Incorporación genética de biosintetizada a partir de L-dopa (DOPA) y su aplicación a la conjugación de proteínas

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la incorporación genética de L-dopa biosintetizada a partir de materiales partidos simples y su aplicación a la conjugación de proteínas.

Resumen

L-dopa (DOPA) es un aminoácido encontrado en la biosíntesis de catecolaminas en animales y plantas. Debido a sus propiedades bioquímicas, el aminoácido tiene múltiples usos en aplicaciones bioquímicas. Este informe describe un protocolo para la incorporación genética de biosynthesized DOPA y su aplicación a la conjugación de proteínas. El DOPA es biosintetizada a partir de una tirosina fenol-liasa (TPL) de catecol, piruvato y amoníaco, y el aminoácido se incorpora directamente a las proteínas por el método de incorporación genética mediante un evolucionado aminoacil-tRNA y aminoacil-tRNA sintetasa par. Este sistema de incorporación directa incorpora eficientemente DOPA con poca incorporación de otros aminoácidos naturales y con mejor rendimiento de proteína que el sistema anterior de la incorporación genética de DOPA. Conjugación de proteínas con proteínas que contienen el DOPA es eficiente y site-specific y demuestra su utilidad para diversas aplicaciones. Este protocolo proporciona a los científicos de la proteína con los procedimientos detallados para la eficiente biosíntesis de proteínas del mutante que contiene DOPA en sitios deseados y su conjugación para aplicaciones industriales y farmacéuticas.

Introducción

DOPA es un aminoácido implicado en la biosíntesis de catecolaminas en animales y plantas. Este aminoácido es sintetizado de Tyr por tirosina hidroxilasa y oxígeno molecular (O₂)¹. Porque se DOPA es un precursor de la dopamina y puede penetrar la barrera hematoencefálica, se ha utilizado en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson². DOPA también se encuentra en proteínas de la adherencia del mejillón (mapas), que son responsables de las propiedades adhesivas de los mejillones en condiciones mojadas^3,4,5,6,7. Tyr se codifica inicialmente en las posiciones donde DOPA se encuentra en los mapas y luego se convierte en DOPA tyrosinases^8,9. Debido a sus interesantes propiedades bioquímicas, la DOPA se ha utilizado en una variedad de aplicaciones. El grupo dihydroxyl de DOPA es químicamente propenso a la oxidación, y el aminoácido se convierte fácilmente en L-dopaquinona, un precursor de la melanina. Debido a su alta electrophilicity, L-dopaquinona y sus derivados se han utilizado para la reticulación y la conjugación con tioles y aminas^10,11,12,13. 1, 2-quinonas también pueden funcionar como un dieno de reacciones de cicloadición y han utilizado para bioconjugation promovido de tensión controlada por oxidación cyclooctyne-1,2-quinona (SPOCQ) cicloadición¹⁴. Además, el grupo dihydroxyl puede quelar iones metálicos como el Fe^{3 +} y Cu^{2 +}, y las proteínas que contienen DOPA se han utilizado para el suministro de medicamentos e iones metálicos detección^15,16.

DOPA ha sido genéticamente incorporado en las proteínas mediante una ortogonal Aminoacil-ARNt (aa-ARNt) y el aminoacil-tRNA sintetasa (aaRS) par¹⁷ y utiliza para proteína Conjugación y reticulación^{10,11, 12,13}. En este informe, se describen los resultados experimentales y protocolos para la incorporación genética de DOPA biosintetizada a partir de materias primas baratas y sus aplicaciones a bioconjugation. El DOPA es biosynthesized usando una TPL y a partir de catecol, piruvato y amoníaco en Escherichia coli. Biosynthesized DOPA se incorpora directamente en proteínas expresando un par aa-tRNA y aaRS evolucionado para DOPA. Además, la proteína biosynthesized con DOPA site-specifically se conjuga con una sonda fluorescente y reticulado para producir oligomeros de proteína. Este Protocolo será útil para los científicos de la proteína, para sintetizar las proteínas mutantes con DOPA y conjugar las proteínas con sondas bioquímicas o drogas para aplicaciones industriales y farmacéuticas.

Protocolo

1. construcción de plásmido

1. Construir un plásmido de expresión (pBAD-doble-TPL-GFP-WT) que expresa el gen de la TPL de Citrobacter freundii bajo el control de un promotor constitutivo y el gen de la proteína verde fluorescente (GFP) con sus₆-etiqueta bajo el control de la promotor de araBAD. PBAD-doble-TPL-GFP-E90TAG, sustituya el codón para el sitio (E90) de DOPA con un codón ámbar (etiqueta), utilizando un protocolo de mutagénesis sitio-dirigida. Los detalles para la construcción de este plásmido fue descrito en el informe anterior¹⁸.
2. La construcción de un tRNA/aaRS-expresando plásmido (pEVOL-DHPRS2)^18,19 para la incorporación genética de DOPA. pEVOL es un vector plásmido especial expresando dos copias de genes de aaRS con promotores independientes, y toda la información del plásmido se describe en un anterior informe¹⁹.
3. Utilizar kits de preparación de plásmidos disponibles comercialmente para obtener alta pureza plásmido DNAs. Comprobar la pureza de los DNAs preparados mediante electroforesis en gel de agarosa, si es necesario.

2. cultura preparación

1. Electroporación
   1. Uso electro-competente e. coli cepa de DH10β para este experimento. Añadir 1 μl de cada plásmido ADN (pEVOL DHPRS2 y pBAD-doble-TPL-GFP-E90TAG) a 20 μl de células competentes. Mezclar ligeramente para hacer una mezcla homogénea, utilizando una pipeta.
   2. Transferir la mezcla a las cubetas de electroporación. Colocar la cubeta en la cámara de electroporación. Empuje la cubeta hacia la cámara para hacer firme cubeta-cámara de contacto.
   3. Choque de la cubeta, usando 25 μF y 2,5 kV para cubetas de 0.1 cm.
   4. Añadir 1 mL de caldo super óptima precalentado (SOC), que contiene 2% (w/v) triptona, 0.5% (p/v) de levadura extracto, NaCl 10 mM, 2,5 mM KCl, 10 mM de MgCl₂y 20 mM de glucosa, a la cubeta y transferir las células a un tubo de cultivo. Rescatar a las células por la incubación por 1 h a 37 ° C con agitación.
   5. Extensión 10-100 μl de las células rescatadas en una placa de agar de lisogenia caldo (LB) que contiene 35 μg/mL cloranfenicol y ampicilina 100 de μg/mL. Incube las células a 37 ° C por 16 h.
2. Preparación de la cultura de arrancador
   1. Inocular una colonia transformada solo en 5 mL de medio LB que contengan antibióticos. Incubar la colonia durante 12 h a 37 ° C con agitación.

3. expresión y purificación de GFP-E90DOPA por un sistema de biosíntesis

1. Expresión de GFP-E90DOPA por un sistema de biosíntesis
   1. Transferencia de la cultura de arrancador (2 mL) en 100 mL de medio de PA-5052²⁰ (50 mM de Na₂HPO₄, 50 m m KH₂PO₄, 25 mM [NH₄]₂para₄, 2 mM MgSO₄, 0.1% [p/v] trazar metales, 0.5% [p/v] de glicerol, 0.05% [p/v] de glucosa y aminoácidos 5% [p/v] [pH 7.25]) que contiene 35 cloranfenicol μg/mL, 100 ampicilina μg/mL, 100 mM piruvato, catecol de 10 mM, amoníaco 25 mM y 300 μm dithiothreitol (DTT) seguido de una incubación a 30 ° C con agitación.
   2. Añadir 2 mL de 0.2% (w/v) L-arabinose cuando la densidad óptica (OD) a 550 nm alcanza 0.8. Incubar la muestra durante 12 h a 30 ° C con agitación.
   3. Desactivación de las células a 11.000 x g durante 5 min, descartar el sobrenadante y congelar el precipitado de células a-80 ° C.
2. Lisis de la célula
   1. Descongelar el precipitado de células en el hielo y resuspender las células en 10 mL de tampón de lisis que contienen 50 mM NaH₂PO₄ (pH 8.0), imidazol de 10 mM y 300 mM de NaCl.
   2. Someter a ultrasonidos las células resuspendidas en hielo durante 10 minutos amplitud de sonicación de 80% de uso con un pulso de 25 s s 35 y en off.
   3. Desactivación de la célula lisada a 18.000 x g a 4 ° C por 15 min. traslado el sobrenadante a un tubo nuevo para la purificación y descartar el precipitado.
3. Cromatografía de afinidad ni-NTA
   1. Añadir resina (ácido nitrilotriacético) de Ni-NTA (300 μL de suspensión de la resina para una cultura de 100 mL) en el sobrenadante y las proteínas se unen a la resina de Ni-NTA a 4 ° C agitando suavemente la suspensión durante 1 hora.
   2. Transferir la suspensión a una columna de polipropileno y resina 3 x con 5 mL de tampón de lavado que contiene 50 mM NaH₂PO₄ (pH 8.0), imidazol de 20 mM y 300 mM de NaCl.
   3. Eluir las proteínas 3 x con 300 μL de tampón de elución que contiene 50 mM NaH₂PO₄ (pH 8.0), imidazol de 250 mM y 300 mM de NaCl.
   4. Determinar la concentración de proteína mediante la medición de la absorbancia a 280 nm. El coeficiente de extinción (24.630 M^-1cm^-1) para la GFP-E90DOPA a 280 nm se calculó mediante una calculadora de coeficiente de extinción de la proteína (e.g., https://web.expasy.org/protparam/) y la extinción independientemente medida coefficiennt (2630 M^-1cm^-1) para DOPA. Como método alternativo, utilizar la proteína de Bradford ensayo²¹ para una determinación de la concentración de proteína.

4. Oligomerización de GFP-E90DOPA purificado

1. Añadir 1 μl de sodio periodato en H₂O (6 mM) (1,0 equiv a GFP-E90DOPA) a una solución de 20 μl de GFP-E90DOPA (300 μm) en un tampón fosfato que contiene 50 mM de Na₂HPO₄ (pH 8.0) y 300 mM de NaCl.
2. Permita que la reacción de Oligomerización proceder a 25 ° C durante 48 h.
3. Analizar la mezcla de reacción por electroforesis dodecyl del gel del sulfato-poliacrilamida del sodio) (SDS-PAGE) como se describe en el paso 6.

5. la conjugación de GFP-E90DOPA con una sonda de alquino por SPOCQ

1. Añadir 1 μl de azadibenzocyclooctyne Cy5.5-ligado (Cy5.5 ADIBO)²² en H₂O (4,0 mM) (10 equiv a GFP-E90DOPA) a una solución de 20 μl de GFP-E90DOPA (20 μm) en un tampón fosfato que contiene 50 mM de Na₂HPO₄ (pH 8.0) y 300 mM de NaCl.
2. Añadir 1 μl de sodio periodato en H₂O (400 μm) (1,0 equiv a GFP-E90DOPA) a la mezcla de reacción.
3. Permita que la reacción de SPOCQ proceder a 25 ° C durante 1 hora. Si se utiliza una sonda sensible a la luz, cubra el recipiente de la reacción con papel de aluminio.

6. purificación de la GFP marcado

1. Diluir la mezcla de reacción de SPOCQ mediante la adición de un tampón de fosfato, que contiene 50 mM de Na₂HPO₄ (pH 8.0) y 300 mM de NaCl, hasta 500 μl.
2. Transferencia de la solución diluida a una columna de spin filtro centrífugo. Centrifugar la columna vuelta a 14.000 x g a 4 ° C por 15 min y descartar el flujo a través. Repita este paso x 3 para quitar cualquier exceso Cy5.5-ADIBO.
3. Transferir la muestra purificada de la columna de spin a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
4. Por otra parte, llevar a cabo una purificación por diálisis contra el mismo buffer.
5. Tienda la GFP purificada a 4 ° C.

7. fluorescencia y análisis SDS-PAGE Gel análisis

1. Preparar muestras de proteínas para análisis de SDS-PAGE al añadir 5 μl de tampón de proteínas (véase Tabla de materiales) y 2 μl de la TDT (1.00 M) a 13 μl de purificado, o crudo, GFP (13,6 μm o 0,38 mg/mL). Para un análisis de los GFP, use una concentración más alta de GFP (67,8 μm o 1,9 mg/mL). Desnaturalizar las proteínas por incubar a 95 ° C durante 10 minutos.
2. Coloque un cassette de 4% - 12% Bis-Tris SDS-PAGE gel (gel comprado, premade cassettes) a la célula de electroforesis y añadir un buffer de corriente (véase Tabla de materiales). Cargar las muestras de proteína y un marcador de peso molecular. Correr la electroforesis durante 35-40 min a 200 V.
   Nota: Evite cualquier exposición de las muestras de proteínas a la luz llevando a cabo todos los procesos en la oscuridad, para minimizar la foto-blanqueo de la sonda fluorescente.
3. Utilizar un escáner de fluorescencia para imágenes de fluorescencia. Envuelva un gel de electroforesis de proteína y coloque en un escáner de fluorescencia. Escanear el gel con un valor de longitud de onda adecuada. Para Cy5.5, selecciona el modo de Cy5 en el software del escáner.
4. Teñir el gel con una proteína comercial reactivo de tinción.

8. uso de MALDI-TOF MS análisis por digestión de la tripsina

1. Incubar 100 μl de purificada GFP-E90DOPA (2,2 mg/mL o 80 μm) en un tampón que contiene 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0.1% (p/v) de SDS y TDT de 25 mM a 60 º C durante 1 hora.
2. Añadir 1 μl de Yodoacetamida en H₂O (IAA, 4.0 M) (500 equiv a GFP-E90DOPA) a la solución purificada de GFP-E90DOPA (80 μm) en el mismo buffer. Incubar la mezcla a 25 ° C por 30 min con la protección de la luz.
3. Digerir la muestra de GFP-E90DOPA mediante la adición de tripsina (1: 100 proteasa-a-sustrato-relación [w/w]) e incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 4 horas.
4. Purificar la muestra digerida péptido mediante un método estándar de desalación con columnas de vuelta C₁₈ .
5. Análisis de los péptidos digeridos por el protocolo reportado por láser asistida por matriz de desorción/ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) utilizando ácido de alfa-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) como una matriz de²³.

Resultados

El sistema de expresión para la incorporación directa de DOPA biosintetizada a partir de una TPL se muestra en la figura 1. Los genes para el par de aa-tRNA y aaRS evolucionado se colocan en un plásmido y el gen de la GFP (GFP-E90TAG) que contiene un codón ámbar en la posición 90 se encuentra en otro plásmido para evaluar la incorporación de la DOPA por la fluorescencia de GFP. El gen de la TPL se coloca en el mismo plásmido de expresión que contien...

Discusión

En este protocolo, se describen la biosíntesis y la incorporación directa de DOPA. La célula bacteriana utilizada en este método puede sintetizar un aminoácido adicional y utilizarlo como un bloque de construcción natural para la síntesis de proteínas. La incorporación genética de aminoácidos no naturales ha sido una tecnología clave para el desarrollo del organismo artificial con un código genético expandido. Sin embargo, este método ha sido técnicamente incompleta y se está modificando para mejorar la ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG			optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS2			1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10β	Invitrogen	C6400-03	Expression Host
Plasmid Mini-prep kit	Nucleogen	5112	200/pack
Agarose	Intron biotechnology	32034	500 g
Ethidium bromide	Alfa Aesar	L07482	1 g
LB Broth	BD Difco	244620	500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser	BIO-RAD	165-2100
Micro pulser cuvette	BIO-RAD	165-2089	0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium	Wako	018-10372	25 g
Chloramphenicol	Alfa Aesar	B20841	25 g
Agar	SAMCHUN	214230	500 g
SOC medium	Sigma	S1797	100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99%	Acros	104981000	100 g
Pyrocatechol, 99%	SAMCHUN	P1387	25 g
Ammonium sulfate, 99%	SAMCHUN	A0943	500 g
pyruvic acid, 98%	Alfa Aesar	A13875	100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99%	SAMCHUN	S0891	1 kg
Potassium phophate, monobasic, 99%	SAMCHUN	P1127	1 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99%	SAMCHUN	M0146	1 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99%	SAMCHUN	D0092	500 g
Glycerol, 99%	SAMCHUN	G0269	1 kg
Trace metal mix a5 with co	Sigma	92949	25 mL
L-Proline, 99%	SAMCHUN	P1257	25 g
L-Phenylalanine, 98.5%	SAMCHUN	P1982	25 g
L-Tryptophane	JUNSEI	49550-0310	25 g
L-Arginine, 98%	SAMCHUN	A1149	25 g
L-Glutamine, 98%	JUNSEI	27340-0310	25 g
L-Asparagine monohydrate, 99%	SAMCHUN	A1198	25 g
L-Methionine	JUNSEI	73190-0410	25 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99%	SAMCHUN	H0604	25 g
L-Threonine, 99%	SAMCHUN	T2938	25 g
L-Leucine	JUNSEI	87070-0310	25 g
Glycine, 99%	SAMCHUN	G0286	25 g
L-Glutamic acid, 99%	SAMCHUN	G0233	25 g
L-Alanine, 99%	SAMCHUN	A1543	25 g
L-Isoleucine, 99%	SAMCHUN	I1049	25 g
L-Valine, 99%	SAMCHUN	V0088	25 g
L-Serine	SAMCHUN	S2447	25 g
L-Aspartic acid	SAMCHUN	A1205	25 g
L-Lysine monohydrochloride, 99%	SAMCHUN	L0592	25 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99%	SAMCHUN	I0578	1kg
Sodium phosphate monobasic, 98%	SAMCHUN	S0919	1 kg
Sodium Chloride, 99%	SAMCHUN	S2907	1 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters	SONIC & MATERIALS	VCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin	QIAGEN	30210	25 mL
Polypropylene column	QIAGEN	34924	50/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA
Sodium periodate, 99.8&	Acros	419610050	5 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ)
Cy5.5-ADIBO	FutureChem	FC-6119	1mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters	MILLIPORE	UFC500396	96/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 %	Sigma	10708984001	10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X	Thermofisher	NP0007	10 mL
MES running buffer	Thermofisher	NP0002	500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels	Thermofisher	NO0321	12 well
Coomassie Brilliant Blue R-250	Wako	031-17922	25 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System	Syngene		G BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%	SAMCHUN	T1351	500 g
Hydrochloric acid, 35~37%	SAMCHUN	H0256	500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85%	SAMCHUN	D1070	250 g
Iodoacetamide	Sigma	I6125	5 g
Trypsin Protease, MS Grade	Thermofisher	90057	5 x 20 µg/pack
C-18 spin columns	Thermofisher	89870	25/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5%	SAMCHUN	A0125	500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Sigma	C2020	10 g
Trifluoroacetic acid, 99%	SAMCHUN	T1666	100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targets	Bruker	8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer	Bruker