Un modello del Glaucoma indotto da sutura Circumlimbal nei ratti e nei topi

Riepilogo

Ipertensione oculare cronica è indotta applicando una sutura circumlimbal in ratti e topi, che conduce al deterioramento strutturale e funzionale delle cellule ganglionari retiniche coerente con il glaucoma.

Abstract

La sutura di circumlimbal è una tecnica per indurre glaucoma sperimentale nei roditori cronicamente elevando la pressione intraoculare (IOP), un ben noto fattore di rischio per il glaucoma. Questo protocollo dimostra una guida dettagliata su questa tecnica a lungo Evans ratti e topi C57BL/6. In anestesia generale, una "" sutura viene applicata sul conjunctiva, intorno all'equatore e dietro il limbus dell'occhio. Il collega occhio serve come controllo non trattato. Nel corso della durata del nostro studio, che era un periodo di 8 settimane per ratti e 12 settimane per i topi, IOP è rimanere elevato, come misurato regolarmente di tonometria di rimbalzo in animali coscienti senza anestesia topica. In entrambe le specie, gli occhi suturati ha mostrato le caratteristiche dell'elettroretinogramma costanti con disfunzione retinica interna preferenziale. Tomografia ottica di coerenza ha mostrato selettiva assottigliamento dello strato di fibre nervose retiniche. L'istologia della retina del ratto in sezione trasversale trovato ridotta densità delle cellule nello strato delle cellule del ganglio, ma nessun cambiamento in altri strati cellulari. Macchiatura delle retine di piatto-montato del mouse con un marker specifico di cellule del ganglio (trasformante) ha confermato la perdita delle cellule del ganglio. La sutura di circumlimbal è un semplice, minimamente invasiva e conveniente modo per indurre ipertensione oculare che porta alla lesione delle cellule del ganglio in topi e ratti.

Introduzione

Modelli animali forniscono che un'importante piattaforma per la ricerca del laboratorio di cellulare processi sottostanti patogenesi del glaucoma, nonché valutare potenziali interventi terapeutici. Diversi modelli viscoelastici sono stati sviluppati per produrre elevazione sostenuta pressione intraoculare (IOP), il più importante fattore di rischio per il glaucoma. Metodi che sono stati applicati per elevare la IOP includono: iniezione salina ipertonica in episcleral vene¹, photocoagulation del laser del trabecolato² o delle vene limbal³e l'iniezione intracameral di sostanze come fantasma rosso globuli⁴, microsfere^5,6 e viscoelastico agenti⁷. Ogni approccio presenta vantaggi e limitazioni.

Un buon modello per il glaucoma dovrebbe imitare il processo di malattia, con la minima complicazione come opacities trauma, infiammazione e media. Queste complicazioni sono associate frequentemente con le procedure utilizzate per indurre l'altezza dello IOP e possono confondere l'interpretazione dei risultati. Ad esempio, paracentesi della camera anteriore, anche quando non vengono introdotte sostanze estranee, sono stato indicato per causare il trauma e l'infiammazione che non è rappresentativo di cambiamento glaucomatoso tipico^8,9. Oltre all'importanza di evitare l'infiammazione, mantenere chiarezza ottica facilita in vivo imaging ed elettrofisiologia per monitorare la progressione della malattia. Anche se non è chiaro in che misura queste complicazioni possono interessare le indagini di malattia, può essere meglio evitare penetrante dell'occhio durante l'induzione del modello. L'approccio di sutura circumlimbal evita la penetrazione del globo e facilita in vivo valutazione longitudinale della struttura retinica e della funzione. Ancora più importante, questo modello si differenzia da quelle precedenti nella sua capacità di restituire IOP ai valori basali di rimozione della sutura quando richiesto. Normalizzazione di IOP può essere utile per studiare il cellulare e correlati molecolari del ganglio reversibile e irreversibile delle cellule ferita^{10,11,12,13,14}.

Questo articolo si concentra sulla tecnica per l'induzione del modello. Caratterizzazione della lesione retinica indotta da questo modello nei ratti e nei topi può essere trovato più dettagliatamente altrove^{15,16,17,18,19}.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state condotte secondo il codice di pratica australiana per la cura e l'uso degli animali per fini scientifici, l'impostazione del National Health and Medical Research Council in Australia. Approvazione etica è stata ottenuta dal comitato di etica animale di Howard Florey Institute (approvazione numero 13-044-UM e 13-068-UM per ratti e topi, rispettivamente).

1. misurazione della pressione intraoculare in ratti coscienti

1. Impostare il tonometro rimbalzo di laboratorio per l'impostazione di ratto. Fasciare il ratto sveglio in un pezzo di panno morbido per calmare l'animale. Esporre la testa e il collo. Premere delicatamente il torso in una mano, con parte posteriore dell'animale che riposa contro il petto dello sperimentatore.
   Nota: L'anestesia d'attualità non è necessaria.
2. Usare l'altra mano per avvicinare il tonometro rimbalzo occhio del ratto, in modo che la punta della sonda IOP è circa 2-3 mm lontano da e perpendicolare all'apice corneale. Utilizzare la mano destra per misurare lo IOP nell'occhio di destra dell'animale e la mano sinistra per l'occhio sinistro.
3. Attendere alcuni secondi per il ratto per calmare e premere una volta il tasto di misurazione. Osservare che la punta della sonda IOP colpito delicatamente l'apice corneale una volta; e sente il bip del tonometro di rimbalzo una volta.
   Nota: Un singolo beep del tonometro confermerà l'avvenuta misurazione, che può essere letta dallo schermo LCD. Un doppio segnale acustico indica un errore di misura. Errori di misura possono derivare da fattori quali la distanza di lavoro inadeguato tra la sonda e la cornea, un'inclinazione eccessiva nell'orientamento del tonometro, o la sonda colpisce la palpebra o una parte non centrale della cornea. Consultare il manuale del tonometro rimbalzo dal produttore per maggiori dettagli per quanto riguarda gli errori di misura.
4. Ripetere il passaggio 1.3 dieci volte ad intervalli di 1-2 secondo, da queste misurazioni derivare un valore medio di IOP per quel punto di tempo. Reimpostare il tonometro dopo la lettura di^th 5.
5. Per il monitoraggio seriale, è possibile misurare lo IOP allo stesso tempo del giorno e in condizioni di luce coerente per minimizzare la variazione diurna IOP ciclo^20,21.

2. misura di pressione intraoculare in topi coscienti

1. Consente di impostare il tonometro rimbalzo nella posizione del mouse secondo le istruzioni del fabbricante.
2. Per frenare il mouse a mano, posizionare il mouse sulla cima di una gabbia di grill e tirare delicatamente la coda all'indietro.
   Nota: Questo richiederà l'animale di grip sulla griglia del metallo con le sue zampe anteriori e il tentativo di tirarsi in avanti, che sarà leggermente allungare il suo corpo.
   1. Usare l'altra mano afferrare la pelle flaccida immediatamente dietro le orecchie. Fissare la parte inferiore del corpo dell'animale, tenendo la coda tra l'anulare e il dito medio (o tra il mignolo e il palmo della mano).
      Nota: Non tentare di afferrare la pelle troppo stretta, per evitare il soffocamento e applicando pressione sugli occhi.
3. Con la mano libera di ora (inizialmente tenendo la coda), avvicinare il tonometro rimbalzo occhio del mouse, in modo che la punta della sonda IOP è circa 2-3 mm da e perpendicolare all'apice corneale. Per misurare l'altro occhio, è necessario ruotare il mouse in modo che l'altro occhio è ora davanti il tonometro.
4. Attendere che il mouse calmare e premere una volta il tasto di misurazione. Osservare che la punta della sonda IOP ha colpito delicatamente l'apice corneale; con un segnale acustico conferma l'avvenuta misurazione.
   Nota: Un doppio segnale acustico indica un errore di misura. Può essere utile per avere una seconda lettura di sperimentatore e documento le letture di IOP mentre il primo sperimentatore prende le misure.
5. Ripetere il passaggio 2.4 per ottenere dieci letture con successo per derivare un IOP. Reimpostare il tonometro dopo la lettura di^th 5. Consentire un intervallo di 1-2 secondi tra letture.
6. Secondo la misura di serie nei ratti, misurare mouse IOP allo stesso tempo del giorno e in condizioni di luce coerente.

3. induzione di elevazione della pressione intraoculare in topi e ratti anestetizzati

1. Pulire il banco chirurgico con clorexidina 0,5% in etanolo al 70%. Coprire la panca con teli sterili. Autoclave tutte le apparecchiature chirurgiche in anticipo. Garantire a tutti gli sperimentatori indossano adeguati dispositivi di protezione personale (maschere chirurgiche, camici e guanti sterilizzati).
2. Per indurre l'anestesia generale, metti l'animale in una camera di induzione. Formula 3-3,5% isoflurane con O₂ ad una portata di 3 L/min.
   1. Mantenere l'anestesia con isoflurano 1,5% a 2 L/min consegnato tramite una roditore maschera durante la chirurgia. Garantire sufficiente profondità di anestesia per l'assenza di un riflesso di pizzico di zampa.
   2. Evitare la depressione respiratoria regolando la portata quando necessario per mantenere la frequenza respiratoria a circa 60 respiri/min.
3. Selezionare casualmente un occhio per indurre ipertensione oculare, con l'occhio controlaterale per servire come un controllo non trattato. Instillare una goccia di 0.5% proxymetacaine soluzione oftalmica per l'anestesia d'attualità. Per pulire la superficie oculare, sciacquare l'occhio con 3 mL di soluzione salina normale sterile.
4. Coprire l'animale con un telo chirurgico sterile, fenestrato, esponendo l'occhio ad essere suturato.
5. Eseguire una sutura sulla congiuntiva bulbare intorno al globo. Nei ratti, tessere il suturare di nylon parallelo a 7/0 e 2 mm posteriormente al limbus (Figura 1). Nei topi, posizionare la sutura in nylon 10/0 a 1 mm posteriormente al limbus.
   1. Fare attenzione a non per penetrare la sclera. Un'improvvisa dilatazione pupillary durante la procedura chirurgica indica che la sclera è probabilmente stata penetrata.
   2. Ancoraggio la sutura sul conjunctiva usando 5-6 punti di ancoraggio in ratti e 4-5 punti di ancoraggio in topi.
   3. Evitare la compressione diretta sulle vene principali episcleral infilando la sutura sotto la congiuntiva all'incrocio di queste vene.
      Nota: Mentre si consiglia di evitare la compressione della vena episcleral principali in ratti, questo non viene normalmente fatto in topi a causa della scarsa visibilità di queste vene agli occhi del mouse. Anche se le vene principali non vengono compressi direttamente, è probabile che i più piccoli vasi nel plesso di vena episcleral sono sotto pressione, che può essere un fattore che contribuisce all'elevazione IOP sostenuta (vedi discussione per meccanismo dell'altezza dello IOP).
6. Fissare la sutura legando un nodo scorsoio poi seguito da un secondo nodo semplice (Figura 1). Per evitare un picco IOP post-chirurgico eccessivamente alto, dispone di un assistente misurare lo IOP immediatamente prima di fissare il secondo nodo.
   1. Se lo IOP è trovato per essere troppo alto, è possibile regolare il nodo di slittamento rilasciando parzialmente la tensione su un'estremità della sutura (freccia in Figura 1A).
   2. Dopo aver raggiunto la IOP desiderata (idealmente 30-60 mmHg nei ratti o nei topi di 30-40 mmHg), cravatta fuori il secondo nodo mantenendo una forza di trazione continua su quella estremità della sutura (freccia in Figura 1A).
   3. Dopo il secondo nodo è stato inasprito, tagliare le estremità della sutura per ridurre al minimo qualsiasi sensazione di corpo estraneo. Monitorare l'animale durante il recupero dall'anestesia generale.
      Nota: È importante utilizzare il slipknot quando prima di accasarsi per assicurare un'adeguata compressione verso l'interno sull'occhio. Dopo diverse settimane di solito è notato che le estremità diventano incorporate nel conjunctiva.

4. monitoraggio IOP

1. Prendere la prima misurazione della IOP a 2 minuti postoperatorio sotto anestesia isoflurano. Successivamente, monitorare lo IOP quando il roditore ha riacquistato coscienza secondo i suddetti passaggi 1 e 2.
   Nota: Monitorare lo IOP due volte durante il primo giorno (2 minuti e 1 ora), tutti i giorni nella prima settimana e una volta o due volte alla settimana da allora in poi.

5. Diluire la funzione e la struttura della retina

1. A sperimentale punto finale desiderato (in questo caso dopo 8 settimane in ratti e 12 settimane nei topi), in anestesia generale mediante iniezione intraperitoneale con chetamina/xilazina, misurare la funzione retinica con il scuro-adattato elettroretinogramma (ERG) come descritto più dettagliatamente altrove^15,16,17.
   Nota: Abbiamo trovato robusti disfunzione delle cellule del ganglio, strato di fibre nervose retiniche assottigliamento e ganglio cellula perdita per durate tra 8-12 settimane. Altri hanno impiegato con successo periodi più lunghi di IOP elevazione^14,15.
2. Immediatamente dopo la misurazione di ERG, misurare lo spessore dello strato di fibre nervose retiniche (RNFL) e dello spessore retinico totale utilizzando il dominio spettrale coerenza ottica tomografia (SD-OCT) ^16,18.
3. Alla fine dello studio longitudinale, eutanasia degli animali sotto anestesia profonda.
   1. Sezionare la retina per istologia¹⁸, ad esempio immunostaining del intero-supporto retina usando un anticorpo specifico di cella (RGC) ganglionari come RNA-proteina con più d'impionbatura anticorpo (trasformante) o dominio homeobox/POU cervello-specifico 3A di proteina (Brn3a)^16,19,22.

Risultati

I seguenti risultati in ratti¹⁸ e topi¹⁶ precedentemente sono stati segnalati e sono riassunti qui. La sutura circumlimbal ha prodotto un modello simile dell'altezza dello IOP nei ratti e nei topi (Figura 2). Una breve impennata IOP, fino a 58,1 ± 2.7 mmHg in ratti e 38,7 ± 2.2 mmHg nei topi, è stata trovata subito dopo la procedura di sutura. Nei ratti, IOP grandezza ridotta gradualmente nel tempo per essere...

Discussione

La sutura di circumlimbal è un nuovo modello di ipertensione oculare cronica. Oltre agli studi da cui i risultati rappresentativi sono provenienza^16,18, questo modello animale è stato utilizzato in una serie di recenti studi^{15,23,24,25 ,26}. Confronto tra questi rapporti precedenti dimostra che il me...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
normal saline	Baxter International Inc	AHB1323	Maintain corneal hydration during surgery
Chlorhexadine 0.5%	Orion Laboratories	27411, 80085	Disinfection of surgical instrument
Isoflurane 99.9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for suture procedure
ocular lubricant	Alcon Laboratories	1618611	Proprietory Name: Genteal, ocular lubricant to keep the other eye moist
Needle holder (microsurgery)	World Precision Instruments	555419NT	To hold needle during ocular surgery
Proxymetacaine 0.5%	Alcon Laboratories	CAS 5875-06-9	Topical ocular analgesia
Scissors (microsurgery)	World Precision Instruments	501232	To cut excessive suture stump during ligation
Surgical drape	Vital Medical Supplies	GM29-612EE	Ensure sterile enviornment during surgery
Suture needle for rats (microsurgery)	Ninbo medical needles	151109	8-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Suture needle for mice (microsurgery)	Ninbo medical needles	160905	10-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Tweezers (microsurgery)	World Precision Instruments	500342	Manipulate tissues during ocular surgery
rebound tonometer	TONOLAB, iCare, Helsinki, Finland	TV02	for intraocular pressure monitoring