Um modelo de Glaucoma induzido por sutura Circumlimbal em ratos e camundongos

Resumo

Hipertensão ocular crônica é induzida pela aplicação de uma sutura de circumlimbal em ratos e camundongos, levando à deterioração funcional e estrutural das células ganglionares da retina consistentes com glaucoma.

Resumo

A sutura de circumlimbal é uma técnica para induzir o glaucoma experimental em roedores por cronicamente elevar a pressão intra-ocular (Pio), um conhecido fator de risco para o glaucoma. Este protocolo demonstra um guia passo a passo sobre essa técnica no longo Evans ratos e camundongos C57BL/6. Sob anestesia geral, uma "" sutura em bolsa é aplicada na conjuntiva, ao redor do Equador e para trás ao limbo do olho. O olho companheiro serve como um controle não tratado. Ao longo da duração do nosso estudo, que foi um período de 8 semanas para ratos e 12 semanas para ratos, IOP manteve-se elevado, medida regularmente pelo tonometria de rebote em animais conscientes sem anestesia tópica. Em ambas as espécies, os olhos suturados mostraram electroretinogram características consistentes com disfunção da retina interna preferencial. Tomografia de coerência óptica mostrou desbaste seletivo da camada retinal da fibra do nervo. Histologia da retina rato na secção encontrada reduzida densidade de células na camada de células ganglionares, mas nenhuma mudança nas outras camadas celulares. Coloração de retinae rato apartamento montado com um marcador específico de células ganglionares (RBPMS) confirmou a perda de células ganglionares. A sutura de circumlimbal é um simples, minimamente invasiva e econômica maneira de induzir hipertensão ocular que leva à lesão de células ganglionares em ratos e camundongos.

Introdução

Modelos animais fornecem que uma plataforma importante para a investigação do laboratório de celular processos subjacentes patogênese de glaucoma, bem como avaliar possíveis intervenções terapêuticas. Foram desenvolvidos vários modelos inducible para produzir elevação sustentada da pressão intra-ocular (Pio), o mais importante fator de risco para o glaucoma. Métodos que foram aplicados para elevar o IOP incluem: injeção salina hipertônica no episcleral veias¹, fotocoagulação laser da malha trabecular² ou do estroma veias³e injeção intracameral de substâncias tais como fantasma vermelho glóbulos⁴, microbeads^5,6 e viscoelástico agentes⁷. Cada abordagem tem suas vantagens e limitações.

Um bom modelo para o glaucoma deve imitar o processo da doença, com mínima complicação como trauma, inflamação e mídia opacidades. Estas complicações são frequentemente associadas com os procedimentos utilizados para induzir a elevação do IOP e podem confundir a interpretação dos resultados. Por exemplo, paracentese de câmara anterior, mesmo quando substâncias estranhas não são introduzidas, tem demonstrado causar trauma e inflamação que não é representativa de típica mudança glaucomatous^8,9. A importância de evitar a inflamação, além de manter a claridade ótica facilita na vivo imaging e Eletrofisiologia para monitorar a progressão da doença. Embora não está claro em que medida estas complicações podem afetar as investigações de doença, pode ser melhor evitar penetrar o olho durante a indução de modelo. A abordagem de sutura circumlimbal evita a penetração do globo e facilita na vivo avaliação longitudinal da estrutura da retina e função. Mais importante, este modelo difere dos anteriores em sua capacidade de retornar o IOP para valores basais remoção da sutura quando necessário. Normalização de IOP pode ser útil para estudar o celular e moleculares correlações do gânglio reversível e irreversível celulares lesão^{10,11,12,13,14}.

Este artigo centra-se na técnica de indução de modelo. Caracterização da lesão retiniana induzida por este modelo em ratos e camundongos pode ser encontrada em maior detalhe em outro lugar^{15,16,17,18,19}.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com o Australian código de práticas para o cuidado e o uso de animais para fins científicos, definida pelo Conselho de pesquisa médica e nacional de saúde na Austrália. Aprovação ética foi obtida do Comitê de ética Howard Florey Institute Animal (aprovação número 13-044-hum e 13-068-hum para ratos e ratos, respectivamente).

1. medição de pressão intra-ocular em ratos conscientes

1. Ajuste o tonometer de rebote de laboratório para o rato. Swaddle o rato acordado em um pedaço de pano macio para acalmar o animal. Expor a cabeça e o pescoço. Pressione cuidadosamente o tronco em uma mão, com as costas do animal encostadas no peito do investigador.
   Nota: Não é necessária anestesia tópica.
2. Use a outra mão para trazer o tonometer rebote perto do olho do rato, de modo que a ponta da sonda IOP é aproximadamente 2-3 mm longe e perpendicular ao ápice da córnea. Use a mão direita para medir IOP no olho direito e mão esquerda para o olho esquerdo do animal.
3. Aguarde alguns segundos para o rato para acalmar e pressione o botão de medição de uma vez. Observar que a ponta da sonda IOP suavemente atingiu o ápice da córnea uma vez; e ouvir o bip de tonometer rebote de uma vez.
   Nota: Um único sinal do tonometer confirma sucesso medição, que pode ser lido a partir da tela de LCD. Um duplo sinal sonoro indica um erro de medição. Erros de medição podem surgir de fatores tais como a distância de trabalho inadequados entre a sonda e a córnea, uma inclinação excessiva na orientação do tonometer, ou a sonda atingir a pálpebra ou uma parte não-central da córnea. Consulte o manual de tonometer rebote do fabricante para mais detalhes sobre erros de medição.
4. Repita a etapa 1.3 dez vezes em um intervalo de 1-2 segundo, partir destas medições derivar um valor médio de IOP para esse ponto do tempo. Redefina o tonometer após a leitura de^th 5.
5. Para monitoramento serial, medir IOP ao mesmo tempo do dia e sob condições de iluminação consistente para minimizar a variação devido a diurnal IOP ciclo^20,21.

2. medição de pressão intra-ocular em camundongos conscientes

1. Ajuste o tonometer rebote para o mouse de acordo com as instruções do fabricante.
2. Para refrear o mouse com a mão, posicione o mouse no topo de uma gaiola de grade e puxe delicadamente a cauda para trás.
   Nota: Isto irá pedir o animal para segurar na grade do metal com suas patas dianteiras e a tentativa de se puxar para a frente, o que vai ligeiramente esticar seu corpo.
   1. Use a outra mão para agarrar a pele solta imediatamente atrás das orelhas. Prenda a parte inferior do corpo do animal, segurando a cauda entre o dedo anelar e o dedo médio (ou entre o dedo mindinho e a palma da mão).
      Nota: Não tente agarrar a pele muito apertada, para evitar asfixia e aplicando pressão sobre os olhos.
3. Com a mão livre agora (inicialmente segurando a cauda), trazer o tonometer rebote perto do olho do rato, para que a ponta da sonda IOP é aproximadamente 2-3mm de e perpendicular ao ápice da córnea. Para medir o outro olho, gire o mouse para que o outro olho está agora em frente o tonometer.
4. Espere para o mouse acalmar e pressione o botão de medição de uma vez. Observar que a ponta da sonda IOP suavemente atingiu o ápice da córnea; com um único bip confirmando a medida bem sucedida.
   Nota: Um duplo sinal sonoro indica um erro de medição. Pode ajudar a ter uma segunda leitura do experimentador e documento as leituras de IOP enquanto o primeiro experimentador leva as medições.
5. Repita a etapa 2.4 para obter dez leituras bem sucedidas para derivar um IOP. Redefina o tonometer após a leitura de^th 5. Permita um intervalo de 1-2 segundos entre leituras.
6. Conforme medição serial em ratos, medir rato IOP ao mesmo tempo do dia e sob condições de iluminação consistente.

3. indução de elevação da pressão intra-ocular em ratos anestesiados e camundongos

1. Limpe o banco cirúrgico com clorexidina 0,5% em etanol a 70%. Cobrir o banco com cortinas estéril. Autoclave todo equipamento cirúrgico previamente. Certifique-se de todos os experimentadores usam equipamento de protecção adequado (máscaras cirúrgicas, vestidos e luvas esterilizadas).
2. Para induzir anestesia geral, coloca o animal em uma câmara de indução. Entrega 3-3,5% de isoflurano com O₂ a uma taxa de fluxo de 3 L/min.
   1. Manter a anestesia com isoflurano 1,5% no 2 L/min entregado através de uma máscara de rosto roedores durante a cirurgia. Garantir suficiente profundidade da anestesia pela ausência de um reflexo de pitada de pata.
   2. Evite a depressão respiratória, ajustando a taxa de fluxo quando necessário para manter a taxa respiratória em cerca de 60 respirações por minuto.
3. Selecione aleatoriamente um olho para induzir hipertensão ocular, com o olho contralateral para servir como um controle não tratado. Instile uma gota de solução oftálmica de 0,5% proxymetacaine para anestesia tópica. Para limpar a superfície ocular, lave os olhos com 3 mL de solução salina estéril.
4. Cubra o animal com um pano cirúrgico estéril, fenestrado, expondo o olho a ser suturado.
5. Realize uma sutura em bolsa na conjuntiva bulbar ao redor do globo. Em ratos, tecer a sutura nylon paralela 7/0 e 2 mm posterior ao limbo (Figura 1). Em camundongos, coloque a sutura de nylon 10/0 a 1 mm posterior ao limbo.
   1. Tome cuidado para não penetrar a esclera. Uma súbita dilatação pupilar durante o procedimento cirúrgico indica que provavelmente foi penetrada a esclera.
   2. Âncora de sutura na conjuntiva usando 5-6 pontos de ancoragem em ratos e 4-5 pontos de ancoragem em camundongos.
   3. Evite a compressão direta sobre as veias principais episcleral rosqueando a sutura sob a conjuntiva no cruzamento destas veias.
      Nota: Enquanto nós recomendamos evitar a compressão da veia episcleral principais em ratos, isso não é rotineiramente feito em ratos devido à baixa visibilidade destas veias nos olhos de rato. Mesmo que as veias principais não são compactadas diretamente, é provável que as pequenas embarcações no plexo de veia episcleral estão sob pressão, que pode ser um fator contribuinte para a elevação sustentada do IOP (veja a discussão para o mecanismo de elevação de IOP).
6. Apertem a sutura em bolsa, amarrando um nó corrediço depois seguido de um segundo nó simples (Figura 1). Para evitar um pico IOP pós-cirúrgica excessivamente alto, ter um assistente medir o IOP imediatamente antes de apertar o segundo nó.
   1. Se o IOP é encontrado para ser demasiado elevado, ajuste o nó de deslizamento, parcialmente, liberando a tensão em uma extremidade da sutura (seta na Figura 1A).
   2. Depois que o IOP desejada é alcançada (idealmente de 30 a 60 mmHg em ratos ou 30-40 mmHg em ratos), gravata fora o segundo nó, mantendo uma força puxando contínua sobre o efeito da sutura (seta na Figura 1).
   3. Após o segundo nó foi apertada, apare as pontas da sutura para minimizar qualquer sensação de corpo estranho. Monitore o animal durante a recuperação da anestesia geral.
      Nota: É importante usar o slipknot quando o primeiro nó para garantir adequada compressão interna no olho. Após várias semanas geralmente Note-se que as extremidades se tornam incorporadas na conjuntiva.

4. monitorização IOP

1. Medir a primeira IOP em 2 minutos pós-operatório sob anestesia de isoflurano. Posteriormente, monitore IOP quando o roedor recuperou a consciência conforme os passos acima 1 e 2.
   Nota: Monitore o IOP duas vezes durante o primeiro dia (2 minutos e 1 hora), diariamente, na primeira semana e uma vez ou duas vezes por semana depois disso.

5. análise da função e estrutura da retina

1. No ponto experimental final desejado (no caso depois de 8 semanas em ratos e 12 semanas em ratos), sob anestesia geral com injeção intraperitoneal de xilazina/cetamina, medir a função da retina com a electroretinogram vez (ERG) conforme descrito mais pormenorizadamente noutro lugar^15,16,17.
   Nota: Nós encontramos robustos disfunção de células ganglionares, afinamento de camada de fibras nervosas da retina e gânglio célula perda para durações entre 8 a 12 semanas. Outros têm empregado com sucesso por períodos mais longos de IOP elevação^14,15.
2. Imediatamente após a medição de ERG, medir a espessura da camada retinal da fibra do nervo (RNFL) e da espessura da retina total usando o domínio espectral coerência óptica tomografia computadorizada (SD-OCT) ^16,18.
3. No final do estudo longitudinal, eutanásia dos animais sob anestesia profunda.
   1. Dissecar a retina para histologia¹⁸, por exemplo imunocoloração de retina toda a montagem, usando um anticorpo específico da célula (RGC) ganglionares da retina como RNA-proteína com vários anticorpos emenda (RBPMS) ou específicas do cérebro homeobox/POU domínio 3A de proteína (Brn3a)^16,19,22.

Resultados

Os seguintes resultados em ratos¹⁸ e ratos¹⁶ foram anteriormente relatados e são resumidos aqui. A sutura circumlimbal produziu um padrão semelhante de elevação IOP em ratos e camundongos (Figura 2). Um breve spike IOP, até 58,1 ± 2,7 mmHg em ratos e 38,7 ± 2,2 mmHg em camundongos, verificou-se imediatamente após o procedimento de sutura. Em ratos, magnitude IOP gradualmente reduzida ao longo do tempo a ...

Discussão

A sutura de circumlimbal é um novo modelo de hipertensão ocular crônica. Além dos estudos, do qual os resultados representativos são oriundos de^16,18, este modelo animal tem sido utilizado em uma série de recentes estudos^{15,23,24,25 ,26}. Comparação entre estes relatórios anteriores mostra que...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
normal saline	Baxter International Inc	AHB1323	Maintain corneal hydration during surgery
Chlorhexadine 0.5%	Orion Laboratories	27411, 80085	Disinfection of surgical instrument
Isoflurane 99.9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for suture procedure
ocular lubricant	Alcon Laboratories	1618611	Proprietory Name: Genteal, ocular lubricant to keep the other eye moist
Needle holder (microsurgery)	World Precision Instruments	555419NT	To hold needle during ocular surgery
Proxymetacaine 0.5%	Alcon Laboratories	CAS 5875-06-9	Topical ocular analgesia
Scissors (microsurgery)	World Precision Instruments	501232	To cut excessive suture stump during ligation
Surgical drape	Vital Medical Supplies	GM29-612EE	Ensure sterile enviornment during surgery
Suture needle for rats (microsurgery)	Ninbo medical needles	151109	8-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Suture needle for mice (microsurgery)	Ninbo medical needles	160905	10-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Tweezers (microsurgery)	World Precision Instruments	500342	Manipulate tissues during ocular surgery
rebound tonometer	TONOLAB, iCare, Helsinki, Finland	TV02	for intraocular pressure monitoring