف العصبية الشبكية (رنفل) ومجموع سمك الشبكية باستخدام المجال الطيفي تماسك الألياف البصرية التصوير المقطعي (SD--أكتوبر) 16،18.
  3. في نهاية الدراسة الطولية، euthanize الحيوانات تحت التخدير العميق.
    1. تشريح الشبكية للأنسجة18، على سبيل المثال إيمونوستينينج الجامعة-جبل الشبكية باستخدام جسم خلية (كمبوديا) شبكية العقدة محددة مثل الحمض النووي الريبي-البروتين مع العديد من جسم الربط (رببمس) أو المجال الخاص بالمخ هوميوبوكس/بو 3A البروتين (Brn3a)16،،من1922.

النتائج

النتائج التالية في الفئران18 والفئران16 أفيد سابقا، ويرد هنا. خياطة سيركومليمبال تنتج نمطاً مماثلاً لارتفاع IOP في الجرذان والفئران (الشكل 2). تم العثور على تصاعد IOP قصيرة، تصل إلى 58.1 ملم زئبق ± 2.7 في الفئران و 38.7 مم زئبق ± 2.2 في الفئرا?...

Discussion

خياطة سيركومليمبال نموذج جديد لارتفاع ضغط الدم المزمن في العين. بالإضافة إلى الدراسات التي من خلالها النتائج التمثيلية هي المصدر16،18، هذا النموذج الحيواني قد استخدمت في عدد من الأخيرة دراسات15،،من2324،

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

وتمول هذه الأعمال "الوطنية للصحة" و "مجلس البحوث الطبية في أستراليا" منحة مشروع (1046203)، "مجلس البحوث الأسترالي مستقبل الزمالة" (FT130100338).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
normal salineBaxter International IncAHB1323Maintain corneal hydration during surgery
Chlorhexadine 0.5%Orion Laboratories27411, 80085Disinfection of surgical instrument
Isoflurane 99.9%Abbott Australasia Pty LtdCAS 26675-46-7Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for suture procedure
ocular lubricantAlcon Laboratories 1618611Proprietory Name: Genteal, ocular lubricant to keep the other eye moist
Needle holder (microsurgery)World Precision Instruments555419NTTo hold needle during ocular surgery
Proxymetacaine 0.5%Alcon Laboratories CAS 5875-06-9Topical ocular analgesia
Scissors (microsurgery)World Precision Instruments501232To cut excessive suture stump during ligation
Surgical drapeVital Medical SuppliesGM29-612EEEnsure sterile enviornment during surgery
Suture needle for rats (microsurgery)Ninbo medical needles1511098-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Suture needle for mice (microsurgery)Ninbo medical needles16090510-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Tweezers (microsurgery)World Precision Instruments500342Manipulate tissues during ocular surgery
rebound tonometerTONOLAB, iCare, Helsinki, FinlandTV02for intraocular pressure monitoring

References

  1. Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
  2. Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  3. Chiu, K., Chang, R., So, K. F. Laser-induced chronic ocular hypertension model on SD rats. Journal of Visualized Experiments. (10), 549 (2007).
  4. Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. I. Production of elevated intraocular pressure by anterior chamber injection of autologous ghost red blood cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 19 (2), 126-136 (1980).
  5. Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  6. Weber, A. J., Zelenak, D. Experimental glaucoma in the primate induced by latex microspheres. Journal of Neuroscience Methods. 111 (1), 39-48 (2001).
  7. Moreno, M. C., et al. A new experimental model of glaucoma in rats through intracameral injections of hyaluronic acid. Experimental Eye Research. 81 (1), 71-80 (2005).
  8. Hoyng, P. F., Verbey, N., Thorig, L., van Haeringen, N. J. Topical prostaglandins inhibit trauma-induced inflammation in the rabbit eye. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (8), 1217-1225 (1986).
  9. Kezic, J. M., Chrysostomou, V., Trounce, I. A., McMenamin, P. G., Crowston, J. G. Effect of anterior chamber cannulation and acute IOP elevation on retinal macrophages in the adult mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (4), 3028-3036 (2013).
  10. Waisbourd, M., et al. Reversible structural and functional changes after intraocular pressure reduction in patients with glaucoma. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (6), 1159-1166 (2016).
  11. Foulsham, W. S., Fu, L., Tatham, A. J. Visual improvement following glaucoma surgery: a case report. BMC Ophthalmology. 14, 162 (2014).
  12. Anderson, A. J., Stainer, M. J. A control experiment for studies that show improved visual sensitivity with intraocular pressure lowering in glaucoma. Ophthalmology. 121 (10), 2028-2032 (2014).
  13. Ventura, L. M., Feuer, W. J., Porciatti, V. Progressive loss of retinal ganglion cell function is hindered with IOP-lowering treatment in early glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 659-663 (2012).
  14. Zhao, D., et al. ARVO abstract number 3696 - B0043. annual meeting of Association for Research in Vision and Ophthalmology, Honolulu, Hawaii, USA. , (2018).
  15. Liu, H. H., et al. Chronic ocular hypertension induced by circumlimbal suture in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 2811-2820 (2015).
  16. Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, 41 (2017).
  17. Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
  18. Van Koeverden, A. K., He, Z., Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Systemic hypertension is not protective against chronic IOP elevation in a rodent model. Scientific Reports. 8 (1), 7107 (2018).
  19. Rodriguez, A. R., de Sevilla Muller, L. P., Brecha, N. C. The RNA binding protein RBPMS is a selective marker of ganglion cells in the mammalian retina. Journal of Comparative Neurology. 522 (6), 1411-1443 (2014).
  20. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Twenty-four-hour pattern of mouse intraocular pressure. Exp Eye Research. 77 (6), 681-686 (2003).
  21. Jia, L., Cepurna, W. O., Johnson, E. C., Morrison, J. C. Patterns of intraocular pressure elevation after aqueous humor outflow obstruction in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (6), 1380-1385 (2000).
  22. Nadal-Nicolas, F. M., Jimenez-Lopez, M., Sobrado-Calvo, P., Nieto-Lopez, L., Canovas-Martinez, I., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo, M. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
  23. Liu, H. H., Flanagan, J. G. A Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension Induced by Circumlimbal Suture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 353-361 (2017).
  24. Liu, H. H., He, Z., Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Reversal of functional loss in a rat model of chronic intraocular pressure elevation. Ophthalmic & Physiological Optics. 37 (1), 71-81 (2017).
  25. Liu, H. H., Zhang, L., Shi, M., Chen, L., Flanagan, J. G. Comparison of laser and circumlimbal suture induced elevation of intraocular pressure in albino CD-1 mice. PLoS One. 12 (11), 0189094 (2017).
  26. Shen, H. H., et al. Intraocular Pressure Induced Retinal Changes Identified Using Synchrotron Infrared Microscopy. PLoS One. 11 (10), 0164035 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved