JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kronik oküler hipertansiyon circumlimbal dikiş sıçanlar ve fareler, Retina ganglion hücrelerinin glokom ile tutarlı fonksiyonel ve yapısal bozulma yol uygulayarak indüklenen.

Özet

Circumlimbal dikiş Rodents deneysel glokom kronik göz içi basıncı (gib), glokom için iyi bilinen bir risk faktörü yükselen tarafından inducing bir tekniktir. Bu iletişim kuralı bir adım adım kılavuz bu teknikte uzun Evans sıçanlar ve C57BL/6 fareler üzerinde gösterir. Genel anestezi altında "çanta-dize" dikiş konjonktiva, Ekvator çevresinde ve limbus gözün arkasında uygulanır. Adam göz tedavi edilmemiş bir denetimi olarak hizmet vermektedir. 8 hafta boyunca fareler ve fareler için 12 haftalık bir süre oldu, bizim çalışma süresi boyunca düzenli olarak rebound tonometry topikal anestezi olmadan bilinçli hayvanlarda tarafından ölçülen IOP yükseltilmiş, kaldı. Her iki tür dikilmiş gözleri electroretinogram özellikleri Tercihli iç Retina fonksiyon bozukluğu ile tutarlı gösterdi. Optik koherens tomografi seçici retina sinir lifi tabakası inceltme gösterdi. Kesit buldum sıçan retinada Histoloji ganglion hücre katmanı hücre yoğunluğu, ama herhangi bir değişiklik diğer hücresel katmanları azaltılmış. Fare düz monte retinae bir ganglion hücre belirli marker ile (RBPMS) boyama ganglion hücre kaybı doğruladı. Basit, minimal invaziv ve maliyet-etkin şekilde sıçanlar ve fareler ganglion hücre yaralanmalara yol açar oküler hipertansiyon neden circumlimbal dikiş var.

Giriş

Hayvan modelleri cep laboratuvar incelenmesi için önemli bir platform potansiyel terapötik müdahaleler değerlendirmek için de temel glokom Patogenez işler sağlar. Birkaç indüklenebilir modelleri sürekli göz içi basıncı (gib) yükseklik, glokom için en önemli risk faktörü üretmek için geliştirilmiştir. GİB yükseltmek için uygulanan yöntemler içerir: episcleral hipertonik serum fizyolojik yerleştirmeye damarlar1, laser photocoagulation trabeküler meshwork2 veya3limbal damarlar ve intracameral enjeksiyon gibi maddelerin hayalet kırmızı kan hücreleri4, lastikteki5,6 ve viskoelastik ajanlar7. Her yaklaşımın avantajları ve sınırlamalar vardır.

Glokom için iyi bir model travma, inflamasyon ve medya opaklıklar gibi minimal komplikasyon ile hastalık süreci taklit. Bu komplikasyonlar IOP ayrıcalık ikna etmek için kullanılan yordamlar ile sık sık ilişkili olan ve sonuçların yorumlanması yıkmak. Örneğin, hatta yabancı maddelerin tanıtıldı değil zaman parasentez ön odasının travma ve tipik glaucomatous değişiklik8,9/ göstermemektedir iltihap neden olduğu gösterilmiştir. İltihap kaçınarak önemini yanı sıra vivo içinde görüntüleme ve hastalık ilerleme izlemek için Elektrofizyoloji optik netlik bakımı kolaylaştırır. Ne ölçüde belirsiz olmasına rağmen bu komplikasyonlar hastalığı araştırmalar, etkileyebilir modeli indüksiyon sırasında göz penetran önlemek için daha iyi olabilir. Circumlimbal dikiş yaklaşım dünya nüfuz önler ve Retina yapısı ve fonksiyonu içinde vivo boyuna değerlendirilmesi kolaylaştırır. Daha da önemlisi, öncekilerin kapasitesini IOP temel değerleri için gerektiğinde dikiş kaldırma tarafından elde etmek için bu modeli farklıdır. GİB normalleştirme hücresel eğitim için yararlı olabilir ve geri dönüşümlü ve geri dönüşümsüz ganglion moleküler ilişkilendirir yaralanma10,11,12,13,14hücre.

Bu makale modeli indüksiyon için teknik üzerinde duruluyor. Bu modelde sıçanlar ve fareler tarafından indüklenen Retina yaralanma karakterizasyonu15,16,17,18,19daha ayrıntılı olarak başka bir yerde bulunabilir.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler Avustralya uygulama kodu göre bakım ve kullanım hayvanlar için bilimsel amaçlar, Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi tarafından Avustralya'da ayarlamak için yapılmıştır. Etik onay Howard Florey Enstitüsü hayvan Etik Komitesi elde edilen (onay numarasını 13-044-UM ve 13-068-UM sıçanlar ve fareler, sırasıyla).

1. göz içi basıncı ölçüm bilinçli sıçanlarda

  1. Laboratuvar rebound tonometer sıçan ayarlayın. Bir hayvan sakinleştirmeye yumuşak bez parçası uyanık köstebeğiyle sarmak. Baş ve boyun ortaya çıkarmak. Yavaşça gövde hayvanın arka araştırmacı'nın göğüs karşı istirahat ile bir elinde tutun.
    Not: Topikal anestezi gerekli değildir.
  2. Böylece IOP sonda ucu yaklaşık 2-3 mm uzak ve dikey kornea apex öte yandan rebound tonometer sıçan eye yakınındaki getirmek için kullanabilirsiniz. Sağ el hayvanın sağ göz ve sol el sol göz için IOP ölçmek için kullanın.
  3. Sakin ol ve ölçüm düğmesine bir kez basın için fareyi birkaç saniye bekleyin. GİB sonda ucu kornea apex hafifçe vurmak gözlemlemek; ve bir kez rebound tonometer bip sesi duyarsınız.
    Not: LCD ekrandan okunabilir başarılı ölçüm tonometer tek bir bip onaylar. Çift kişilik bir bip sesi bir ölçüm hatası gösterir. Ölçüm hataları uygun olmayan çalışma mesafesi gibi faktörlerden sonda ve kornea, tonometer veya göz kapağı veya kornea orta-parçası çarpıcı sonda yönde aşırı bir tilt arasında ortaya çıkabilir. Ölçüm hataları ile ilgili daha fazla ayrıntı için üreticiden rebound tonometer el kitabına başvurun.
  4. Adım 1.3 on kat 1-2 saniye aralıklarla tekrar ediyorum, o zaman noktası için bir ortalama GİB değeri bu ölçümler elde. Tonometer 5inci okuduktan sonra sıfırlayın.
  5. Seri kontrolü için aynı zamanda günün ve varyasyon diurnal IOP döngüsü20,21nedeniyle en aza indirmek için tutarlı ışık koşulları altında IOP ölçmek.

2. göz içi basıncı ölçüm bilinçli farelerde

  1. Rebound tonometer üreticisinin yönerge göre fare ayara getirin.
  2. Fare el ile bağlamak için bir ızgara kafes üstünde fareyi getirin ve yavaşça kuyruk geriye doğru çekin.
    Not: Bu hangi biraz onun beden streç olacak metal ızgara ön ayakları ve kendisini öne çekmek için girişimi ile kavrama için hayvan isteyecektir.
    1. Öte yandan gevşek deri hemen kulak arkasında kavramak için kullanın. Alt vücut hayvanın kuyruk (veya küçük parmak ve avuç arasında) yüzük parmağı ve orta parmak arasında tutarak güvenli.
      Not: boğulma ve göze uygulanan basınç önlemek için çok sıkı cilt kavramak değil deneyin.
  3. Şimdi serbest (başlangıçta kuyruk holding) el ile yaklaşık 2-3 mm den ve dikey kornea apex IOP sonda yolgösterendir rebound tonometer fare 's eye yakınındaki getirin. Diğer gözü ölçmek için fareyi diğer göz önünde tonometer artık döndürür.
  4. Sakin ve ölçüm düğmesine bir kez basın fare için bekleyin. GİB sonda ucu hafifçe kornea apex vurmak gözlemlemek; başarılı ölçüm doğrulayan tek bip sesi ile.
    Not: Çift kişilik bir bip sesi bir ölçüm hatası gösterir. Bu ilk deneyci ölçümleri alır iken bir ikinci deneyci okunur ve belge IOP okumalar için yardımcı olabilir.
  5. 2.4 bir IOP türetmek için on başarılı kaynaklar elde etmek için adımları yineleyin. Tonometer 5inci okuduktan sonra sıfırlayın. 1-2 saniye arasında okuma aralığı sağlar.
  6. Sıçanlarda seri ölçüm göre günün ve tutarlı ışık koşulları altında aynı zamanda fare IOP ölçmek.

3. indüksiyon göz içi basınç yüksekliği imzalat sıçanlar ve fareler

  1. Cerrahi kürsüye % 0.5 KLORHEKSİDİN % 70 etanol içinde ile temizleyin. Steril örtüler ile tezgah kapak. Otoklav tüm cerrahi ekipman önceden. Tüm Denemecileri uygun kişisel koruyucu ekipman (cerrahi maske, önlük ve steril eldiven) giymek emin olun.
  2. Genel anestezi ikna etmek için bir indüksiyon odasında hayvan yer. 3-%3,5 isoflurane O2 ile 3 L/dak debi teslim.
    1. Anestezi % 1.5 isoflurane, 2 L/dak teslim yolu ile ameliyat boyunca bir kemirgen yüz maskesi ile koruyun. Yeterli anestezi derinliği bir pençe çimdik refleks yokluğunda tarafından emin olun.
    2. Solunum depresyon akış hızı yaklaşık 60 nefes/dk solunum hızı korumak gerektiğinde ayarlayarak kaçının.
  3. Rastgele tedavi edilmemiş bir denetimi olarak hizmet etmek kontralateral göz ile oküler hipertansiyon ikna etmek için bir göz seçin. Bir damla % 0.5 proxymetacaine oftalmik çözüm topikal anestezi için aşılamak. Oküler yüzeyi temizlemek için göz 3 mL steril normal salin ile yıkayın.
  4. Bir steril, delikli okunur göz dikmiş için açığa cerrahi örtüsü, hayvanla kapsar.
  5. Çanta-dize dikiş dünyadaki bulber konjonktiva gerçekleştirin. Rat, örgü 7/0 naylon dikiş paralel ve 2 mm arka limbus (Şekil 1). Farelerde, 10/0 naylon dikiş 1 mm limbus posterior yerleştirin.
    1. Sklera nüfuz değil için dikkat ediniz. Cerrahi işlem sırasında ani bir gözbebeği genişlemesi sklera büyük olasılıkla nüfuz gösterir.
    2. Çapa üzerinde 5-6 bağlantı noktalarını sıçanlarda ve 4-5 bağlantı noktalarını farelerde kullanarak konjonktiva dikiş.
    3. Büyük episcleral damarlar üzerinde doğrudan sıkıştırma bu damarlar geçiş, konjonktiva altında dikiş iş parçacığı tarafından kaçının.
      Not: Biz sıçanlarda büyük episcleral damar basısına kaçınarak tavsiye ederken, bu rutin olarak fareler fare gözleri bu damarlarda düşük görünürlük nedeniyle yapılır değil. Büyük damarları doğrudan sıkıştırılır değil olsa bile, bu küçük gemi episcleral ven pleksus içinde sürekli IOP yükseklik bir faktör olabilir baskı altındadır olasıdır (IOP yükseltme mekanizması için lütfen konuya bakın).
  6. Çanta-dize dikiş sonra ikinci bir basit düğüm (Şekil 1) tarafından takip slipknot bağlayarak sıkınız. Aşırı yüksek bir ameliyat sonrası IOP spike önlemek için hemen ikinci düğüm bağlama önce gib ölçmek bir yardımcınız olabilir.
    1. GİB yüksek bulunursa, kayma düğüm kısmen dikiş ( Şekil 1Aoku) bir ucunda gerginlik serbest bırakarak ayarlayın.
    2. İstenen gib elde sonra (ideal olarak fareler ya da 30-40 mmHg farelerde 30-60 mmHg) dikiş ( Şekil 1birok) sonuna sürekli bir çekme gücü korurken ikinci düğüm kapalı kravat.
    3. Sonra ikinci düğüm sıkılır, herhangi bir yabancı cisim hissi en aza indirmek için dikiş ucuna döşeme. Yeniden elde etmek--dan genel anestezi sırasında hayvan izlemek.
      Not: Slipknot ilk düğüm tying gözde yeterli içe sıkıştırma sağlamak kullanılacak önemlidir. Birkaç hafta sonra biter konjonktiva içinde gömülü olmak genellikle belirtilmektedir.

4. izleme IOP

  1. İlk gib ölçüm post-operatively isoflurane anestezi altında 2 dakika alır. Daha sonra kemirgen başı yukarıda belirtilen adım 1 ve 2 olarak kendine geldi gib izlemek.
    Not: günlük ilk hafta ve haftada bir veya iki kez bundan sonra iki kez ilk gün boyunca (2 dakika ile 1 saat), gib izlemek.

5. raporlaması Retina yapısı ve fonksiyonu

  1. İstenen deneysel bitiş noktası (Bu durumda 8 hafta içinde rats ve farelerde 12 hafta sonra), mayi enjeksiyon ketamin/xylazine ile kullanarak genel anestezi altında dark-adapted electroretinogram (ERG) ile retina fonksiyon açıklandığı gibi ölçmek daha ayrıntılı başka bir yerde15,16,17.
    Not: Sağlam bulduk ganglion hücre fonksiyon bozukluğu, retina sinir fiber katman inceltme ve ganglion hücre kaybı sürelerin 8-12 hafta arasında. Diğerleri başarıyla IOP ayrıcalık14,15uzun süre istihdam.
  2. ERG ölçüm sonra hemen, retina sinir lifi tabakası (RNFL) kalınlığı ve spektral etki alanı optik koherens tomografi (SD-Ekim) 16,18kullanarak toplam Retina kalınlık ölçer.
  3. Boyuna çalışmanın sonunda, derin anestezi altında hayvanlara ötenazi.
    1. Histoloji18, Bütün Dağı retina Retina ganglion hücre (RGC) spesifik antikor RNA-bağlayıcı protein gibi birden çok alışılageldik antikor (RBPMS) veya beyin özel homeobox/POU etki alanı ile kullanarak, örneğin immunostaining için retina incelemek protein 3A (Brn3a)16,19,22.

Sonuçlar

Sıçanlar fareler ve18 16 aşağıdaki sonuçlar daha önce bildirilmiştir ve burada özetlenen. Circumlimbal dikiş IOP yükseklik sıçanlar ve fareler (Şekil 2) benzer bir yol üretti. Bir kısa IOP spike, sıçanlarda ilâ 58.1 ± 2.7 mmHg ve 38.7 ± 2.2 mmHg farelerde, dikiş işlemden hemen sonra bulundu. Rat, gib büyüklüğü 44 ± 6 mmHg ve 32 ± 2 mm Hg, 3 ile 24 saat, sırasıyla...

Tartışmalar

Circumlimbal dikiş kronik oküler hipertansiyon yeni bir modeldir. Hangi kaynaklı16,18temsilcisi sonuçlarıdır çalışmalar yanı sıra, bir dizi son çalışmalar15,23,24,25 Bu hayvan modeli kullanıldığında vardır ,26. Bu önceki raporlar arasında karşılaştırma gösterir yöntemi yinel...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi Avustralya proje desteği (1046203), Avustralya Araştırma Konseyi gelecek Bursu (FT130100338) tarafından finanse edilmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
normal salineBaxter International IncAHB1323Maintain corneal hydration during surgery
Chlorhexadine 0.5%Orion Laboratories27411, 80085Disinfection of surgical instrument
Isoflurane 99.9%Abbott Australasia Pty LtdCAS 26675-46-7Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for suture procedure
ocular lubricantAlcon Laboratories 1618611Proprietory Name: Genteal, ocular lubricant to keep the other eye moist
Needle holder (microsurgery)World Precision Instruments555419NTTo hold needle during ocular surgery
Proxymetacaine 0.5%Alcon Laboratories CAS 5875-06-9Topical ocular analgesia
Scissors (microsurgery)World Precision Instruments501232To cut excessive suture stump during ligation
Surgical drapeVital Medical SuppliesGM29-612EEEnsure sterile enviornment during surgery
Suture needle for rats (microsurgery)Ninbo medical needles1511098-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Suture needle for mice (microsurgery)Ninbo medical needles16090510-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Tweezers (microsurgery)World Precision Instruments500342Manipulate tissues during ocular surgery
rebound tonometerTONOLAB, iCare, Helsinki, FinlandTV02for intraocular pressure monitoring

Referanslar

  1. Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
  2. Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  3. Chiu, K., Chang, R., So, K. F. Laser-induced chronic ocular hypertension model on SD rats. Journal of Visualized Experiments. (10), 549 (2007).
  4. Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. I. Production of elevated intraocular pressure by anterior chamber injection of autologous ghost red blood cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 19 (2), 126-136 (1980).
  5. Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  6. Weber, A. J., Zelenak, D. Experimental glaucoma in the primate induced by latex microspheres. Journal of Neuroscience Methods. 111 (1), 39-48 (2001).
  7. Moreno, M. C., et al. A new experimental model of glaucoma in rats through intracameral injections of hyaluronic acid. Experimental Eye Research. 81 (1), 71-80 (2005).
  8. Hoyng, P. F., Verbey, N., Thorig, L., van Haeringen, N. J. Topical prostaglandins inhibit trauma-induced inflammation in the rabbit eye. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (8), 1217-1225 (1986).
  9. Kezic, J. M., Chrysostomou, V., Trounce, I. A., McMenamin, P. G., Crowston, J. G. Effect of anterior chamber cannulation and acute IOP elevation on retinal macrophages in the adult mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (4), 3028-3036 (2013).
  10. Waisbourd, M., et al. Reversible structural and functional changes after intraocular pressure reduction in patients with glaucoma. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (6), 1159-1166 (2016).
  11. Foulsham, W. S., Fu, L., Tatham, A. J. Visual improvement following glaucoma surgery: a case report. BMC Ophthalmology. 14, 162 (2014).
  12. Anderson, A. J., Stainer, M. J. A control experiment for studies that show improved visual sensitivity with intraocular pressure lowering in glaucoma. Ophthalmology. 121 (10), 2028-2032 (2014).
  13. Ventura, L. M., Feuer, W. J., Porciatti, V. Progressive loss of retinal ganglion cell function is hindered with IOP-lowering treatment in early glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 659-663 (2012).
  14. Zhao, D., et al. ARVO abstract number 3696 - B0043. annual meeting of Association for Research in Vision and Ophthalmology, Honolulu, Hawaii, USA. , (2018).
  15. Liu, H. H., et al. Chronic ocular hypertension induced by circumlimbal suture in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 2811-2820 (2015).
  16. Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, 41 (2017).
  17. Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
  18. Van Koeverden, A. K., He, Z., Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Systemic hypertension is not protective against chronic IOP elevation in a rodent model. Scientific Reports. 8 (1), 7107 (2018).
  19. Rodriguez, A. R., de Sevilla Muller, L. P., Brecha, N. C. The RNA binding protein RBPMS is a selective marker of ganglion cells in the mammalian retina. Journal of Comparative Neurology. 522 (6), 1411-1443 (2014).
  20. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Twenty-four-hour pattern of mouse intraocular pressure. Exp Eye Research. 77 (6), 681-686 (2003).
  21. Jia, L., Cepurna, W. O., Johnson, E. C., Morrison, J. C. Patterns of intraocular pressure elevation after aqueous humor outflow obstruction in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (6), 1380-1385 (2000).
  22. Nadal-Nicolas, F. M., Jimenez-Lopez, M., Sobrado-Calvo, P., Nieto-Lopez, L., Canovas-Martinez, I., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo, M. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
  23. Liu, H. H., Flanagan, J. G. A Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension Induced by Circumlimbal Suture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 353-361 (2017).
  24. Liu, H. H., He, Z., Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Reversal of functional loss in a rat model of chronic intraocular pressure elevation. Ophthalmic & Physiological Optics. 37 (1), 71-81 (2017).
  25. Liu, H. H., Zhang, L., Shi, M., Chen, L., Flanagan, J. G. Comparison of laser and circumlimbal suture induced elevation of intraocular pressure in albino CD-1 mice. PLoS One. 12 (11), 0189094 (2017).
  26. Shen, H. H., et al. Intraocular Pressure Induced Retinal Changes Identified Using Synchrotron Infrared Microscopy. PLoS One. 11 (10), 0164035 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T psay 140hayvan modeliglokomcircumlimbal dikig z i i bas nckronik ok ler hipertansiyonRetina ganglion h crelerinin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır