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요약

여기, 우리가 현재 간단한 시작 소재로 L dihydroxyphenylalanine biosynthesized의 유전 결합 그리고 단백질 활용에의 응용에 대 한 프로토콜.

초록

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) catecholamines 동물 및 식물의 생 합성에는 아미노산 이다. 그것의 특정 생 화 확 적인 특성 때문에 아미노산 생화학 응용 프로그램에서 여러 사용 하고있다. 이 보고서 biosynthesized DOPA의 유전자 결합에 대 한 프로토콜 및 단백질 활용의 응용에 설명합니다. DOPA는 티로신 페 놀-lyase (TPL) catechol, pyruvate, 암모니아에서 의해 biosynthesized 이며 아미노산 진화 aminoacyl-tRNA와 aminoacyl-tRNA 합성 쌍을 사용 하 여 유전 결합 방법으로 단백질에 직접 통합 됩니다. 이 직접 설립 시스템 DOPA에 대 한 이전 유전 법인 시스템 보다 더 나은 단백질 수확량과 다른 천연 아미노산의 작은 합동 DOPA을 효율적으로 통합. DOPA 포함 된 단백질 단백질 활용 효율적이 고 사이트 이며 다양 한 응용 프로그램에 대 한 그것의 유용성을 보여줍니다. 이 프로토콜 단백질 과학자를 DOPA 원하는 사이트와 산업 및 제약 응용 프로그램에 대 한 그들의 활용을 포함 하는 돌연변이 단백질의 효율적 생 합성에 대 한 자세한 절차를 제공 합니다.

서문

DOPA는 catecholamines 동물 및 식물의 생 합성에 관련 된 아미노산 이다. 이 아미노산 티로신 hydroxylase 및 분자 산소 (O2)1에 의해 티 르에서 합성 됩니다. DOPA 도파민의 선구자 이며, 혈액-뇌 장벽 침투 수, 때문에 그것은2파 킨 슨 병 치료에 사용 되었습니다. DOPA 홍합 접착 단백질 (지도), 젖은 조건3,,45,,67에 홍합의 접착 속성에 대 한 책임은에 발견 된다. Tyr는 처음 DOPA 지도에서 발견 되는 tyrosinases8,9DOPA로 변환 됩니다 위치에 인코딩됩니다. 그것의 재미 있는 생 화 확 적인 특성 때문에 DOPA 다양 한 응용 프로그램에에서 사용 되었습니다. DOPA의 dihydroxyl 그룹은 화학적으로 산화, 경향이 그리고 아미노산 L-dopaquinone, melanins의 선구자로 쉽게 변환 됩니다. 그것의 높은 electrophilicity 때문에 L-dopaquinone와 그 파생 상품 가교 및 thiols 및 아민10,11,,1213와 활용에 대 한 사용 되었습니다. 1, 2-퀴 논 디 엔 cycloaddition 반응에 대 한 기능을 할 수 하 고 스트레인 승진 산화 제어 cyclooctyne-1, 2-quinone (SPOCQ) cycloaddition14bioconjugation에 대 한 사용 되었습니다. 또한, dihydroxyl 그룹 Fe3 + 와 Cu2 +같은 금속 이온을 킬레이트 수 고 DOPA를 포함 하는 단백질 약물 전달 및15,16을 감지 하는 금속 이온에 대 한 이용 되었습니다.

DOPA 유전자 단백질에는 직교 aminoacyl-tRNA (금주 모임-tRNA)와 aminoacyl-tRNA 합성 (aaRS) 쌍17 을 사용 하 여 통합 되었으며 사용 단백질 활용 및 가교10,11, 12,13. 이 보고서에서 실험 결과 프로토콜 DOPA biosynthesized 저렴 한 원자재와 bioconjugation 응용 프로그램에서의 유전 결합을 설명 합니다. DOPA biosynthesized TPL을 사용 하 고 catechol, pyruvate, 및 대장균에서 암모니아에서 출발 이다. DOPA biosynthesized DOPA에 대 한 진화 aa-tRNA와 aaRS 쌍으로 표현 하 여 단백질에 직접 통합 됩니다. 또한, 포함 된 DOPA biosynthesized 단백질 site-specifically 형광 프로브와 단백질 올리고 생산 가교 된 활용 된. 이 프로토콜와 단백질 생화학 프로브 또는 산업 및 제약 응용 프로그램에 대 한 약물을 켤레 biosynthesize 돌연변이 단백질 DOPA 포함 된 단백질 과학자에 대 한 유용할 것입니다.

프로토콜

1. 플라스 미드 건설

  1. 제정 발기인의 통제 Citrobacter freundii 에서 TPL 유전자와는 그의 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자를 표현 하는 식 플라스 미드 (pBAD-듀얼-TPL-GFP-WT) 생성6-태그의 통제는 araBAD 발기인입니다. PBAD-듀얼-TPL-GFP-E90TAG, (E90) 사이트에 대 한 codon의 사이트 지시 된 mutagenesis 프로토콜을 사용 하 여 호박 codon (태그)와 DOPA 교체 합니다. 이 플라스 미드의 건설에 대 한 자세한 내용은 우리의 이전 보고서18에서 설명 했다.
  2. TRNA/aaRS 표현 플라스 미드 (pEVOL-DHPRS2)18,19 DOPA의 유전자 결합에 대 한 생성 합니다. pEVOL 독립적인 발기인 aaRS 유전자의 두 복사본을 표현 하는 특별 한 플라스 미드 벡터 이며, 플라스 미드의 자세한 정보는 이전 보고서19에서 설명 합니다.
  3. 고 순도 플라스 미드 DNAs를 상업적으로 사용할 수 있는 플라스 미드 준비 키트를 사용 합니다. 필요한 경우에 agarose 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 준비한 DNAs의 순도 확인 합니다.

2. 문화 준비

  1. Electroporation
    1. 이 실험에 대 한 사용 전기 유능한 대장균 DH10β 스트레인. 유능한 세포의 20 µ L를 각 플라스 미드 DNA (pEVOL-DHPRS2와 pBAD-듀얼-TPL-GFP-E90TAG)의 1 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 만들기 위해 그들을 피 펫을 사용 하 여 균질 혼합 믹스.
    2. Electroporation 큐 벳에 혼합물을 전송. 장소 electroporation 약 실에 있는 베트입니다. 회사 베트-챔버 수 있도록 챔버에는 베트를 밀어 문의.
    3. 멧, 25 µ F를 사용 하 여 충격 및 2.5 kV 0.1 cm 큐 벳을 위해.
    4. 1 mL prewarmed 슈퍼 최적의 국물 (SOC)의 2% (w/v) tryptone 포함 된 추가, 0.5% (w/v) 추출, 10 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 10mm MgCl2, 및 베트에 20 mM 포도 당을 효 모 문화 관에는 셀을 전송. 떨고와 37 ° C에서 1 시간에 대 한 그들을 배양 하 여 세포를 구출.
    5. 10-100 µ L 35 µ g/mL 페니와 100 µ g/mL 암 피 실린 포함 된 lysogeny 국물 (파운드) 한 접시에 구조 세포의 확산. 16 h 37 ° C에서 세포를 품 어.
  2. 초보 문화 준비
    1. 단일 변환 된 식민지 파운드 매체 포함 된 항생제의 5 mL에 접종 떨고와 37 ℃에서 12 h에 대 한 식민지를 품 어.

3. 표현과 GFP-E90DOPA 생 합성 시스템의 정화

  1. GFP E90DOPA 생 합성 시스템에 의해 표현
    1. PA-5052 중간20 (50 m m 나2HPO4, 50 m m KH2포4, 25 mM [NH4]24, 2mm MgSO4, 0.1% [w/v] 추적 금속, 0.5% [w/v] 글리세롤, 그래서 100 mL를 선발 문화 (2 mL)를 전송 0.05% [w/v] 포도 당, 및 5% [w/v] 아미노산 [pH 7.25]) 떨고와 30 ° C에 외피 다음 35 µ g/mL 페니, 100 µ g/mL 암 피 실린, 100 mM pyruvate, 10 m m catechol, 25 mM 암모니아, 그리고 300 µ M dithiothreitol (DTT).
    2. 때 0.2% (w/v) L arabinose의 2 개 mL를 추가 550 nm에 도달 0.8에서 광학 밀도 (OD). 떨고와 30 ° C에 12 h에 대 한 샘플을 품 어.
    3. 5 분 11000 x g에서 셀 아래로 회전, 상쾌한, 삭제 시키고-80 ° c.에 셀 펠 릿을 동결
  2. 세포 세포의 용 해
    1. 얼음에 셀 펠 릿을 녹여 및 50 mM NaH2포4 (pH 8.0)를 포함 하는 세포의 용 해 버퍼의 10 mL에 셀 resuspend 10 m m 이미, 및 300 mM NaCl.
    2. 25의 10 분 사용 80% 쥡니다 진폭 펄스에 대 한 얼음에 resuspended 셀 sonicate s 오프 및 35 s.
    3. 15 분 이전에 상쾌한 정화에 대 한 신선한 튜브 4 ° C에서 18000 x g에서 lysate 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 펠 릿을 삭제.
  3. Ni NTA 친화성 크로마토그래피
    1. 상쾌한에 Ni NTA (nitrilotriacetic 산) 수 지 (100 mL 문화에 대 한 수 지 서 스 펜 션의 300 µ L)를 추가 하 고 부드럽게 흔들어 1 시간에 대 한 서 스 펜 션으로 단백질을 4 ° C에서 Ni NTA 수 지에 바인딩할.
    2. 폴 리 프로필 렌의 열 정지를 전송 하 고 3 수 지 세척 50mm NaH2포4 (pH 8.0)를 포함 하는 워시 버퍼의 5 mL x 20 m m 이미, 및 300 mM NaCl.
    3. 3 단백질을 elute 50mm NaH2포4 (pH 8.0)를 포함 하는 차입 버퍼의 300 µ L x 250 m m 이미, 및 300 mM NaCl.
    4. 280에서 흡 광도 측정 하 여 단백질 농도 결정 nm. 280에서 GFP-E90DOPA에 대 한 소멸 계수 (24,630 M-1c m-1) nm 단백질 소멸 계수 계산기를 (예, https://web.expasy.org/protparam/)와 독립적으로 측정 된 멸종에 의해 산출 되었다 coefficiennt (2630 M-1c m-1) DOPA 대체 방법으로 단백질 농도의 결심을 위한 Bradford 단백질 분석 결과21 을 사용 합니다.

4입니다. 순화 GFP-E90DOPA oligomerization

  1. 나트륨의 1 µ L H2O (6 m m) periodate 추가 (1.0 equiv. GFP E90DOPA를) GFP E90DOPA의 20 µ L의 솔루션 (300 μ M) 50mm 나2HPO4 (pH 8.0)를 포함 하는 인산 염 버퍼에 300 mm NaCl.
  2. 48 h 25 ° C에서 진행 oligomerization 반응을 수 있습니다.
  3. 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법에 의해 반응 혼합물 분석) (SDS 페이지) 6 단계에 설명 된 대로.

5. SPOCQ에 의해 Alkyne 프로브 GFP-E90DOPA의 활용

  1. Cy5.5 연결 azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO)22 H2O (4.0 m m) 1 µ L을 추가 (10 equiv. GFP E90DOPA를) GFP E90DOPA의 20 µ L의 솔루션 (20 µ M) 50mm 나2HPO4 (pH 8.0)를 포함 하는 인산 염 버퍼에서 300 mm NaCl.
  2. 나트륨의 1 µ L H2O periodate 추가 (400 µ M) (1.0 equiv. GFP E90DOPA에) 반응 혼합물에.
  3. 1 시간에 25 ° C에서 진행 SPOCQ 반응을 수 있습니다. 빛에 민감한 프로브를 사용 하는 알루미늄 호 일로 반응 배를 커버.

6입니다. 레이블이 GFP의 정화

  1. 50mm 나2HPO4 (pH 8.0)를 포함 하는 인산 염 버퍼를 추가 하 여 SPOCQ 반응 혼합물을 희석 및 300 mM NaCl, 최대 500 µ L.
  2. 원심 필터 스핀 열 희석된 솔루션을 전송 합니다. 15 분 동안 4 ° C에서 14000 x g 에서 스핀 열 원심 그리고 흐름을 통해 삭제. 어떤 초과 Cy5.5 ADIBO를 제거 하려면이 단계 3를 반복 합니다.
  3. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 스핀 열에서 정화 샘플을 전송.
  4. 또는, 동일한 버퍼에 대 한 투 석으로는 정화 실시 합니다.
  5. 4 ° c.에 순화 된 GFP를 저장

7. SDS 페이지 분석 및 형광 젤 검색

  1. 5 µ L의 단백질 견본 버퍼를 추가 하 여 SDS 페이지 분석 단백질 견본 준비 ( 재료의 표참조)와 2 µ L DTT (1.00 M)의 정화, 또는 원유, 13 µ L 표시 GFP (13.6 µ M 또는 0.38 mg/mL). Oligomeric GFP의 분석, GFP (67.8 µ M 또는 1.9 mg/mL)의 높은 농도 사용 하 여. 10 분 동안 95 ° C에서 배양 하 여 단백질을 변성.
  2. 전기 이동 법 셀 4%-12% 두번째-트리 스 SDS 페이지 젤 카세트 (구입, premade 젤 카세트)를 배치 하 고 실행 중인 버퍼 추가 ( 재료의 표참조). 단백질 견본 및 분자량 마커를 로드 합니다. 200 V에서 35-40 분 동안 전기 이동 법을 실행 합니다.
    참고: 단백질 샘플 사진 표백 형광 프로브의 최소화 하기 위해 어둠 속에서 모든 프로세스를 수행 하 여 빛의 어떤 노출을 피하십시오.
  3. 형광 스캐너를 사용 하 여 형광 이미징에 대 한. 단백질 젤 전기 이동 법에서 랩 하 고 형광 스캐너에 놓습니다. 적절 한 파장 설정을 사용 하 여 젤을 스캔. Cy5.5, 스캐너 소프트웨어에 제공 Cy5 모드를 선택 합니다.
  4. 상업적인 단백질 염색 시 약으로 젤을 얼룩.

8. MALDI TOF MS 분석 트립 신 소화

  1. 순화 된 GFP-E90DOPA (2.2 mg/mL 또는 80 µ M) (w/v) SDS, 50 mM Tris HCl (pH 8.0), 0.1%를 포함 하는 버퍼에 및 1 시간에 60 ° C에서 25 mM DTT의 100 µ L를 품 어.
  2. Iodoacetamide H2O (IAA, 4.0 M)의 1 µ L 추가 (500 equiv. GFP E90DOPA에) 동일한 버퍼에 순화 된 GFP E90DOPA 솔루션 (80 µ M). 빛 으로부터 보호 30 분 동안 25 ° C에 혼합물을 품 어.
  3. 트립 신 (1: 100 효소-기질 단백질 비율 [w/w])을 추가 하 여 GFP E90DOPA 샘플을 소화 하 고 4 h 37 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.
  4. C18 스핀 열 표준 염 메서드를 사용 하 여 소화 펩 티 드 샘플을 정화.
  5. 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 질량 분석 (MALDI TOF MS) 매트릭스23으로 알파-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA)를 사용 하 여에 대 한 보고 된 프로토콜에 의해 소화 펩 티 드를 분석 합니다.

결과

TPL에서 DOPA biosynthesized의 직접 통합 식 시스템은 그림 1에 표시 됩니다. 진화 aa-tRNA와 aaRS 쌍에 대 한 유전자를 플라스 미드에 배치 됩니다 위치 90에서 호박 codon를 포함 하는 GFP 유전자 (GFP-E90TAG) GFP 형광에 의해 DOPA의 평가에 다른 플라스 미드에 위치 하 고. TPL 유전자는 GFP 유전자를 포함 하는 동일한 식 플라스 미드에 배치 하 고 constitutively DOPA 생 합?...

토론

이 프로토콜에서 생 합성 및 직접 설립 DOPA의 설명 되어 있습니다. 이 방법에 사용 되는 세균성 셀 추가 아미노산을 합성 하 고 단백질 합성에 대 한 부자연 스러운 빌딩 블록으로 사용할 수 있습니다. 부자연 스러운 아미노산의 유전자 결합 확장된 유전자 코드와 부자연 스러운 생물의 개발을 위한 핵심 기술 되었습니다. 그러나,이 메서드는 기술적으로 완료 되었습니다 하 고 관 효율을 향상 시키...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 연구는 글로벌 프 런 티어 연구 프로그램 (NRF-2015M3A6A8065833)에 의해 지원 되었다 그리고 기본 과학 연구 프로그램 (2018R1A6A1A03024940)를 통해 국립 연구 재단의 한국 (NRF) 한국 정부에 의해 자금.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAGoptionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS21. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10βInvitrogenC6400-03Expression Host
Plasmid Mini-prep kitNucleogen5112200/pack
AgaroseIntron biotechnology32034500 g
Ethidium bromideAlfa AesarL074821 g
LB BrothBD Difco244620500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser BIO-RAD165-2100
Micro pulser cuvetteBIO-RAD165-20890.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin SodiumWako018-1037225 g
ChloramphenicolAlfa AesarB2084125 g
AgarSAMCHUN214230500 g
SOC mediumSigmaS1797100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99%Acros104981000100 g
Pyrocatechol, 99%SAMCHUNP138725 g
Ammonium sulfate, 99%SAMCHUNA0943500 g
pyruvic acid, 98%Alfa AesarA13875100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99%SAMCHUNS08911 kg
Potassium phophate, monobasic, 99%SAMCHUNP11271 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99%SAMCHUNM01461 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99%SAMCHUND0092500 g
Glycerol, 99%SAMCHUNG02691 kg
Trace metal mix a5 with coSigma9294925 mL
L-Proline, 99%SAMCHUNP125725 g
L-Phenylalanine, 98.5%SAMCHUNP198225 g
L-TryptophaneJUNSEI49550-031025 g
L-Arginine, 98%SAMCHUNA114925 g
L-Glutamine, 98%JUNSEI27340-031025 g
L-Asparagine monohydrate, 99%SAMCHUNA119825 g
L-MethionineJUNSEI73190-041025 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99%SAMCHUNH060425 g
L-Threonine, 99%SAMCHUNT293825 g
L-LeucineJUNSEI87070-031025 g
Glycine, 99%SAMCHUNG028625 g
L-Glutamic acid, 99%SAMCHUNG023325 g
L-Alanine, 99%SAMCHUNA154325 g
L-Isoleucine, 99%SAMCHUNI104925 g
L-Valine, 99%SAMCHUNV008825 g
L-SerineSAMCHUNS244725 g
L-Aspartic acidSAMCHUNA120525 g
L-Lysine monohydrochloride, 99%SAMCHUNL059225 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99%SAMCHUNI05781kg
Sodium phosphate monobasic, 98%SAMCHUNS09191 kg
Sodium Chloride, 99%SAMCHUNS29071 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 millilitersSONIC & MATERIALSVCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resinQIAGEN3021025 mL
Polypropylene columnQIAGEN3492450/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA 
Sodium periodate, 99.8&Acros4196100505 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) 
Cy5.5-ADIBO FutureChemFC-61191mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal FiltersMILLIPOREUFC50039696/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 %Sigma1070898400110 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4XThermofisherNP000710 mL
MES running bufferThermofisherNP0002500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gelsThermofisherNO032112 well
Coomassie Brilliant Blue R-250Wako031-1792225 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging SystemSyngeneG BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%SAMCHUNT1351500 g
Hydrochloric acid, 35~37%SAMCHUNH0256500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85%SAMCHUND1070250 g
IodoacetamideSigmaI61255 g
Trypsin Protease, MS GradeThermofisher900575 x 20 µg/pack
C-18 spin columnsThermofisher8987025/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5%SAMCHUNA0125500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acidSigmaC202010 g
Trifluoroacetic acid, 99%SAMCHUNT1666100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targetsBruker8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometerBruker

참고문헌

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