Un modelo de Glaucoma inducido por sutura de Circumlimbal en ratas y ratones

Resumen

La hipertensión ocular crónica se induce mediante la aplicación de una sutura de circumlimbal en ratas y ratones, llevando al deterioro funcional y estructural de las células ganglionares de la retina compatibles con glaucoma.

Resumen

La sutura de circumlimbal es una técnica para inducir glaucoma experimental en roedores crónico elevando la presión intraocular (IOP), un conocido factor de riesgo para el glaucoma. Este protocolo muestra a una guía paso a paso sobre esta técnica en largo Evans ratas y ratones C57BL/6. Bajo anestesia general, se aplica una sutura en "jareta" en la conjuntiva, alrededor del Ecuador y por detrás del limbo del ojo. El ojo compañero sirve como un control no tratado. A lo largo de nuestro estudio, que fue un período de 8 semanas para ratas y 12 semanas para los ratones, IOP seguía elevada, regularmente medido por tonometría de rebote en animales conscientes sin anestesia tópica. En ambas especies, los ojos suturados demostraron electroretinograma características constantes con la disfunción retiniana interna preferencial. Tomografía de coherencia óptica demostró la reducción selectiva de la capa de fibra nerviosa retiniana. Histología de la retina de la rata en sección encontró reducido densidad celular en la capa de células ganglionares, pero ningún cambio en otras capas celulares. La coloración de las retinas de ratón montado en plano con un marcador específico de la célula del ganglio (RBPMS) confirmó la pérdida de células ganglionares. La sutura de circumlimbal es un simple, mínimamente invasiva y rentable manera de inducir hipertensión ocular que conduce a la lesión de la célula del ganglio en ratas y ratones.

Introducción

Los modelos animales proporcionan que una importante plataforma para la investigación del laboratorio de celular procesos de patogénesis subyacente de glaucoma, así como para evaluar las intervenciones terapéuticas potenciales. Varios modelos inducibles se han desarrollado para producir la elevación sostenida de la presión intraocular (PIO), el más importante factor de riesgo para el glaucoma. Los métodos que se han aplicado para elevar IOP incluyen: inyección de solución salina hipertónica en episcleral venas¹, fotocoagulación con láser de la malla trabecular² o de la venas limbal³y la inyección intracameral de sustancias tales como Ghost roja glóbulos⁴, microbeads^5,6 y viscoelástico agentes⁷. Cada enfoque tiene sus ventajas y limitaciones.

Un buen modelo para el glaucoma debe imitar el proceso de la enfermedad, con mínima complicación como opacities trauma, inflamación y los medios de comunicación. Estas complicaciones están frecuentemente asociadas con los procedimientos utilizados para inducir la elevación del IOP y pueden confundir la interpretación de los resultados. Por ejemplo, paracentesis de cámara anterior, incluso cuando no se introducen sustancias extrañas, ha demostrado causar trauma e inflamación que no es representativa de cambio glaucomatoso típico^8,9. Además de la importancia de evitar la inflamación, mantener la claridad óptica facilita en vivo imagen y electrofisiología para monitorear la progresión de la enfermedad. Aunque no está claro hasta qué punto estas complicaciones pueden afectar las investigaciones de la enfermedad, puede ser mejor evitar penetrar el ojo durante la inducción del modelo. El enfoque de sutura circumlimbal evita la penetración del globo y facilita en vivo evaluación longitudinal de la estructura retiniana y función. Más importante aún, este modelo difiere de los anteriores en su capacidad para volver IOP a valores basales por retiro de la sutura cuando sea necesario. Normalización de la PIO puede ser útil para el estudio celular y moleculares correlativos de ganglio reversible e irreversible de la célula lesión^{10,11,12,13,14}.

Este artículo se centra en la técnica para la inducción del modelo. Caracterización de la lesión retiniana inducida por este modelo en ratas y ratones se puede encontrar en mayor detalle en otra parte^{15,16,17,18,19}.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo según el código australiano de prácticas para el cuidado y uso de animales para fines científicos, establecido por la salud nacional y el Consejo de investigación médica en Australia. Se obtuvo aprobación ética del Comité de ética Animal Howard Florey Institute (aprobación número 13-044-UM y 13-068-UM para ratas y ratones, respectivamente).

1. medición de la presión intraocular en ratas conscientes

1. Ajuste el tonómetro de rebote de laboratorio sobre la posición de la rata. Empañar la rata despierta en un pedazo de tela suave para calmar al animal. Exponga la cabeza y el cuello. Sostenga suavemente el torso en una mano, con la parte posterior del animal apoyada en el pecho del investigador.
   Nota: La anestesia tópica no es necesaria.
2. Use la otra mano para traer el tonómetro de rebote cerca ojo de rata, para que la punta de la sonda IOP es aproximadamente 2-3 m m lejos de y perpendicular al ápice corneal. Use la mano derecha para medir la PIO en ojo derecho y mano izquierda para el ojo izquierdo del animal.
3. Espere unos segundos a la rata a la calma y pulse el botón de medición. Observar que la punta de la sonda IOP golpeó suavemente el ápice corneal. y escuche el tono de tonómetro de rebote una vez.
   Nota: Un solo sonido de lo tonometer confirma medida de éxito, que se puede leer en la pantalla LCD. Una doble señal acústica indica un error de medición. Errores de medición pueden surgir de factores tales como distancia de trabajo inadecuado entre la sonda y la córnea, una inclinación excesiva en la orientación de lo tonometer o la sonda llamativo el párpado o una parte no central de la córnea. Consulte el manual del tonómetro de rebote del fabricante para obtener información detallada sobre errores de medición.
4. Repita el paso 1.3 diez veces a intervalos de 1-2 segundos, de estas mediciones se derivan un valor promedio de la PIO para ese momento. Restablecer el tonómetro después de la lectura 5 del^th .
5. Para el control serial, medir IOP al mismo tiempo del día y bajo condiciones de iluminación constante para minimizar la variación de la PIO diurna ciclo^20,21.

2. medición de la presión intraocular en ratones conscientes

1. Ajuste el tonómetro de rebote a la posición del ratón según instrucciones del fabricante.
2. Para frenar con la mano el ratón, coloque el ratón en una jaula parrilla y tire suavemente de la cola hacia atrás.
   Nota: Esta forma indicará el animal para agarrar en la parrilla de metal con sus patas delanteras e intento tirar de sí mismo, que se extenderá ligeramente su cuerpo.
   1. Use la otra mano agarrar la piel suelta inmediatamente detrás de las orejas. Fije la parte inferior del cuerpo del animal mediante la celebración de la cola entre el dedo anular y el dedo medio (o entre el dedo meñique y la palma).
      Nota: No intente agarrar la piel demasiado apretada, para evitar asfixia y presión en los ojos.
3. Con la mano libre de ahora (inicialmente con la cola), traer el tonómetro de rebote cerca ojo de ratón, para que la punta de la sonda IOP es aproximadamente 2-3 mm de y perpendicular al ápice corneal. Para medir el otro ojo, gire el ratón para que el otro ojo está ahora delante de lo tonometer.
4. Espere a que el ratón para calmar y pulse el botón de medición. Observar que la punta de la sonda IOP golpeó suavemente el ápice de la córneo; con un solo pitido confirma medida de éxito.
   Nota: Un doble pitido indica un error de medición. Puede ayudar a tener un segundo experimentador Lea y documento de las lecturas de Pio mientras que el primer experimentador toma las mediciones.
5. Repita el paso 2.4 para obtener diez lecturas exitosas para derivar un IOP. Restablecer el tonómetro después de la lectura 5 del^th . Permite un intervalo de 1-2 segundos entre lecturas.
6. Según la medida de serie en ratas, medida ratón IOP al mismo tiempo del día y bajo condiciones de iluminación constantes.

3. inducción de la elevación de la presión Intraocular en anestesiados de ratas y ratones

1. Limpiar el Banco quirúrgico con clorhexidina 0,5% en etanol al 70%. Cubre el Banco con cortinas estériles. Autoclave de todo el equipo quirúrgico previamente. Asegúrese de que todos los experimentadores usan equipo de protección personal (mascarillas quirúrgicas, batas y guantes esterilizados).
2. Para inducir la anestesia, colocar al animal en una cámara de inducción. Entregar 3-3.5% isoflurano con O₂ con un caudal de 3 L/min.
   1. Mantener la anestesia con isoflurano de 1.5% en 2 L/min entregado a través de una mascarilla roedor a lo largo de la cirugía. Asegurar suficiente profundidad de la anestesia por la ausencia de un reflejo de la pizca de la pata.
   2. Evitar la depresión respiratoria mediante el ajuste de la velocidad de flujo cuando sea necesario para mantener la frecuencia respiratoria en respiraciones/min aproximadamente 60.
3. Seleccione al azar un ojo para inducir hipertensión ocular, con el ojo contralateral para servir como un control no tratado. Instilar una gota de solución oftálmica de proxymetacaine de 0.5% para anestesia tópica. Para limpiar la superficie ocular, enjuáguese el ojo con 3 mL de solución salina estéril normal.
4. Cubrir el animal con un paño quirúrgico estéril, fenestrado, exponiendo el ojo para ser suturado.
5. Realizar una sutura en jareta en la conjuntiva bulbar del mundo. En ratas, la armadura la paralela de la sutura de nylon 7/0 y 2 mm posterior al limbo (figura 1). En ratones, colocar la sutura de nylon 10/0 a 1 mm posterior al limbus.
   1. Tenga cuidado de no para penetrar en la esclera. Una repentina dilatación pupilar durante el procedimiento quirúrgico indica que la esclera probablemente ha sido penetrada.
   2. Anclaje de la sutura de la conjuntiva mediante puntos de anclaje de 5-6 en ratas y 4-5 puntos de anclaje en los ratones.
   3. Evitar compresión directa sobre las venas episcleral importante roscando la sutura por debajo de la conjuntiva en el cruce de estas venas.
      Nota: Aunque es aconsejable evitar la compresión de la vena episcleral principales en ratas, no rutinariamente para ello en los ratones debido a la poca visibilidad de estas venas en los ojos de ratón. A pesar de que no se comprimen directamente las venas grandes, es probable que los vasos más pequeños en el plexo de la vena episcleral bajo presión, que puede ser un factor que contribuye a la elevación sostenida de la PIO (ver discusión de mecanismo de elevación de Pio).
6. Fijar la sutura en jareta atando un slipknot seguido por un segundo nudo simple (figura 1). Para evitar un pico IOP posquirúrgica excesivamente alta, tiene asistente medir la presión intraocular inmediatamente antes de apretar el segundo nudo.
   1. Si la presión intraocular es demasiado alta, ajustar el nudo slip liberando parcialmente la tensión en un extremo de la sutura (flecha en figura 1A).
   2. Después de la presión intraocular deseada (idealmente 30-60 mmHg en 30-40 mmHg en ratones o en ratas), corbata de nudo segundo manteniendo una fuerza de tracción continua en ese extremo de la sutura (flecha en figura 1).
   3. Después del segundo nudo ha sido apretado, recorte los extremos de la sutura para minimizar cualquier sensación de cuerpo extraño. Vigilar el animal durante la recuperación de la anestesia general.
      Nota: Es importante utilizar el slipknot cuando haga el primer nudo para asegurar la adecuada compresión hacia el interior del ojo. Después de varias semanas generalmente se observa que los extremos se incrustan en la conjuntiva.

4. monitoreo de la PIO

1. Tomar la primera medición de la PIO en 2 minutos postoperatoriamente bajo anestesia isoflurano. Posteriormente, monitorear IOP cuando el roedor ha recuperado la conciencia según los mencionados pasos 1 y 2.
   Nota: Monitorear la presión intraocular dos veces durante el primer día (2 minutos y 1 hora), todos los días en la primera semana y una o dos veces por semana después de eso.

5. Análisis de la función y la estructura retiniana

1. En el experimental final punto deseado (en este caso después de 8 semanas en ratas y 12 semanas en ratones), bajo anestesia general usando inyección intraperitoneal con ketamina/xilacina, medir la función retiniana con el oscuro-adaptado electroretinograma (ERGIO) como se describe en mayor detalle en otra parte^15,16,17.
   Nota: Hemos encontrado sólidas disfunción de las células del ganglio, adelgazamiento de capa de fibra retiniano nervio y del ganglio celular pérdida para duraciones entre 8-12 semanas. Otros han empleado con éxito períodos de elevación de Pio^14,15.
2. Inmediatamente después de la medición de la ERG, mida el espesor de capa de fibras nerviosas retinianas (RNFL) y grosor retiniano total uso de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) la tomografía ^16,18.
3. Al final del estudio longitudinal, eutanasia a los animales bajo anestesia profunda.
   1. Diseccionar la retina para histología¹⁸, por ejemplo el immunostaining de retina entera de montaje utilizando un anticuerpo específico de la célula (RGC) ganglionares de la retina tales como proteína de unión a RNA con múltiples anticuerpos que empalma (RBPMS) o específicas del cerebro de la caja homeo/POU dominio la proteína 3A (Brn3a)^16,19,22.

Resultados

Los siguientes resultados en ratas ratones y^{18 16} se han divulgado previamente y se resumen aquí. La sutura de circumlimbal produce un patrón similar de la elevación del IOP en ratas y ratones (figura 2). Un breve aumento IOP, hasta 58.1 ± 2,7 mmHg en ratas y 38,7 ± 2.2 mmHg en ratones, se encontró inmediatamente después del procedimiento de sutura. En ratas, magnitud IOP reduce gradualmente con el tiempo...

Discusión

La sutura de circumlimbal es un nuevo modelo de la hipertensión ocular crónica. Además de los estudios de que los resultados representativos son con^16,18, este modelo animal se ha utilizado en una serie de recientes estudios^{15,23,24,25 ,26}. Comparación a través de estos informes anteriores demues...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
normal saline	Baxter International Inc	AHB1323	Maintain corneal hydration during surgery
Chlorhexadine 0.5%	Orion Laboratories	27411, 80085	Disinfection of surgical instrument
Isoflurane 99.9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for suture procedure
ocular lubricant	Alcon Laboratories	1618611	Proprietory Name: Genteal, ocular lubricant to keep the other eye moist
Needle holder (microsurgery)	World Precision Instruments	555419NT	To hold needle during ocular surgery
Proxymetacaine 0.5%	Alcon Laboratories	CAS 5875-06-9	Topical ocular analgesia
Scissors (microsurgery)	World Precision Instruments	501232	To cut excessive suture stump during ligation
Surgical drape	Vital Medical Supplies	GM29-612EE	Ensure sterile enviornment during surgery
Suture needle for rats (microsurgery)	Ninbo medical needles	151109	8-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Suture needle for mice (microsurgery)	Ninbo medical needles	160905	10-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Tweezers (microsurgery)	World Precision Instruments	500342	Manipulate tissues during ocular surgery
rebound tonometer	TONOLAB, iCare, Helsinki, Finland	TV02	for intraocular pressure monitoring