Ein Modell des Glaukoms induziert durch Circumlimbal Naht bei Ratten und Mäusen

Zusammenfassung

Chronische okulärer Hypertension wird induziert durch die Anwendung einer Circumlimbal Naht bei Ratten und Mäusen, was zu funktionellen und strukturellen Verschlechterung der retinalen Ganglienzellen, die konsistent mit Glaukom.

Zusammenfassung

Die Circumlimbal Naht ist eine Technik zur Induktion experimentelle Glaukom bei Nagetieren durch chronisch hochziehen intraokulare Druck (IOP), ein bekannter Risikofaktor für Glaukom. Dieses Protokoll zeigt Schritt für Schritt diese Technik bei langen Evans Ratten und Mäusen C57BL/6. Unter Vollnarkose wird ein "tabaksbeutelnaht" auf die Bindehaut, rund um den Äquator und hinter dem Limbus des Auges angewendet. Das andere Auge dient als einer unbehandelten Kontrolle. Über die Dauer unserer Studie, die einen Zeitraum von 8 Wochen für Ratten und Mäuse 12 Wochen war, blieb IOP erhöhten, Rebound Tonometrie in bewusste Tiere ohne topische Anästhesie regelmäßig gemessen. In beiden Arten zeigte die genähten Augen Elektroretinogramm Features entsprechen bevorzugte innere retinalen Dysfunktion. Optische Kohärenztomographie zeigte selektive Ausdünnung der retinalen nervenfaserschicht. Histologie der Netzhaut Ratte im Querschnitt gefunden reduziert Zelldichte in das Ganglion Zellschicht, aber keine Änderung in anderen zellulären Ebenen. Färbung der Wohnung montiert Maus Netzhaut mit einem Ganglion Zelle spezifische Marker (RBPMS) bestätigt Ganglion Zellverlust. Die Circumlimbal Naht ist eine einfache, minimal invasive und kostengünstigen Weg zur okulären Hypertension induzieren, der zum Ganglion Zelle Verletzung bei Ratten und Mäusen führt.

Einleitung

Tiermodelle zur Verfügung stellen, eine wichtige Plattform für Laboruntersuchung der zellulären Prozesse zugrunde liegenden Glaukom-Pathogenese, sowie über mögliche therapeutische Interventionen zu bewerten. Mehreren induzierbaren Modelle wurden entwickelt, um nachhaltige intraokulare Druck (IOP) Höhe, der wichtigste Risikofaktor für Glaukom zu produzieren. Methoden, die angewendet wurden, um IOP zu erheben sind: hypertone Kochsalzlösung Injektion in Augenhaut Adern¹, Laser-Photokoagulation der trabekuläre Geflecht² oder des limbischen Adern³und intrakameraler Injektion von Substanzen wie Gespenst rote Blutkörperchen⁴, Microbeads^5,6 und Viskoelastische Agenten⁷. Jeder dieser Ansätze hat seine Vorteile und Einschränkungen.

Ein gutes Modell für Glaukom sollte den Krankheitsprozess mit minimalen Komplikationen wie Trauma, Entzündung und Medien linsentrübungen imitieren. Diese Komplikationen sind häufig verbunden mit den Verfahren verwendet, um IOP Höhe zu induzieren und Interpretation der Ergebnisse verwirren können. Z. B. Punktion der Vorderkammer, sogar wenn Fremdstoffe nicht eingeführt werden, hat sich gezeigt, Trauma und Entzündungen, die nicht repräsentativ für typische glaukomatösen Änderung^8,9ist zu verursachen. Neben der Bedeutung der Vermeidung von Entzündungen erleichtert die Pflege optischen Klarheit in Vivo Imaging und Elektrophysiologie, Fortschreiten der Krankheit zu überwachen. Obwohl es unklar, inwieweit ist diese Komplikationen beeinträchtigen Krankheit Untersuchungen, es kann besser sein, vermeiden durchdringen das Auge während Modell Induktion. Der Circumlimbal Naht Ansatz verhindert Eindringen von der ganzen Welt und erleichtert in Vivo longitudinalen Beurteilung der Netzhaut Struktur und Funktion. Noch wichtiger ist, unterscheidet sich dieses Modell von vorherigen in seiner Fähigkeit, IOP, Baseline-Werte durch Entfernung des Nahtmaterials bei Bedarf zurück. IOP Normalisierung möglicherweise hilfreich für die Erforschung der zellulären und molekularen Korrelate des reversiblen und irreversiblen Ganglion Zelle Verletzung^{10,11,12,13,14}.

Dieser Artikel konzentriert sich auf die Technik für das Modell Induktion. Charakterisierung der retinalen Schädigung induziert durch dieses Modell bei Ratten und Mäusen finden Sie an anderer Stelle ausführlicher^{15,16,17,18,19}.

Protokoll

Alle experimentelle Verfahren wurden nach der australischen Code of Practice für die Pflege und Nutzung von Tieren zu Forschungszwecken, festgelegt durch den National Health and Medical Research Council in Australien durchgeführt. Ethik der Genehmigung wurde von Howard Florey Institute Tier Ethikkommission (Genehmigung Nr. 13-044-UM und 13-068-UM für Ratten und Mäuse, beziehungsweise).

1. Augeninnendruck-Messung im bewussten Ratten

1. Stellen Sie die Labor-Rebound-Tonometer auf die Ratte-Einstellung. Wickeln Sie die wachte Ratte in einem Stück Tuch, das Tier zu beruhigen. Aussetzen des Kopfes und Halses. Halten Sie sanft den Oberkörper in einer Hand, mit dem Rücken des Tieres gegen die Ermittler Brust ruhen.
   Hinweis: Topische Anästhesie ist nicht erforderlich.
2. Verwenden Sie andererseits das Rebound-Tonometer in der Nähe der Ratte Auge bringen, so dass der IOP Sondenspitze ca. 2-3 mm entfernt und senkrecht zur Hornhaut Spitze ist. Verwenden Sie die Rechte Hand, um IOP im rechten Auge und der linken Hand für das linke Auge des Tieres zu messen.
3. Warten Sie ein paar Sekunden für die Ratte zu beruhigen und die Messung-Taste einmal drücken. Beachten Sie die Sondenspitze IOP sanft Hornhaut Apex einmal getroffen; und einmal den Rebound-Tonometer-Signalton hören.
   Hinweis: Ein einzelner Signalton das Tonometer bestätigt erfolgreiche Messung, die das LCD-Display abgelesen werden kann. Ein doppelter Signalton gibt einen Messfehler. Messfehler können durch Faktoren wie unangemessene Arbeitsabstand entstehen zwischen der Sonde und der Hornhaut, eine übermäßige Neigung in der Ausrichtung des das Tonometer, oder die Sonde auffällig das Augenlid oder ein nicht-zentralen Teil der Hornhaut. Beziehen sich auf das Rebound-Tonometer-Handbuch des Herstellers für weitere Details zu Messfehlern.
4. Wiederholen Sie Schritt 1.3 zehn Mal im Abstand von 1-2 Sekunden, aus diesen Messungen ergeben ein IOP-Mittelwert für diesen Zeitpunkt. Setzen Sie das Tonometer nach der 5^th -Lesung.
5. Messen Sie für Serienüberwachung IOP zur gleichen Zeit des Tages und bei konsequenten Lichtverhältnissen Variante aufgrund der tagaktive IOP Zyklus^20,21zu minimieren.

2. Augeninnendruck-Messung im bewussten Mäuse

1. Stellen Sie das Rebound-Tonometer auf die Maus Einstellung nach Anleitung des Herstellers.
2. Die Maus mit der hand zurückhalten, platzieren Sie den Mauszeiger auf einem Grill-Käfig-Spitze und ziehen vorsichtig die Rute nach hinten.
   Hinweis: Dies werden aufgefordert, das Tier zu greifen auf die Metallgitter mit seinen Vorderbeinen und Versuch, sich nach vorne, ziehen die leicht seinen Körper zu dehnen.
   1. Verwenden Sie die andere Hand, um die lose Haut sofort hinter den Ohren zu erfassen. Sichern Sie den Unterkörper des Tieres halten die Rute zwischen den Ringfinger und Mittelfinger (oder zwischen den kleinen Finger und Handfläche).
      Hinweis: Versuchen Sie nicht, die Haut zu eng, zur Vermeidung von Erstickungsgefahr und Anwendung Druck auf die Augen zu erfassen.
3. Bringen Sie mit der jetzt freie Hand (zunächst das Heck) die Rebound-Tonometer in der Nähe der Maus Auge, damit der IOP Sondenspitze ca. 2-3 mm aus und im rechten Winkel zur Hornhaut Spitze ist. Um das andere Auge zu messen, drehen Sie die Maus so, dass das andere Auge nun vor das Tonometer ist.
4. Warten Sie, bis die Maus, um zu beruhigen und die Messung-Taste einmal drücken. Beachten Sie das IOP Sondenspitze sanft Hornhaut Apex getroffen; mit einem einzelnen Signalton bestätigt erfolgreiche Messung.
   Hinweis: Ein doppelter Signalton zeigt einen Messfehler. Es kann helfen, ein zweiter Experimentator Lese- und Dokument der IOP Lesungen haben während der erste Experimentator die Maße nimmt.
5. Wiederholen Sie Schritt 2.4 zu zehn erfolgreichen Lesungen um ein IOP abzuleiten. Setzen Sie das Tonometer nach der 5^th -Lesung. Ein Intervall von 1-2 Sekunden zwischen den Lesungen zu ermöglichen.
6. Gemäß serielle Messung bei Ratten Messen Sie Maus IOP zur gleichen Zeit des Tages und bei konsequenten Lichtverhältnissen.

(3) Induktion der Augeninnendruck Erhöhung bei anästhesierten Ratten und Mäusen

1. Reinigen Sie die chirurgische Bank mit 0,5 % Chlorhexidin in 70 % igem Ethanol. Die Bank mit sterilen Tüchern abgedeckt. Autoklav alle Chirurgische Ausrüstung im voraus. Sicherstellen Sie, dass alle Experimentatoren geeigneten persönlichen Schutzausrüstung (Mundschutz, Kittel und sterilisierte Handschuhe) tragen.
2. Vollnarkose zu induzieren, legen Sie das Tier in eine Induktion-Kammer. Liefern Sie 3-3.5 % Isofluran mit O₂ bei einer Durchflussmenge von 3 L/min.
   1. Anästhesie mit 1,5 % Isofluran in 2 L/min geliefert über ein Nagetier Gesichtsmaske während der Operation zu erhalten. Ausreichenden Tiefe der Narkose durch das Fehlen von einer Pfote Prise Reflex zu gewährleisten.
   2. Vermeiden Sie Atemdepression durch die Durchflussmenge bei Bedarf weiterhin der Atemfrequenz bei ca. 60 Atemzüge/min einstellen.
3. Wählen Sie zufällig ein Auge induzieren okulären Hypertension, mit dem kontralateralen Auge als einer unbehandelten Kontrolle dienen. Ein Rückgang von 0,5 % Proxymetacaine ophthalmologische Lösung für topische Anästhesie zu vermitteln. Um die Augenoberfläche zu reinigen, spülen Sie das Auge mit 3 mL sterile normale Kochsalzlösung.
4. Decken Sie das Tier mit einer sterilen, gefenstert chirurgische drapieren, auszusetzen das Auge genäht werden.
5. Führen Sie eine tabaksbeutelnaht bulbärer Bindehaut rund um den Globus. Weben Sie bei Ratten die 7/0 Nylon Naht parallel und 2 mm nach der Limbus (Abbildung 1). Legen Sie bei Mäusen die 10/0-Nylon-Naht bei 1 mm nach dem Limbus.
   1. Achten Sie darauf, nicht die Lederhaut eindringen. Eine plötzliche Pupillen Dilatation während des chirurgischen Eingriffs gibt an, dass der Sklera wahrscheinlich eingedrungen.
   2. Anker die Naht auf die Bindehaut mit 5-6 Ankerpunkte in Ratten und 4-5 Ankerpunkte in Mäusen.
   3. Vermeiden Sie direkte Kompression auf die Venen große Augenhaut durch Einfädeln die Naht unter der Bindehaut an der Kreuzung der diese Adern.
      Hinweis: Wir empfehlen Kompression der großen Augenhaut Ader bei Ratten zu vermeiden, nicht routinemäßig bei Mäusen aufgrund schlechter Sicht diese Adern in Maus Augen geschieht dies. Obwohl die großen Venen nicht direkt komprimiert sind, ist es wahrscheinlich, dass die kleineren Schiffen in die Augenhaut Vene Plexus unter Druck, die möglicherweise ein entscheidender Faktor für die nachhaltige IOP-Höhe (siehe Diskussion für Mechanismus der IOP-Höhe).
6. Befestigen Sie die tabaksbeutelnaht durch das Binden einer Slipknot, gefolgt von einem zweiten einfachen Knoten (Abbildung 1). Um eine zu hohe postoperative IOP Spike zu vermeiden, haben Sie einen Assistenten den IOP zu messen, unmittelbar vor der Befestigung des zweiten Knotens.
   1. Wenn das IOP gefunden wird, zu hoch, Anpassen der belegknoten durch die teilweise Freigabe der Spannung an einem Ende der Naht (Pfeil in Abb. 1A).
   2. Nachdem das gewünschte IOP erreicht wird (idealerweise 30-60 MmHg in Ratten oder 30-40 MmHg bei Mäusen), Krawatte aus den zweiten Knoten unter Beibehaltung einer kontinuierlichen Zugkraft auf das Ende der Naht (Pfeil in Abb. 1A).
   3. Nach dem zweiten Knoten wurde verschärft, schneiden Sie die Enden des Nahtmaterials Fremdkörpergefühl zu minimieren. Beobachten Sie das Tier während nach Vollnarkose wieder.
      Hinweis: Es ist wichtig, die Slipknot verwenden, wenn den erste Knoten binden um angemessene innere Kompression auf das Auge zu gewährleisten. Nach mehreren Wochen ist in der Regel zu bemerken, dass die Enden in die Bindehaut eingebettet werden.

4. Überwachung der IOP

1. Nehmen Sie die erste IOP-Messung 2 Minuten postoperativ unter Isofluran-Narkose. Anschließend überwachen Sie IOP, wenn das Nagetier Bewusstsein gemäß der oben genannten Schritte 1 und 2 wiedererlangt hat.
   Hinweis: Überwachen der IOP zweimal während des ersten Tages (2 Minuten und 1 Stunde), täglich in der ersten Woche und ein-bis zweimal pro Woche danach.

5. Untersuchung der Netzhaut Struktur und Funktion

1. Am gewünschten experimentelle Endpunkt (in diesem Fall nach 8 Wochen bei Ratten und 12 Wochen bei Mäusen), unter Vollnarkose mit intraperitonealer Injektion mit Ketamin/Xylazin Messen Sie retinale Funktion mit der angepassten Elektroretinogramm (ERG) wie beschrieben an anderer Stelle ausführlicher^15,16,17.
   Hinweis: Wir haben festgestellt, robuste Ganglion Zelle Dysfunktion, Netzhaut Nerv Faser Schicht dünner und Ganglion Zelle "Verlust" für Laufzeiten zwischen 8-12 Wochen. Andere haben längere IOP Höhe^14,15erfolgreich eingesetzt.
2. Unmittelbar nach ERG Messung Messen Sie die Dicke der retinalen nervenfaserschicht (RNFL) und total Netzhautdicke mit spectral-Domain optische Kohärenz Tomographie (SD-OCT) ^16,18.
3. Am Ende der Längsschnittstudie einschläfern Sie die Tiere in tiefen Narkose.
   1. Sezieren der Netzhaut für Histologie¹⁸, z. B. Immunostaining ganze-Mount Netzhaut mit einem retinalen Ganglienzellen Zelle (RGC) spezifischen Antikörper wie z. B. RNA-bindende Protein mit mehreren Spleißen Antikörper (RBPMS) oder Gehirn-spezifische Homeobox/POU Domäne Protein-3A (Brn3a)^16,19,22.

Ergebnisse

Die folgenden Ergebnisse in Ratten¹⁸ und Mäuse¹⁶ zuvor gemeldet wurden und werden hier zusammengefasst. Die Circumlimbal Naht erzeugt ein ähnliches Muster des IOP Höhe bei Ratten und Mäusen (Abbildung 2). Eine kurze IOP Spike, bis zu 58,1 ± 2,7 MmHg bei Ratten und 38,7 ± 2,2 MmHg bei Mäusen wurde unmittelbar nach dem Eingriff Naht gefunden. Bei Ratten IOP Größenordnung allmählich im Laufe der Zeit zu 4...

Diskussion

Die Circumlimbal Naht ist ein neues Modell der chronischen okuläre Hypertension. Zusätzlich zu den Studien, aus denen die repräsentativen Ergebnisse aus der Region^16,18sind, ist dieses Tiermodell verwendet worden in einer Reihe von aktuellen Studien^{15,23,24,25 ,26}. Vergleich über diese früheren B...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
normal saline	Baxter International Inc	AHB1323	Maintain corneal hydration during surgery
Chlorhexadine 0.5%	Orion Laboratories	27411, 80085	Disinfection of surgical instrument
Isoflurane 99.9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for suture procedure
ocular lubricant	Alcon Laboratories	1618611	Proprietory Name: Genteal, ocular lubricant to keep the other eye moist
Needle holder (microsurgery)	World Precision Instruments	555419NT	To hold needle during ocular surgery
Proxymetacaine 0.5%	Alcon Laboratories	CAS 5875-06-9	Topical ocular analgesia
Scissors (microsurgery)	World Precision Instruments	501232	To cut excessive suture stump during ligation
Surgical drape	Vital Medical Supplies	GM29-612EE	Ensure sterile enviornment during surgery
Suture needle for rats (microsurgery)	Ninbo medical needles	151109	8-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Suture needle for mice (microsurgery)	Ninbo medical needles	160905	10-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Tweezers (microsurgery)	World Precision Instruments	500342	Manipulate tissues during ocular surgery
rebound tonometer	TONOLAB, iCare, Helsinki, Finland	TV02	for intraocular pressure monitoring