JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، على بروتوكول لإدراج الوراثية بيوسينثيسيزيد ل ديهيدروكسيفينيلالانيني من المواد البداية بسيطة وتطبيقه على تصريف البروتين.

Abstract

لام-ديهيدروكسيفينيلالانيني (دوبا) هو من الأحماض الأمينية الموجودة في التركيب الحيوي الكاتيشولامين في الحيوانات والنباتات. بسبب خصائصه البيوكيميائية خاصة، قد الحمض الأميني متعددة الاستخدامات في التطبيقات البيوكيميائية. ويصف هذا التقرير وضع بروتوكول لإدراج الوراثية بيوسينثيسيزيد دوبا وتطبيقه على تصريف البروتين. دوبا بيوسينثيسيزيد تيروزين فينول-لياز (لافوري) من الكاتيتشول، بيروفات، والأمونيا، ومباشرة أدمجت الأحماض الأمينية في البروتينات بواسطة الأسلوب إدراج الوراثية استخدام الحمض الريبي النووي النقال-أمينواسيل تطورت وزوج أمينواسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز. ويتضمن النظام الإدماج المباشر هذا كفاءة دوبا مع إدخال القليل من الأحماض الأمينية الطبيعية الأخرى ومع المحصول البروتين أفضل من النظام السابق لإدراج الوراثية دوبا. تصريف البروتين مع البروتينات المحتوية على دوبا هو الكفاءة والمعينة للموقع وتظهر فائدته لمختلف التطبيقات. يوفر هذا البروتوكول العلماء البروتين مع إجراءات مفصلة للتركيب الحيوي كفاءة متحولة البروتينات التي تحتوي على دوبا في المواقع المطلوبة وعلى التصريف للتطبيقات الصناعية والمستحضرات الصيدلانية.

Introduction

دوبا هو من الأحماض الأمينية المتورطين في التركيب الحيوي الكاتيشولامين في الحيوانات والنباتات. هذه الأحماض الأمينية يتم تصنيعه من صور hydroxylase التيروزين والأوكسجين الجزيئي (س2)1. لأن دوبا سليفة الدوبامين، ويمكن أن تتخلل حاجز الدم في الدماغ، فقد استخدمت في علاج مرض باركنسون2. كما تم العثور على دوبا في بلح البحر التصاق البروتينات (خرائط)، التي المسؤولة عن خصائص لاصقة من بلح البحر في ظروف رطبة3،،من45،،من67. في البداية يتم ترميز طير في المواقف حيث وجدت في الخرائط دوبا ويتم تحويلها بعد ذلك إلى دوبا تيروسيناسيس8،9. بسبب خصائصه البيوكيميائية مثيرة للاهتمام، وقد استخدمت دوبا في مجموعة متنوعة من التطبيقات. مجموعة ديهيدروكسيل دوبا كيميائيا عرضه للأكسدة، والأحماض الأمينية يتم تحويلها بسهولة إلى L-دوباكوينوني، مقدمة ميلانينس. نظراً لأن اليكتروفيليسيتي عالية، قد استخدمت لدوباكوينوني ومشتقاته crosslinking والاقتران مع ثيولس والامينات10،11،،من1213. 1، 2-كوينونس يمكن أن تعمل أيضا ديين لردود فعل سيكلواديشن واستخدمت بيوكونجوجيشن التي تروج لها سلالة تسيطر على أكسدة سيكلوكتيني-1، 2-كينون (سبوكق) سيكلواديشن14. وبالإضافة إلى ذلك، مجموعة ديهيدروكسيل يمكن يخلب الأيونات المعدنية مثل الحديد3 + و Cu2 +، والبروتينات التي تحتوي على دوبا وقد استخدمت لإيصال الأدوية، وأيون معدني الاستشعار عن15،16.

تم دمج البروتينات باستخدام متعامد أمينواسيل-الحمض الريبي النووي النقال (أإ-الحمض الريبي النووي النقال) وأمينواسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز (aaRS) زوج17 دوبا وراثيا واستخدامه للبروتين التصريف و crosslinking10،11، 12،13. ويرد في هذا التقرير، النتائج التجريبية والبروتوكولات لإدراج بيوسينثيسيزيد دوبا من مواد انطلاق رخيصة وتطبيقاتها في بيوكونجوجيشن الوراثية. دوبا بيوسينثيسيزيد استخدام لافوري، وبدءا من الكاتيتشول، بيروفات، والأمونيا في الإشريكيّة القولونية. بيوسينثيسيزيد دوبا تدمج مباشرة البروتينات بالإعراب عن زوج aa-الحمض الريبي النووي النقال و aaRS تطورت على دوبا. وبالإضافة إلى ذلك، بيوسينثيسيزيد البروتين الذي يحتوي على دوبا هو سيتيسبيسيفيكالي مترافق مع المسبار الفلورسنت وكروسلينكيد لإنتاج البروتين ليغومرات. هذا البروتوكول سوف تكون مفيدة للعلماء البروتين، لبروتينات متحولة biosynthesize المحتوية على دوبا ومترافق البروتينات مع تحقيقات البيوكيميائية أو المخدرات للتطبيقات الصناعية والمستحضرات الصيدلانية.

Protocol

1-بلازميد البناء

  1. بناء بلازميد تعبير (بباد-ثنائي-لافوري-التجارة والنقل-WT) الذي يعبر عن الجينات لافوري من المضادات فريوندي الخاضعة لسيطرة أحد المروجين التأسيسي والجينات البروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) مع له6-العلامة تحت السيطرة مروج أراباد. بباد--المزدوج-لافوري-التجارة والنقل-E90TAG، تحل محل كودون للموقع (E90) من دوبا مع كودون العنبر (العلامة)، استخدام بروتوكول الطفرات الموجهة من الموقع. ووصف تفاصيل لتشييد هذا بلازميد في لدينا التقرير السابق18.
  2. بناء الحمض الريبي النووي النقال/aaRS-وإذ يعرب عن بلازميد (بيفول-DHPRS2)18،19 لإدراج الوراثية دوبا. بيفول ناقل بلازميد خاص الإعراب عن نسختين من الجينات aaRS مع المروجين المستقل، والمعلومات المفصلة بلازميد يرد في تقرير سابق19.
  3. استخدام مجموعات إعداد بلازميد المتاحة تجارياً للحصول على درجة نقاء عالية بلازميد السلطات الوطنية المعينة. فحص نقاء المعينة بريبيد باستخدام [اغروس] هلام التفريد، إذا لزم الأمر.

2-الثقافة إعداد

  1. انهانسر
    1. سلالة DH10β كولاي استخدام الكهربائية المختصة لهذه التجربة. إضافة 1 ميليلتر من كل بلازميد الحمض النووي (بيفول-DHPRS2 وبباد-ثنائي-لافوري-التجارة والنقل-E90TAG) إلى 20 ميليلتر من الخلايا المختصة. مزجها برفق لجعل خليط متجانس، باستخدام ماصة.
    2. نقل الخليط إلى الترعة انهانسر. مكان ومبومو في قاعة انهانسر. دفع في ومبومو إلى الدائرة لجعل شركة ومبومو-دائرة الاتصال.
    3. صدمة ومبومو، استخدام 25 µF و 2.5 كيلو فولت للترعة 0.1 سم.
    4. أضف 1 مل مرق الأمثل سوبر بريوارميد (شركة نفط الجنوب)، التي تحتوي على تريبتوني 2% (w/v)، 0.5% (w/v) الخميرة استخراج 10 ملم كلوريد الصوديوم، 2.5 ملم بوكل، 10 مم مجكل2والجلوكوز 20 مم، إلى ومبومو، ونقل الخلايا إلى أنبوب ثقافة. إنقاذ الخلايا التي تفرخ منهم ح 1 في 37 درجة مئوية مع الهز.
    5. انتشار 10-100 ميليلتر من خلايا تم إنقاذهم على طبق أجار مرق (رطل) ليسوجيني التي تحتوي على 35 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول و 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية ح 16.
  2. إعداد ثقافة كاتب
    1. تطعيم مستعمرة تحول واحد في 5 مل من رطل المتوسطة التي تحتوي على المضادات الحيوية. احتضان هذه المستعمرة ح 12 في 37 درجة مئوية مع الهز.

3-التعبير وتنقية للتجارة والنقل-E90DOPA بنظام السكروز

  1. التعبير للتجارة والنقل-E90DOPA بنظام السكروز
    1. نقل ثقافة كاتب (2 مل) إلى 100 مل من السلطة الفلسطينية-5052 متوسطة20 (50 مم نا2هبو4، 50 مم خ2ص4، 25 مم [NH4]2حتى4، 2 مم MgSO4، 0.1% [w/v] تتبع المعادن، والغليسيرول 0.5% [w/v]، 0.05% [w/v] الجلوكوز، والأحماض الأمينية 5% [w/v] [الأس الهيدروجيني 7.25]) التي تحتوي على 35 الكلورامفينيكول ميكروغرام/مل، 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين، بيروفات 100 مم، الكاتيتشول 10 ملم، والأمونيا 25 مم، وديثيوثريتول 300 ميكرون (DTT) متبوعاً حضانة عند 30 درجة مئوية مع الهز.
    2. إضافة 2 مل من 0.2% (w/v) لارابينوز عندما الكثافة البصرية (OD) عند 550 نانومتر تصل إلى 0.8. احتضان العينة ح 12 في 30 درجة مئوية مع الهز.
    3. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 11,000 س ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية، وتجميد بيليه الخلية في-80 درجة مئوية.
  2. تحلل الخلية
    1. ذوبان الجليد بيليه الخلية على الجليد وريسوسبيند الخلايا في 10 مل من تحلل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 50 ملم نة2بو4 (pH 8.0)، ايميدازول 10 مم و 300 مم كلوريد الصوديوم.
    2. Sonicate الخلايا ريسوسبينديد على الجليد لأدنى 10 استخدام 80% sonication السعة مع نبض من 25 s s على و 35 قبالة.
    3. تدور أسفل الخلية في 18,000 س ز في 4 درجات مئوية عن 15 دقيقة نقل المادة طافية على أنبوب جديد لتنقية وتجاهل بيليه.
  3. ني-جاتا التقارب اللوني
    1. إضافة الراتنج (حمض نيتروتراياكتيك) ني-جاتا (300 ميليلتر من تعليق الراتنج لثقافة 100 مل) إلى المادة طافية وربط البروتينات الراتنج ني-الإدارة الوطنية للسياحة في 4 درجات مئوية بالهز برفق تعليق ح 1.
    2. نقل التعليق إلى عمود البوليبروبيلين وتغسل الراتنج 3 x مع 5 مل من يغسل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 50 ملم نة2بو4 (pH 8.0)، ايميدازول 20 مم و 300 مم كلوريد الصوديوم.
    3. الوت البروتينات 3 x مع 300 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت الذي يحتوي على 50 ملم نة2بو4 (pH 8.0)، ايميدازول 250 مم و 300 مم كلوريد الصوديوم.
    4. تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس امتصاص في 280 نانومتر. معامل الانقراض (م 24,630-1سم-1) للتجارة والنقل-E90DOPA في 280 nm حسبت بروتين حاسبة معامل انقراض (مثلاً، https://web.expasy.org/protparam/) وانقراض يقاس بشكل مستقل كوفيسينت (م 2630-1سم-1) على دوبا. كأسلوب بديل، استخدام مقايسة البروتين برادفورد21 لتحديد تركيز البروتين.

4-أوليجوميريزاتيون لتنقية بروتينات فلورية خضراء-E90DOPA

  1. إضافة فوق يودات 1 ميليلتر من الصوديوم في ح2س (6 ملم) (1.0 equiv. للتجارة والنقل-E90DOPA) للتوصل إلى حل من 20 ميليلتر للتجارة والنقل-E90DOPA (300 ميكرون) في المخزن مؤقت فوسفات التي تحتوي على 50 مم نا2هبو4 (pH 8.0) و 300 ملم كلوريد الصوديوم.
  2. السماح بأن رد فعل أوليجوميريزاتيون على المضي قدما في 25 درجة مئوية ح 48.
  3. تحليل الخليط رد فعل بالصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام التفريد) (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) كما هو موضح في الخطوة 6.

5-تصريف E90DOPA التجارة والنقل مع مسبار ألكاين واسطة سبوكق

  1. إضافة 1 ميليلتر Cy5.5 مرتبط أزاديبينزوسيكلوكتيني (Cy5.5-أديبو)22 في ح2س (4.0 ملم) (10 equiv. للتجارة والنقل-E90DOPA) للتوصل إلى حل من 20 ميليلتر للتجارة والنقل-E90DOPA (20 ميكرومتر) في المخزن مؤقت فوسفات التي تحتوي على 50 مم نا2هبو4 (pH 8.0) و 300 ملم كلوريد الصوديوم.
  2. إضافة فوق يودات 1 ميليلتر من الصوديوم في ح2س (400 ميكرون) (1.0 equiv. للتجارة والنقل-E90DOPA) إلى خليط التفاعل.
  3. السماح بأن رد فعل سبوكق على المضي قدما في 25 درجة مئوية ح 1. إذا كان يتم استخدام مجس حساسة للضوء، تغطية وعاء التفاعل مع رقائق الألومنيوم.

6-تنقية التجارة والنقل المسماة

  1. تمييع الخليط رد فعل سبوكق بإضافة المخزن مؤقت فوسفات، التي تحتوي على 50 مم نا2هبو4 (pH 8.0) و 300 ملم كلوريد الصوديوم، تصل إلى 500 ميليلتر.
  2. نقل الحل المخفف لعمود دوران تصفية الطرد مركزي. الطرد المركزي عمود الدوران في 14,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وتجاهل التدفق من خلال. كرر هذه الخطوة 3 x من أجل إزالة أي فائض Cy5.5-أديبو.
  3. نقل العينة المنقي من عمود الدوران إلى أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي.
  4. وبدلاً من ذلك، القيام بتنقية بالغسيل الكلوي ضد المخزن المؤقت نفسه.
  5. مخزن التجارة والنقل المنقاة في 4 درجات مئوية.

7-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة التحليل وجل Fluorescence المسح الضوئي

  1. إعداد عينات البروتين لتحليل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة عن طريق إضافة 5 ميليلتر من البروتين عينة المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد)، والمسمى 2 ميليلتر من DTT (1.00 م) إلى 13 ميليلتر المنقي أو الخام، التجارة والنقل (13.6 ميكرومتر أو 0.38 مغ/مل). لتحليل التجارة والنقل أوليجوميريك، استخدم أعلى تركيز للتجارة والنقل (67.8 ميكرومتر أو 1.9 ملغ/مل). تؤذي البروتينات التي تفرخ لهم عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  2. ضع جل كاسيت (جل premade التي تم شراؤها، وأشرطة الكاسيت) مكررا-تريس الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 4 إلى 12% إلى الخلية التفريد وإضافة المخزن مؤقت قيد تشغيل (انظر الجدول للمواد). تحميل عينات البروتين وعلامة وزن الجزيئي. تشغيل التفريد لمدة 35-40 دقيقة في 200 V.
    ملاحظة: تجنب أي تعرض عينات البروتين الضوء بالقيام بجميع العمليات في الظلام، للتقليل إلى أدنى حد تبيض صور المسبار الفلورسنت.
  3. استخدام ماسح ضوئي الأسفار للتصوير بالأسفار. التفاف بروتين هلام من التفريد ووضعه على ماسح ضوئي الأسفار. مسح الجل باستخدام إعداد الطول موجي مناسب. ل Cy5.5، حدد وضع Cy5 المنصوص عليها في برنامج الماسح الضوئي.
  4. وصمة عار للهلام مع بروتين تجاري تلطيخ كاشف.

8-استخدام-TOF الكتلي بالهضم التربسين

  1. احتضان 100 ميليلتر من المنقي بروتينات فلورية خضراء-E90DOPA (2.2 ملغ/مل أو 80 ميكرومتر) في المخزن مؤقت الذي يحتوي على 50 مم تريس-HCl (pH 8.0)، 0.1% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي، و 25 مم DTT عند 60 درجة مئوية ح 1.
  2. أضف 1 ميليلتر من إيودواسيتاميدي في ح2س (الأكاديمية، 4.0 M) (500 equiv. للتجارة والنقل-E90DOPA) إلى الحل بروتينات فلورية خضراء-E90DOPA المنقي (80 ميكرومتر) في المخزن المؤقت لنفسه. احتضان هذا الخليط عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الحماية من الضوء.
  3. هضم العينة E90DOPA التجارة والنقل عن طريق إضافة التربسين (مبطلات للركيزة البروتين نسبة [w/w] 1: 100)، واحتضان الخليط رد الفعل عند 37 درجة مئوية ح 4.
  4. تنقية العينة الببتيد هضمها باستخدام أسلوب ديسالتينج مع أعمدة الدوران18 ج.
  5. تحليل الببتيدات هضمها بالمبلغ عنها البروتوكول المتعلق بالليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين وقت الطيران الطيف الكتلي (TOF استخدام MS) باستخدام حامض ألفا-سيانو-4-هيدروكسيسيناميك (تشكا) ك مصفوفة23.

النتائج

نظام التعبير مباشرة إدراج بيوسينثيسيزيد دوبا من لافوري يرد في الشكل 1. وتوضع في بلازميد الجينات لزوج aa-الحمض الريبي النووي النقال و aaRS تطورت، وبروتينات فلورية خضراء الجينات (التجارة والنقل-E90TAG) التي تحتوي على كودون العنبر في موقف 90 يقع في بلازميد آخر لتقي?...

Discussion

ويرد في هذا البروتوكول، الحيوي والإدماج المباشر من دوبا. الخلية البكتيرية المستخدمة في هذا الأسلوب يمكن توليف حمض أميني إضافية واستخدامها بوصفها لبنة غير طبيعي تخليق البروتين. تم إدراج الوراثية للأحماض الأمينية غير طبيعي تكنولوجيا رئيسية لتطوير الكائنات الحية غير طبيعي مع رمز الوراثية ...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

هذا البحث كان يدعمها "برنامج بحوث الحدود العالمية" (جبهة الخلاص الوطني-2015M3A6A8065833)، و "علوم البحث البرنامج الأساسي" (2018R1A6A1A03024940) عن طريق الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) التي تمولها حكومة كوريا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAGoptionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS21. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10βInvitrogenC6400-03Expression Host
Plasmid Mini-prep kitNucleogen5112200/pack
AgaroseIntron biotechnology32034500 g
Ethidium bromideAlfa AesarL074821 g
LB BrothBD Difco244620500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser BIO-RAD165-2100
Micro pulser cuvetteBIO-RAD165-20890.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin SodiumWako018-1037225 g
ChloramphenicolAlfa AesarB2084125 g
AgarSAMCHUN214230500 g
SOC mediumSigmaS1797100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99%Acros104981000100 g
Pyrocatechol, 99%SAMCHUNP138725 g
Ammonium sulfate, 99%SAMCHUNA0943500 g
pyruvic acid, 98%Alfa AesarA13875100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99%SAMCHUNS08911 kg
Potassium phophate, monobasic, 99%SAMCHUNP11271 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99%SAMCHUNM01461 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99%SAMCHUND0092500 g
Glycerol, 99%SAMCHUNG02691 kg
Trace metal mix a5 with coSigma9294925 mL
L-Proline, 99%SAMCHUNP125725 g
L-Phenylalanine, 98.5%SAMCHUNP198225 g
L-TryptophaneJUNSEI49550-031025 g
L-Arginine, 98%SAMCHUNA114925 g
L-Glutamine, 98%JUNSEI27340-031025 g
L-Asparagine monohydrate, 99%SAMCHUNA119825 g
L-MethionineJUNSEI73190-041025 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99%SAMCHUNH060425 g
L-Threonine, 99%SAMCHUNT293825 g
L-LeucineJUNSEI87070-031025 g
Glycine, 99%SAMCHUNG028625 g
L-Glutamic acid, 99%SAMCHUNG023325 g
L-Alanine, 99%SAMCHUNA154325 g
L-Isoleucine, 99%SAMCHUNI104925 g
L-Valine, 99%SAMCHUNV008825 g
L-SerineSAMCHUNS244725 g
L-Aspartic acidSAMCHUNA120525 g
L-Lysine monohydrochloride, 99%SAMCHUNL059225 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99%SAMCHUNI05781kg
Sodium phosphate monobasic, 98%SAMCHUNS09191 kg
Sodium Chloride, 99%SAMCHUNS29071 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 millilitersSONIC & MATERIALSVCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resinQIAGEN3021025 mL
Polypropylene columnQIAGEN3492450/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA 
Sodium periodate, 99.8&Acros4196100505 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) 
Cy5.5-ADIBO FutureChemFC-61191mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal FiltersMILLIPOREUFC50039696/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 %Sigma1070898400110 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4XThermofisherNP000710 mL
MES running bufferThermofisherNP0002500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gelsThermofisherNO032112 well
Coomassie Brilliant Blue R-250Wako031-1792225 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging SystemSyngeneG BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%SAMCHUNT1351500 g
Hydrochloric acid, 35~37%SAMCHUNH0256500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85%SAMCHUND1070250 g
IodoacetamideSigmaI61255 g
Trypsin Protease, MS GradeThermofisher900575 x 20 µg/pack
C-18 spin columnsThermofisher8987025/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5%SAMCHUNA0125500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acidSigmaC202010 g
Trifluoroacetic acid, 99%SAMCHUNT1666100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targetsBruker8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometerBruker

References

  1. Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis. Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).
  2. Pinder, R. M. Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism. Nature. 228 (5269), 358 (1970).
  3. Waite, J. H., Tanzer, M. L. Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline. Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).
  4. Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. Single-molecule mechanics of mussel adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).
  5. Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis. Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).
  6. Waite, J. H., Qin, X. Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis. Biochemistry. 40 (9), 2887-2893 (2001).
  7. Nicklisch, S. C., Waite, J. H. Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion. Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).
  8. Silverman, H. G., Roberto, F. Understanding marine mussel adhesion. Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).
  9. Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. Mussel-inspired adhesives and coatings. Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).
  10. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine. ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).
  11. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker. Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).
  12. Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex. Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).
  13. Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes. Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).
  14. Borrmann, E., et al. Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).
  15. Ayyadurai, N., et al. Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein. Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).
  16. Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery. Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).
  17. Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).
  18. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
  21. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  23. Gobom, J., et al. Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics. Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).
  24. Mukai, T., et al. Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon. Scientific Reports. 5, 9699 (2015).
  25. Lajoie, M. J., et al. Genomically recoded organisms expand biological functions. Science. 342 (6156), 357-360 (2013).
  26. Bryson, D. I., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases. Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).
  27. Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).
  28. Lee, S., et al. A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones. Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).
  29. Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).
  30. Lang, K., Chin, J. W. Bioorthogonal reactions for labeling proteins. ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).
  31. Lang, K., Chin, J. W. Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  32. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  33. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

138 1 2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved