Circumlimbal 缝合法诱导大鼠和小鼠青光眼模型的建立

摘要

慢性眼高压是在大鼠和小鼠中应用 circumlimbal 缝合, 导致视网膜神经节细胞与青光眼的功能和结构恶化。

摘要

circumlimbal 缝合是一种以慢性抬高眼压 (眼压) 诱发啮齿动物实验性青光眼的技术, 是一种众所周知的青光眼危险因素。该协议说明了该技术在长埃文斯大鼠和 C57BL/6 小鼠的分步指导。在全身麻醉下, 在结膜、赤道周围和眼睛的后缘上应用 "钱包绳" 缝合。他的眼睛是一个未经处理的控制。在我们的研究期间, 这是一个8周的老鼠和12周的老鼠, 眼压保持升高, 在有意识的动物的反弹测量定期测量没有局部麻醉。在这两种类型中, 缝合眼睛显示视网膜电图的特点与优先内视网膜功能障碍一致。光学相干断层扫描显示视网膜神经纤维层有选择性细化。组织学的大鼠视网膜在横断面发现减少细胞密度在神经节细胞层, 但没有变化的其他细胞层。用神经节细胞特异标记 (RBPMS) 检测平板小鼠视网膜的染色, 证实神经节细胞丢失。circumlimbal 缝合术是一种简单、微创、经济有效的诱发眼内高压的方法, 可导致大鼠和小鼠神经节细胞损伤。

引言

动物模型为实验研究青光眼发病机制的细胞过程提供了一个重要的平台, 并评估潜在的治疗干预措施。几种诱导模型的建立, 以产生持续眼压 (眼压) 升高, 最重要的危险因素, 青光眼。用于提高眼压的方法包括: 高渗盐水注射液在巩膜静脉¹, 激光光凝的小梁网²或角膜缘静脉³, 和眼内注射液等物质鬼血红细胞⁴, 微球^5,6和粘弹性剂⁷。每种方法都有其优点和局限性。

一个好的青光眼模型应该模仿疾病的过程, 以最小的并发症, 如创伤, 炎症和媒体混浊。这些并发症经常与用于诱发眼压升高的程序有关, 并会混淆结局的解释。例如, 即使在未引入异物的情况下, 前房穿刺也已被证明是造成外伤和炎症的原因, 而不是典型的青光眼改变^8、9的代表性。除了避免炎症的重要性外, 保持光学清晰度有助于体内成像和电生理监测疾病进展。虽然目前尚不清楚这些并发症会对疾病调查有多大影响, 但在模型诱导过程中, 最好避免穿透眼球。circumlimbal 缝合方法避免了地球的穿透, 促进了体内视网膜结构和功能的纵向评估。更重要的是, 这个模型不同于以往的能力, 以返回眼压的基线值, 在必要时去除缝合。眼压正常化可能有助于研究可逆和不可逆转的神经节细胞损伤^{10,11,12,13,14}的细胞和分子相关性。

本文着重介绍了模型归纳技术。该模型诱导的大鼠和小鼠视网膜损伤的特征可以在其他^{15、16、17、18、19}中更详细地找到。

研究方案

所有实验程序都是根据澳大利亚国家卫生和医学研究理事会制定的《澳大利亚保护和使用动物行为守则》进行的。伦理学的批准是从霍华德 Florey 研究所动物伦理委员会 (批准号 13-044-um 和 13-068-um 为老鼠和老鼠, 分别)。

1. 有意识大鼠的眼压测量

1. 设置实验室回弹血压计到大鼠的设置。襁褓的老鼠在一块柔软的布里使动物平静下来。暴露头部和颈部。轻轻地握住躯干, 一只手, 与动物的背部休息对调查员的胸部。
   注: 局部麻醉是不需要的。
2. 用另一只手把反弹血压计在老鼠的眼睛附近, 使眼压探针的尖端约 2-3 毫米远离和垂直于角膜尖。用右手测量动物右眼的眼压, 左手左眼。
3. 等待几秒钟, 让老鼠平静下来, 按一下测量按钮一次。观察眼压探头的尖端轻轻击中角膜先端;并听到反弹血压计哔一声。
   注意: 血压计的一个蜂鸣音确认成功的测量, 可以从 LCD 屏幕上读取。双蜂鸣音指示测量错误。测量误差可能产生的因素, 如探头和角膜之间的不适当的工作距离, 过度倾斜的血压计的方向, 或击中眼睑或角膜的非中心部分的探针。有关测量误差的详细信息, 请参阅制造商的反弹血压计手册。
4. 重复步骤1.3 十次间隔为 1-2 秒, 从这些测量得出该时间点的平均眼压值。在5读后重置血压计。
5. 对于串行监测, 在当天的同一时间和在一致的光照条件下测量眼压, 以尽量减少由于日眼压周期^20,21的变化。

2. 有意识小鼠的眼压测量

1. 根据制造商的指示, 将回弹血压计设置为鼠标设置。
2. 要用手抑制鼠标, 请将鼠标放在烤架上, 然后轻轻地向后拉尾部。
   注意: 这将提示动物用它的前腿抓住金属烤架, 并试图拉自己向前, 这将略微伸展其身体。
   1. 用另一只手在耳朵后立即抓住松弛的皮肤。通过在无名指和中指之间 (或小指和手掌之间) 保持尾巴来保护动物的下半身。
      注意: 尽量不要把皮肤抓得太紧, 以免窒息而对眼睛施加压力。
3. 随着现在的自由手 (最初持有的尾巴), 使反弹血压计附近的老鼠的眼睛, 使眼压探头的尖端约 2-3 毫米从和垂直的角膜尖。要测量另一只眼睛, 旋转鼠标, 使另一只眼睛现在在血压计的前面。
4. 等待鼠标平静下来, 按一下测量按钮一次。观察眼压探头的尖端轻轻击中角膜尖;单声蜂鸣确认成功的测量。
   注意: 双蜂鸣音指示测量错误。它可能有助于让第二个实验者阅读和记录的眼压读数, 而第一个实验者采取的测量。
5. 重复步骤2.4 获得十个成功的读数, 以得出眼压。在5读后重置血压计。允许在读数之间间隔 1-2 秒。
6. 根据对大鼠的连续测量, 在当天的同一时间和在一致的光照条件下测量小鼠眼压。

3. 麻醉大鼠和小鼠眼内压增高的诱导作用

1. 用70% 乙醇清洗0.5% 洗必泰的手术台。用无菌窗帘盖住长凳。预压釜所有手术设备。确保所有实验者都佩戴适当的个人防护设备 (手术面罩、长袍和消毒手套)。
2. 为了诱导全身麻醉, 将动物放置在感应腔内。提供 3-3.5% 异氟醚与 O₂的流速为3升/分。
   1. 保持麻醉与1.5% 异氟醚在2升/分通过一个啮齿动物面罩提供整个手术。在没有爪捏反射的情况下, 确保足够的麻醉深度。
   2. 在必要时调整流速以避免呼吸抑制, 以保持呼吸速率在大约60呼吸/分钟。
3. 随机选择一只眼睛诱发眼高血压, 以对侧眼作为未治疗的控制。为局部麻醉灌输一滴 0.5% proxymetacaine 眼科溶液。清洁眼部表面, 用3毫升无菌生理盐水冲洗眼部。
4. 用无菌的、fenestrated 的外科悬垂盖住动物, 露出眼睛进行缝合。
5. 对全球球结膜进行包线缝合。在大鼠, 编织7/0 尼龙缝合平行和2毫米后的角膜缘 (图 1)。在小鼠, 放置10/0 尼龙缝合在1毫米后的角膜缘。
   1. 注意不要穿透巩膜。手术过程中瞳孔的突然扩张表明巩膜有可能被穿透。
   2. 用5-6 个大鼠锚点和4-5 个小鼠锚点固定在结膜上缝合。
   3. 避免对主要的巩膜静脉进行直接压缩, 通过在这些静脉的交叉处穿线结膜下面的缝合线。
      注意: 虽然我们建议避免压迫大鼠的主要巩膜静脉, 但由于这些静脉在小鼠眼中的低可见性, 这并不是例行的。尽管主要静脉没有直接压缩, 但巩膜静脉丛中较小的血管可能会受到压力, 这可能是持续性眼压升高的一个因素 (请参见讨论眼压升高的机制)。
6. 通过栓一个活结然后第二个简单的结 (图 1), 固定钱包线缝合。为避免术后眼压过高, 请在紧固第二结之前, 先让助手测量眼压。
   1. 如果眼压被发现太高, 调整滑结通过部分解除张力在缝合的一端 (箭头在图 1A)。
   2. 在期望的眼压以后 (理想地 30-60 mmHg 在老鼠或 30-40 mmHg 在小鼠), 栓在第二个结, 并且保持连续拉扯力量在那末端缝合 (箭头在图 1a)。
   3. 第二个结被收紧后, 修剪缝合的两端, 以尽量减少异物的感觉。在全身麻醉恢复过程中监测动物。
      注意: 在绑第一个结节时使用活结是很重要的, 以确保眼睛有足够的内压。在几个星期以后它通常被注意末端成为嵌入在结膜。

4. 监测眼压

1. 在异氟醚麻醉下手术后2分钟进行第一眼压测量。随后, 当啮齿类动物恢复知觉时, 根据上述步骤1和 2, 监测眼压。
   注: 在第一天 (2 分钟1小时) 内进行两次眼压监测, 然后在第一周每天一次或两次。

5. 测定视网膜结构和功能

1. 在所需的实验终点 (在这种情况下, 在8周大鼠和12周的小鼠), 一般麻醉下, 使用腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪, 测量视网膜功能与暗适应视网膜电图 (视网膜电流图), 如所述在其他地方更详细地^15,16,17。
   注意: 我们发现神经节细胞功能障碍, 视网膜神经纤维层稀疏和神经节细胞丢失的持续时间在8-12 周之间。其他人已经成功地使用了更长的时间眼压海拔^14,15。
2. 术后立即测量视网膜神经纤维层 (RNFL) 和视网膜总厚度的厚度, 使用光谱域光学相干层析成像 (SD OCT) ^16,18。
3. 在纵向研究结束时, 弄死对动物进行深度麻醉。
   1. 解剖视网膜的组织学¹⁸, 例如染色的视网膜神经节细胞 (研资局) 特异抗体, 如 RNA 结合蛋白多剪接抗体 (RBPMS) 或脑特定的连锁/POU 领域的全安装视网膜。蛋白质 3A (Brn3a)^16,19,22。

结果

以下结果在老鼠¹⁸和老鼠¹⁶以前被报告了并且这里总结。circumlimbal 缝合在大鼠和小鼠中产生了类似的眼压升高模式 (图 2)。缝合术后立即发现一只小鼠眼压峰值, 高达 58.1 2.7 mmHg, 38.7, 2.2 mmHg。在大鼠中, 随着时间的推移, 眼压量逐渐减少 44, 为 6 mmHg 和 32, 2 毫米汞, 3 和24小时, 分别为¹⁵。在这最初的眼...

讨论

circumlimbal 缝合是慢性眼高压症的新模型。除了有代表性的研究结果来源于^16、18, 这一动物模型在最近的一些研究中被利用了^{15、23、24、25 ,26}。以上这些报告的比较表明, 该方法产生可重复的结果, 包括眼压升高的幅度, 以及在模型?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
normal saline	Baxter International Inc	AHB1323	Maintain corneal hydration during surgery
Chlorhexadine 0.5%	Orion Laboratories	27411, 80085	Disinfection of surgical instrument
Isoflurane 99.9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for suture procedure
ocular lubricant	Alcon Laboratories	1618611	Proprietory Name: Genteal, ocular lubricant to keep the other eye moist
Needle holder (microsurgery)	World Precision Instruments	555419NT	To hold needle during ocular surgery
Proxymetacaine 0.5%	Alcon Laboratories	CAS 5875-06-9	Topical ocular analgesia
Scissors (microsurgery)	World Precision Instruments	501232	To cut excessive suture stump during ligation
Surgical drape	Vital Medical Supplies	GM29-612EE	Ensure sterile enviornment during surgery
Suture needle for rats (microsurgery)	Ninbo medical needles	151109	8-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Suture needle for mice (microsurgery)	Ninbo medical needles	160905	10-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Tweezers (microsurgery)	World Precision Instruments	500342	Manipulate tissues during ocular surgery
rebound tonometer	TONOLAB, iCare, Helsinki, Finland	TV02	for intraocular pressure monitoring