JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

יתר לחץ דם כרוני עינית הנגרמת על-ידי החלת בתפר circumlimbal אצל חולדות ועכברים, שמוביל התדרדרות תפקודית ומבניים של תאי גנגליון עקבית עם גלאוקומה.

Abstract

התפר circumlimbal היא טכניקה להשראת גלאוקומה ניסויים בחולדות מאת כרוני העלאת לחץ תוך-עיני (IOP), מהווה גורם סיכון ידוע גלאוקומה. פרוטוקול זה מדגים מדריך צעד אחר צעד על טכניקה זו אוונס ארוך חולדות ועכברים C57BL/6. בהרדמה כללית, suture "הארנק-string" מוחל על הלחמית, סביב קו המשווה, מאחורי של לימבוס של העין. העין עמית משמש פקד ללא טיפול. על-פני משך המחקר, אשר היה תקופה של 8 שבועות עבור חולדות 12 שבועות עבור עכברים, IOP נשארו גבוהות, כפי שהיא נמדדת בקביעות ריבאונד tonometry חיות בהכרה ללא הרדמה מקומי. בשני המינים, העיניים sutured הראו תכונות electroretinogram בקנה אחד עם מועדף בתפקוד ברשתית הפנימי. טומוגרפיה אופטית קוהרנטית הראה דליל סלקטיבי של שכבת סיבי עצב ברשתית. היסטולוגיה של הרשתית חולדה בתוך שטח חתך נמצאו מופחת צפיפות התאים בשכבת תאי גנגליון, אך אין שינוי ברבדים אחרים התאית. כתמים retinae עכבר שטוח רכוב עם גנגליון תא מסוים סמן (RBPMS) אישר אובדן תאי גנגליון. התפר circumlimbal היא פשוטה, מינימלית פולשנית וחסכונית לזירוז עינית יתר לחץ דם מוביל לפגיעה תא גנגליון אצל חולדות ועכברים.

Introduction

מודלים בעלי חיים מספקים שפלטפורמה חשוב לחקירה מעבדה הסלולר תהליכים כבסיס גלאוקומה פתוגנזה, כמו גם להעריך ולאתר פוטנציאליים התערבויות טיפוליות. מספר מודלים inducible פותחו כדי לייצר ממושכת לחץ תוך-עיני (IOP) גובה, גורם הסיכון החשוב ביותר גלאוקומה. שיטות שהוחלו להעלות את רמת IOP כוללות: הזרקת מלוחים hypertonic ב episcleral הוורידים1, photocoagulation לייזר של trabecular meshwork2 או של ורידים limbal3, ו intracameral הזרקה של חומרים כגון תאי דם רפאים אדום4, גרגרי5,6 ו- viscoelastic סוכנים7. בכל אחת מהגישות יש יתרונות ומגבלות שלה.

מודל לגלוקומה צריך לחקות תהליך המחלה, עם סיבוך מינימליות כגון טראומה, דלקת ומדיה לאטימות. סיבוכים אלה הקשורים לעתים קרובות עם ההליכים המשמש לזירוז IOP העלאת, יכולים לבלבל פרשנות של תוצאות. לדוגמה, paracentesis החדר הקדמי, גם כאשר חומרים זרים לא הציג, הוכח לגרום טראומה ודלקת אינה מייצגת טיפוסית השינוי glaucomatous8,9. מעבר לחשיבות של הימנעות דלקת, שמירה על בהירות אופטית מקלה ויוו הדמיה electrophysiology לעקוב אחר התקדמות המחלה. לא ברור באיזו מידה סיבוכים אלה עלולים להשפיע על המחלה חקירות, ואולי כדאי להימנע חודר לעין במהלך אינדוקציה דגם. הגישה תפר circumlimbal מונע חדירה של כדור הארץ ומקל ויוו הערכה האורך של רשתית מבנה ותפקוד. חשוב מכך, מודל זה שונה מקודמותיה מבחינת יכולתה כדי לחזור IOP ערכים של תוכנית בסיסית על ידי הסרה של התפר בעת הצורך. IOP נרמול עשוי להיות שימושי עבור הלומדים הסלולר והתא ה"מפה מולקולרית של גנגליון הפיכים ובלתי הפיכה פציעה10,11,12,13,14.

מאמר זה מתמקד בטכניקה עבור אינדוקציה דגם. אפיון לפגיעה ברשתית המושרה על ידי מודל זה אצל חולדות ועכברים ניתן למצוא בפירוט רב יותר במקום אחר15,16,17,18,19.

Protocol

כל ההליכים ניסיוני נערכו על פי קוד האוסטרלי של התרגול על טיפוח ועל השימוש של בעלי חיים למטרות מדעיות, שקבע את הבריאות הלאומיים ואת המועצה למחקר רפואי באוסטרליה. אתיקה אישור היה המתקבלים ועדת האתיקה הווארד חיה מכון Florey (אישור מספר 13-044-אום ו 13-068-אום על חולדות ועכברים, בהתאמה).

1. מדידת לחץ תוך-עיני בחולדות בהכרה

  1. הגדר את tonometer ריבאונד מעבדה עכברוש. לחתל את החולדה ער ב חתיכה של בד רך כדי. להרגיע את החיה. חושפים את הראש והצוואר. החזק בעדינות את הגוף ביד אחת, עם הגב של החיה נח נגד החזה של החוקר.
    הערה: הרדמה מקומי אינו נדרש.
  2. תשתמש ביד השנייה כדי להביא את tonometer ריבאונד ליד העין של החולדה, כך הקצה של המכשיר IOP הוא כ 2-3 מ מ משם ו בניצב אל השיא הקרנית. להשתמש יד ימין כדי למדוד IOP של החיה עין ימין, יד שמאל על העין השמאלית.
  3. המתן מספר שניות את העכברוש את תירגע ולחץ על לחצן מדידה פעם. להתבונן שהקצה של החללית IOP בעדינות הכה את איפקס הקרנית פעם; צ'רלי ריבאונד tonometer פעם.
    הערה: צפצוף בודד של tonometer מאשר מדידה מוצלחת, אשר ניתן לקרוא במסך ה-LCD... צפצוף זוגי מציין שגיאת המדידה. שגיאות המדידה יכול לנבוע מגורמים כגון ומרחק עבודה לא הולמת בין החללית ו הקרנית, הטיה מוגזמת בכיוון של tonometer, או המכשיר בולט העפעף או חלק-מרכז הקרנית. עיין במדריך tonometer ריבאונד של היצרן לקבלת פרטים נוספים אודות שגיאות מדידה.
  4. חזור על שלב 1.3 עשר פעמים במרווח של 1-2 שניות, מ מדידות אלה להפיק ערך IOP הממוצע לאותה נקודה בזמן. לאפס את tonometer לאחר הקריאהth 5.
  5. לניטור טורי, למדוד IOP באותו הזמן של היום, תחת תנאי תאורה עקבי כדי למזער את הווריאציה בשל ההשתנות היומית IOP מחזור20,21.

2. מדידת לחץ תוך-עיני בעכברים בהכרה

  1. הגדר את tonometer ריבאונד העכבר לפי הוראות היצרן.
  2. כדי לרסן את העכבר ביד, למקם את העכבר על גבי כלוב גריל ומשוך בעדינות את הזנב לאחור.
    הערה: זה יבקש החיה כדי אחיזה על הגריל מתכת עם הרגליים הקדמיות שלה ניסיון למשוך את עצמו קדימה, אשר יהיה מעט למתוח את הגוף שלה.
    1. השתמש ובשניה לאחוז את עור רפוי מיד מאחורי האוזניים. לאבטח הגוף התחתון של החיה על ידי החזקת את הזנב בין הקמיצה והאמה (או בין האצבע הקטנה בכף ידך).
      הערה: לא לנסות לתפוס את העור חזק מדי, כדי למנוע חנק, הפעלת לחץ על העיניים.
  3. עם יד חופשית עכשיו (בתחילה להחזיק את הזנב), להביא את tonometer ריבאונד ליד העין של העכבר, כך הקצה של המכשיר IOP הוא כ 2-3 מ מ מ, בניצב אל השיא הקרנית. כדי למדוד את העין השנייה, לסובב את העכבר כך שהעין השניה היא כעת בפני tonometer.
  4. המתן בעכבר כדי להרגיע ולחץ על לחצן מדידה אחת. להתבונן שהקצה של החללית IOP להכות בעדינות הקרנית השיא; עם צפצוף בודד מאשר מדידה מוצלחת.
    הערה: צפצוף זוגי מציינת שגיאת המדידה. זה עשוי לעזור כדי יש הנסיין קריאה של המסמך השני המקראות IOP בזמן הנסיין הראשון לוקח את המידות.
  5. חזור על שלב 2.4 להשיג 10 קריאות מצליח להפיק IOP. לאפס את tonometer לאחר הקריאהth 5. לאפשר מרווח של 1-2 שניות בין קריאות.
  6. בהתאם מידה טורי בחולדות, למדוד העכבר IOP באותו זמן של היום, תחת תנאי תאורה עקבית.

3. אינדוקציה של העלאת לחץ תוך-עיני ומורדמת חולדות ועכברים

  1. לנקות את הספסל כירורגית עם chlorhexidine 0.5%-70% אתנול. לכסות על הספסל עם תחבושות חיטוי. אוטוקלב כל ציוד כירורגי מראש. ודא שניסויים כל ללבוש ציוד מגן אישי המתאים (מסכות כירורגיות, חלוקים וכפפות מעוקר).
  2. כדי לגרום הרדמה כללית, מקם את החיה תא אינדוקציה. לספק 3-3.5% איזופלוריין עם O2 בספיקה של 3 L/min.
    1. לשמור על הרדמה עם איזופלוריין 1.5%-2 ל'/min מועברת באמצעות מסיכת פנים מכרסם לאורך כל הניתוח. להבטיח עומק מספיק של הרדמה בגלל היעדר רפלקס הפינצ כפת.
    2. הימנע הנשימה על ידי התאמת קצב הזרימה בעת הצורך לשמור על קצב הנשימה כ 60 נשימות לדקה.
  3. לבחור באקראי עין אחת כדי לגרום לחץ בעין, עם העין contralateral לשמש פקד ללא טיפול. להקנות טיפה אחת של 0.5% proxymetacaine אופטלמולוגיות פתרון אקטואלי הרדמה. כדי לנקות את השטח עינית, לשטוף את העין עם 3 מ"ל של תמיסת סטרילית.
  4. מכסים את החיה עם סטרילי, fenestrated תלוי כירורגי, חשיפת העין כדי להיות sutured.
  5. מבצע מחרוזת-הארנק בתפר לחמית bulbar ברחבי העולם. בחולדות, לארוג את 7/0 תפר ניילון מקבילים ו 2 מ"מ אחורי לימבוס (איור 1). בעכברים, מקם את התפר ניילון 10/0-1 מ מ, האחורי לימבוס.
    1. . שמור על עצמך לא לחדור את sclera. התרחבות האישון פתאומי במהלך הליך כירורגי מציין ש-sclera ככל הנראה כבר חדרה.
    2. עוגן התפר על לחמית באמצעות 5-6 נקודות עיגון בחולדות, ו- 4-5 נקודות עיגון בעכברים.
    3. להימנע דחיסה ישירה על הורידים episcleral הגדולות להשחיל את התפר מתחת הלחמית במעבר של ורידים אלה.
      הערה: בעוד אנו ממליצים על הימנעות דחיסה של הווריד episcleral הגדולות של אצל חולדות, זה לא שגרתי נעשה בעכברים עקב הנראות הנמוכה של ורידים אלה בעיני העכבר. אף-על-פי הורידים הגדולים שאינם דחוסים ישירות, סביר להניח כי כלי קטן בתוך מקלעת וריד episcleral הם תחת לחץ, אשר עשוי להיות גורם תורם גובה IOP מתמשכת (ראה דיון מנגנון של העלאת IOP).
  6. הדקו את התפר מחרוזת-הארנק על ידי קשירת קשר ואז ואחריו קשר פשוט השני (איור 1). כדי להימנע של ספייק IOP לאחר ניתוח גבוהה יתר על המידה, יש עוזרת למדוד את IOP מיד לפני לחיזוק הקשר השני.
    1. אם IOP נמצא להיות גבוה מדי, להתאים את הקשר slip חלקית משחררים את המתח על קצה אחד של התפר (חץ איור 1א').
    2. לאחר IOP הרצויה מושגת (אידיאלי 30-60 מ מ כספית חולדות או 30-40 מ מ כספית בעכברים), לקשור את הקשר השני תוך שמירה על כוח מושך רציפה על החלק התפר (חץ באיור 1).
    3. לאחר הטיפול השני הודקה קשר, לקצץ את הקצוות של התפר כדי למזער את כל תחושות גוף זר. נטר את החיה במהלך להתאושש הרדמה כללית.
      הערה: חשוב להשתמש את סליפנוט בעת קשירת הקשר הראשון כדי להבטיח דחיסה פנימה נאותה על העין. לאחר מספר שבועות בדרך כלל יצויין כי הקצוות הופכים למוטבעים בלחמית.

4. ניטור IOP

  1. לקחת את המידה IOP הראשון ב 2 דקות וכאב לאחר הניתוח בהרדמה איזופלוריין. לאחר מכן, לפקח IOP כאשר למכרסמים שהכרתו לפי השלבים הנ ל 1 ו- 2.
    הערה: לפקח על IOP פעמיים במהלך היום הראשון (2 דקות ו- 1 שעה), מדי יום בשבוע הראשון, פעם או פעמיים בשבוע לאחר מכן.

5. assaying רשתית מבנה ותפקוד

  1. בנקודה הרצויה ניסיוני הקצה (במקרה זה לאחר 8 שבועות אצל חולדות ו- 12 שבועות בעכברים), בהרדמה כללית, באמצעות הזרקת בקרום הבטן עם קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים, למדוד פונקציה ברשתית עם electroretinogram dark-adapted (ארג) כמתואר בפירוט רב יותר במקום אחר15,16,17.
    הערה: מצאנו חזקים בתפקוד תאי גנגליון, סיבי עצב ברשתית דליל שכבה, גנגליון תא הפסד עבור משכי זמן בין 8-12 שבועות. אחרים בהצלחה המועסקים תקופות ארוכות יותר של IOP העלאת14,15.
  2. מיד לאחר המדידה ארג, למדוד את העובי של שכבה סיבי עצב ברשתית (RNFL) ועובי הרשתית הכולל שימוש בתחום ספקטרלי קוהרנטיות אופטית טומוגרפיה (SD-אוקטובר) 16,18.
  3. בסוף המחקר האורך, המתת חסד החיות תחת הרדמה עמוקה.
    1. לנתח הרשתית היסטולוגיה18, לדוגמה immunostaining של רשתית העין כולה-הר באמצעות נוגדן ספציפי של התא (מהרשות לשיקום האסיר) גנגליון כגון מחייב RNA חלבון עם נוגדן splicing (RBPMS) או התחום הספציפי המוח גנים homeobox/POU מרובים חלבון 3A19,16,(Brn3a)22.

תוצאות

התוצאות הבאות חולדות ועכברים של18 16 דווחו בעבר, מסוכמות כאן. התפר circumlimbal המיוצר דפוס דומה של העלאת IOP אצל חולדות ועכברים (איור 2). יתד IOP קצרה, עד 58.1 מ מ כספית ± 2.7 בחולדות, 38.7 מ מ כספית ± 2.2 בעכברים, נמצאה מיד לאחר הניתוח תפר. בחולדות, IOP ?...

Discussion

התפר circumlimbal הוא מודל חדש של יתר לחץ דם כרוני עינית. בנוסף המחקרים שממנו התוצאות נציג הן מתוצרת16,18, מודל זה בעל חיים יש כבר מנוצל במספר האחרונות מחקרים15,23,24,25 ,26. מההשווא?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו ממומן על ידי הלאומי לבריאות ואת מועצת המחקר הרפואי של אוסטרליה פרויקט גרנט (1046203), מחקר אוסטרלי המועצה העתיד לאגודה (FT130100338).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
normal salineBaxter International IncAHB1323Maintain corneal hydration during surgery
Chlorhexadine 0.5%Orion Laboratories27411, 80085Disinfection of surgical instrument
Isoflurane 99.9%Abbott Australasia Pty LtdCAS 26675-46-7Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for suture procedure
ocular lubricantAlcon Laboratories 1618611Proprietory Name: Genteal, ocular lubricant to keep the other eye moist
Needle holder (microsurgery)World Precision Instruments555419NTTo hold needle during ocular surgery
Proxymetacaine 0.5%Alcon Laboratories CAS 5875-06-9Topical ocular analgesia
Scissors (microsurgery)World Precision Instruments501232To cut excessive suture stump during ligation
Surgical drapeVital Medical SuppliesGM29-612EEEnsure sterile enviornment during surgery
Suture needle for rats (microsurgery)Ninbo medical needles1511098-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Suture needle for mice (microsurgery)Ninbo medical needles16090510-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Tweezers (microsurgery)World Precision Instruments500342Manipulate tissues during ocular surgery
rebound tonometerTONOLAB, iCare, Helsinki, FinlandTV02for intraocular pressure monitoring

References

  1. Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
  2. Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  3. Chiu, K., Chang, R., So, K. F. Laser-induced chronic ocular hypertension model on SD rats. Journal of Visualized Experiments. (10), 549 (2007).
  4. Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. I. Production of elevated intraocular pressure by anterior chamber injection of autologous ghost red blood cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 19 (2), 126-136 (1980).
  5. Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  6. Weber, A. J., Zelenak, D. Experimental glaucoma in the primate induced by latex microspheres. Journal of Neuroscience Methods. 111 (1), 39-48 (2001).
  7. Moreno, M. C., et al. A new experimental model of glaucoma in rats through intracameral injections of hyaluronic acid. Experimental Eye Research. 81 (1), 71-80 (2005).
  8. Hoyng, P. F., Verbey, N., Thorig, L., van Haeringen, N. J. Topical prostaglandins inhibit trauma-induced inflammation in the rabbit eye. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (8), 1217-1225 (1986).
  9. Kezic, J. M., Chrysostomou, V., Trounce, I. A., McMenamin, P. G., Crowston, J. G. Effect of anterior chamber cannulation and acute IOP elevation on retinal macrophages in the adult mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (4), 3028-3036 (2013).
  10. Waisbourd, M., et al. Reversible structural and functional changes after intraocular pressure reduction in patients with glaucoma. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (6), 1159-1166 (2016).
  11. Foulsham, W. S., Fu, L., Tatham, A. J. Visual improvement following glaucoma surgery: a case report. BMC Ophthalmology. 14, 162 (2014).
  12. Anderson, A. J., Stainer, M. J. A control experiment for studies that show improved visual sensitivity with intraocular pressure lowering in glaucoma. Ophthalmology. 121 (10), 2028-2032 (2014).
  13. Ventura, L. M., Feuer, W. J., Porciatti, V. Progressive loss of retinal ganglion cell function is hindered with IOP-lowering treatment in early glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 659-663 (2012).
  14. Zhao, D., et al. ARVO abstract number 3696 - B0043. annual meeting of Association for Research in Vision and Ophthalmology, Honolulu, Hawaii, USA. , (2018).
  15. Liu, H. H., et al. Chronic ocular hypertension induced by circumlimbal suture in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 2811-2820 (2015).
  16. Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, 41 (2017).
  17. Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
  18. Van Koeverden, A. K., He, Z., Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Systemic hypertension is not protective against chronic IOP elevation in a rodent model. Scientific Reports. 8 (1), 7107 (2018).
  19. Rodriguez, A. R., de Sevilla Muller, L. P., Brecha, N. C. The RNA binding protein RBPMS is a selective marker of ganglion cells in the mammalian retina. Journal of Comparative Neurology. 522 (6), 1411-1443 (2014).
  20. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Twenty-four-hour pattern of mouse intraocular pressure. Exp Eye Research. 77 (6), 681-686 (2003).
  21. Jia, L., Cepurna, W. O., Johnson, E. C., Morrison, J. C. Patterns of intraocular pressure elevation after aqueous humor outflow obstruction in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (6), 1380-1385 (2000).
  22. Nadal-Nicolas, F. M., Jimenez-Lopez, M., Sobrado-Calvo, P., Nieto-Lopez, L., Canovas-Martinez, I., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo, M. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
  23. Liu, H. H., Flanagan, J. G. A Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension Induced by Circumlimbal Suture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 353-361 (2017).
  24. Liu, H. H., He, Z., Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Reversal of functional loss in a rat model of chronic intraocular pressure elevation. Ophthalmic & Physiological Optics. 37 (1), 71-81 (2017).
  25. Liu, H. H., Zhang, L., Shi, M., Chen, L., Flanagan, J. G. Comparison of laser and circumlimbal suture induced elevation of intraocular pressure in albino CD-1 mice. PLoS One. 12 (11), 0189094 (2017).
  26. Shen, H. H., et al. Intraocular Pressure Induced Retinal Changes Identified Using Synchrotron Infrared Microscopy. PLoS One. 11 (10), 0164035 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140circumlimbal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved