JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для генетических включение L-Диоксифенилаланин biosynthesized от простых исходных материалов и его применение к белка спряжение.

Аннотация

L-Диоксифенилаланин (ДОПЫ) это аминокислота, в биосинтезе катехоламинов в животных и растений. Из-за его особую биохимические свойства аминокислота имеет несколько использует в биохимических приложений. Этот доклад описывает протокол для генетических включение biosynthesized ДОПЫ и его применение к белка спряжение. ДОПЫ biosynthesized, тирозин фенол лиазы (TPL) от катехол, пируват и аммиака, аминокислота является непосредственно включена и белков методом генетической включения с использованием и развивались аминоацил тРНК аминоацил тРНК синтетазы пара. Это прямое включение системы эффективно включает ДОПЫ с маленькой включение других природных аминокислот и лучше белок доходность, чем предыдущие системы генетических включения для ДОПЫ. Белка конъюгации с ДОПЫ содержащих белков является эффективным и конкретным участкам и показывает свою полезность для различных приложений. Этот протокол обеспечивает белка ученых с подробные процедуры для осуществления эффективного биосинтеза мутантных белков, содержащих ДОПЫ на желаемых сайты и их сопряжения для промышленности и фармацевтической.

Введение

ДОПЫ это аминокислота участвует в биосинтезе катехоламинов в животных и растений. Эта аминокислота от Tyr синтезируется гидроксилазы тирозин и молекулярного кислорода (O2)1. Потому что ДОПЫ прекурсор допамина и может проникать blood - brain барьер, он был использован в лечении болезни Паркинсона-2. ДОПЫ встречается также в мидий адгезии белков (карты), которые отвечают за адгезионные свойства мидии в влажных условиях3,4,5,6,7. Tyr сначала кодируется в позициях, где ДОПЫ находится в карты и затем преобразуется в ДОПЫ tyrosinases8,9. Из-за его интересные биохимические свойства ДОПЫ был использован в различных приложениях. Dihydroxyl группы ДОПЫ химически подвержен окислению, и аминокислоты легко превращается в L-допаквинон, предшественник Меланины. Благодаря своей высокой electrophilicity L-допаквинон и его производные, были использованы для сшивки и конъюгации с тиолами и амины10,11,12,13. 1,2-хиноны также может функционировать как диеновых для реакции циклоприсоединения и были использованы для bioconjugation штамм способствует окислению контролируется cyclooctyne-1,2-хиноны (SPOCQ) циклоприсоединения14. Кроме того группа dihydroxyl может хелатной ионов металлов Fe3 + и Cu2 +, и белки, содержащие ДОПЫ были использованы для доставки лекарств и Ион металла, зондирования15,16.

ДОПЫ генетически включены в белки с использованием ортогональных аминоацил тРНК (aa тРНК) и аминоацил тРНК синтетазы (Орсе) пары17 и используется для белка спряжение и сшивки10,11, 12,13. В настоящем докладе описаны результаты экспериментов и протоколы для генетических включение ДОПЫ biosynthesized от дешевых исходных материалов и ее применения для bioconjugation. ДОПЫ-biosynthesized с помощью ТПЛ и начиная от катехол, пируват и аммиака в Escherichia coli. Biosynthesized ДОПЫ непосредственно включены в белки, выразив развивались пару aa тРНК и Орсе для ДОПЫ. Кроме того белок biosynthesized, содержащие ДОПЫ site-specifically конъюгированных с флуоресцентного зонда и высокоструктурированные производить белок олигомеров. Этот протокол будет полезным для белка ученых, biosynthesize мутантных белков, содержащих ДОПЫ и конъюгат белки с биохимическими зондов или препаратов для фармацевтической и промышленных приложений.

протокол

1. плазмида строительство

  1. Построить выражение плазмида (pBAD двойной ТПЛ-GFP-WT), который выражает ТПЛ ген от Citrobacter freundii под контролем промотора учредительных и Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) гена с его6-тег под контролем araBAD промоутер. Для pBAD двойной ТПЛ-GFP-E90TAG замените ДОПЫ с Янтарный кодон (TAG), используя протокол сайт Направленный мутагенез кодоном для сайта (E90). Детали для строительства этой плазмида была описана в наш предыдущий доклад18.
  2. Постройте tRNA/Орсе выражая плазмида (pEVOL-DHPRS2)18,19 для генетических включения ДОПЫ. pEVOL — это вектор специальной плазмиды, выражая две копии Орсе генов с независимыми промоутеров, и подробную информацию о плазмида описан в предыдущем докладе19.
  3. Использование коммерчески доступных плазмида подготовки комплектов для получения высокой чистоты плазмида ДНК. Проверьте чистоту prepped ННО с помощью геля агарозы, при необходимости.

2. Культура подготовка

  1. Электропорация
    1. Использование электро компетентных E. coli DH10β штамма для этого эксперимента. 1 мкл каждого плазмидной ДНК (pEVOL-DHPRS2 и pBAD двойной ТПЛ-GFP-E90TAG), до 20 мкл компетентных клеток. Смешайте их осторожно, чтобы сделать однородной смеси, с помощью пипетки.
    2. Передача смеси электропорации кюветы. Поместите кювету в зале электропорации. Нажмите кювета в камеру чтобы фирмы кювет палата контакт.
    3. Шок, кювет, используя 25 МКФ и 2,5 кв для кюветок 0.1-см.
    4. Добавьте 1 mL подогретую супер оптимального бульона (SOC), содержащие Триптон 2% (w/v), 0,5% (w/v) дрожжевой экстракт, 10 мм NaCl, 2,5 мм KCl, 10 мм MgCl2и 20 мм глюкозы, кювет и передать трубку культуры клетки. Спасти клетки путем инкубации их за 1 ч при 37 ° C при встряхивании.
    5. Распространение 10-100 мкл спасли клеток на табличке агар lysogeny бульон (LB), содержащие хлорамфеникол 35 мкг/мл и 100 мкг/мл ампициллин. Инкубируйте клетки при 37 ° C для 16 h.
  2. Стартовые культуры подготовка
    1. Прививать колонии одного превращается в 5 мл LB среды, содержащие антибиотики. Инкубируйте в колонию на 12 ч при 37 ° C при встряхивании.

3. выражение и очистки GFP-E90DOPA биосинтетических системой

  1. Выражение гена GFP-E90DOPA биосинтетических системой
    1. Перевести 100 мл ПА-5052 средний20 (50 мм Na2HPO4, 50 мм х2PO4, 25 мм [NH4]2,4, 2 мм MgSO4, 0.1% [w/v] проследить металлов, 0,5% [w/v] глицерина, закваски (2 мл) 0,05% [w/v] глюкозы и аминокислоты 5% [w/v] [рН 7,25]) содержит 35 мкг/мл хлорамфеникол, 100 мкг/мл ампициллин, пируват 100 мм, 10 мм катехол, аммиак 25 мм и 300 мкм Дитиотреитол (DTT) следуют инкубации при 30 ° C с встряхивания.
    2. Добавить 2 мл 0,2% (w/v) L-арабинозы когда оптической плотности (OD) на 550 Нм достигает 0,8. Инкубируйте образца для 12 ч при 30 ° C с встряхивания.
    3. Спин вниз клетки на 11000 x g 5 минут, удалить супернатант и заморозить клетки Пелле-80 ° c.
  2. Лизис клеток
    1. Оттепель Пелле клеток на льду и Ресуспензируйте клетки в 10 мл буфера lysis, содержащий 50 мм NaH2PO4 (рН 8,0), имидазола 10 мм и 300 мм NaCl.
    2. Sonicate ресуспензированы клеток на льду на 10 мин амплитуда sonication 80% использования с пульсом 25 s на и 35 s выкл.
    3. Спин вниз ячейки lysate на 18,000 x g при 4 ° C на 15 мин супернатант передать свежие трубка для очищения и отбросить гранулы.
  3. Хромотография сродства Ni-НТА
    1. Добавить Ni-НТА (Нитрилотриуксусная кислота) смолы (300 мкл смолы подвески для культуры 100 мл) в надосадке и связать Ni-НТА смолы при температуре 4 ° C белки, осторожно встряхивая подвеска за 1 ч.
    2. Передача подвеска полипропиленовых столбцов и мыть смола 3 x с 5 мл мыть буфер, содержащий 50 мм NaH2PO4 (рН 8,0), имидазола 20 мм и 300 мм NaCl.
    3. Элюировать белки 3 x с 300 мкл Элюирующий буфер, содержащий 50 мм NaH2PO4 (рН 8,0), имидазола 250 мм и 300 мм NaCl.
    4. Определить концентрацию протеина путем измерения поглощения в 280 Нм. Коэффициент вымирания (24,630 M-1см-1) для GFP-E90DOPA на 280 Нм был рассчитан путем калькулятор Коэффициент вымирания белков (например, https://web.expasy.org/protparam/) и самостоятельно измеренных вымирания coefficiennt (2630 М-1см-1) для ДОПЫ. Как альтернативного метода используйте assay протеина Брэдфорд21 для определения концентрации белка.

4. олигомеризации очищенный GFP-E90DOPA

  1. Добавить 1 мкл натрия Периодат H2O (6 мм) (1.0 экв GFP-E90DOPA) к раствору 20 мкл GFP-E90DOPA (300 мкм) в фосфатного буфера, содержащий 50 мм Na2HPO4 (рН 8.0) и 300 мм NaCl.
  2. Разрешить реакция олигомеризации приступить при 25 ° C в течение 48 часов.
  3. Анализировать реакционную смесь электрофорезом геля натрия Додециловый сульфат Полиакриламид) (SDS-PAGE), как описано в шаге 6.

5. спряжение GFP-E90DOPA с алкины зонда по SPOCQ

  1. 1 мкл Cy5.5 связаны azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO)22 H2O (4,0 мм) (10 экв GFP-E90DOPA) к раствору 20 мкл GFP-E90DOPA (20 мкм) в фосфатного буфера, содержащий 50 мм Na2HPO4 (рН 8.0) и 300 мм NaCl.
  2. Добавить 1 мкл натрия Периодат в H2O (400 мкм) (1.0 экв GFP-E90DOPA) в реакционной смеси.
  3. Разрешить SPOCQ реакции приступить при 25 ° C в течение 1 ч. Если используется зонд светочувствительные, покрывают реакционный сосуд с алюминиевой фольгой.

6. Очистка помечены GFP

  1. Разбавить SPOCQ реакционную смесь, добавив фосфатного буфера, содержащий 50 мм Na2HPO4 (рН 8.0) и 300 мм NaCl, до 500 мкл.
  2. Разбавленный раствор передать столбец спин центробежного фильтра. Центрифуга столбце спина в 14.000 x g при 4 ° C на 15 мин и отбросить потока через. Повторите этот шаг 3 x, чтобы удалить любые излишки Cy5.5-ADIBO.
  3. Передать очищенный образца из столбца спин пробки microcentrifuge 1,5 мл.
  4. Кроме того осуществляют очищения методом диализа против тот же буфер.
  5. Хранить очищенную ГФП при 4 ° C.

7. флуоресценции гель сканирование и анализ SDS-страницы

  1. Подготовить образцы протеина SDS-PAGE анализа, добавив 5 мкл пример буфера белков (см. Таблицу материалы) и 2 мкл DTT (1,00 М) до 13 мкл очищенный, или сырой, помечены GFP (13,6 мкм или 0,38 мг/мл). Для анализа олигомерных GFP используйте более высокую концентрацию GFP (67,8 мкм или 1,9 мг/мл). Денатурируйте белки путем инкубации их на 95 ° C в течение 10 мин.
  2. Место кассеты гель бис-трис SDS-PAGE 4% - 12% (приобретенные, готовые гель кассеты) для электрофореза ячейки и добавить идущий буфер (см. Таблицу материалы). Загрузите образцы протеина и маркер молекулярного веса. Запустите электрофорез на 35-40 мин на 200 V.
    Примечание: Избегайте любой экспозиции образцы протеина для освещения путем проведения всех процессов в темноте, чтобы свести к минимуму обесцвечивания фото флуоресцентного зонда.
  3. Используйте сканер флуоресценции для флуоресценции воображения. Оберните гель белка от электрофореза и поместите его на сканер флуоресценции. Сканируйте гель с помощью параметра соответствующие волны. Для Cy5.5 Выберите режим Cy5, в программное обеспечение сканера.
  4. Пятно гель с коммерческой белка, окрашивание реактива.

8. MALDI-TOF масс-Спектральный анализ в пищеварении трипсина

  1. Инкубируйте 100 мкл очищенный GFP-E90DOPA (2,2 мг/мл или 80 мкм) в буфер, содержащий 50 мм трис-HCl (рН 8,0), 0,1% (w/v) SDS, и 25 мм DTT в 60 ° C в течение 1 ч.
  2. 1 мкл Iodoacetamide в H2O (IAA, 4.0 M) (500 экв GFP-E90DOPA) в очищенной GFP-E90DOPA решение (80 мкм) в тот же буфер. Инкубируйте смесь при 25 ° C за 30 мин с защитой от света.
  3. Дайджест GFP-E90DOPA пример, добавив трипсина (1: 100 протеаз субстрат белка отношение [w/w]) и инкубировать реакционной смеси при 37 ° C в течение 4 ч.
  4. Очищайте переваривается пептид образца с помощью стандартного метода опреснительной с C18 спин столбцами.
  5. Анализировать переваривается пептиды сообщил протоколом для матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации время полета масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS) с использованием альфа циано-4-Гидроксикоричная кислота (CHCA) как матрицы23.

Результаты

Выражение системы для прямого включения ДОПЫ biosynthesized от ТПЛ показан на рисунке 1. Гены для пары развивались aa тРНК и Орсе находятся в плазмиды, и гена GFP (GFP-E90TAG), содержащий янтаря кодон в позиции 90 расположен в другом плазмида оценить включение ДОПЫ GFP фл?...

Обсуждение

В этом протоколе биосинтез и прямое включение ДОПЫ описаны. Бактериальные клетки, используемые в этом методе можно синтезировать дополнительные аминокислоты и использовать его как неестественный строительный блок для синтеза белка. Генетическая включение неестественные аминокисло?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было поддержано глобальной программы исследований границы (СР 2015M3A6A8065833), и основные программы исследований науки (2018R1A6A1A03024940) через Национальный фонд исследований Кореи (NRF) финансируется правительством Кореи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAGoptionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS21. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10βInvitrogenC6400-03Expression Host
Plasmid Mini-prep kitNucleogen5112200/pack
AgaroseIntron biotechnology32034500 g
Ethidium bromideAlfa AesarL074821 g
LB BrothBD Difco244620500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser BIO-RAD165-2100
Micro pulser cuvetteBIO-RAD165-20890.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin SodiumWako018-1037225 g
ChloramphenicolAlfa AesarB2084125 g
AgarSAMCHUN214230500 g
SOC mediumSigmaS1797100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99%Acros104981000100 g
Pyrocatechol, 99%SAMCHUNP138725 g
Ammonium sulfate, 99%SAMCHUNA0943500 g
pyruvic acid, 98%Alfa AesarA13875100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99%SAMCHUNS08911 kg
Potassium phophate, monobasic, 99%SAMCHUNP11271 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99%SAMCHUNM01461 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99%SAMCHUND0092500 g
Glycerol, 99%SAMCHUNG02691 kg
Trace metal mix a5 with coSigma9294925 mL
L-Proline, 99%SAMCHUNP125725 g
L-Phenylalanine, 98.5%SAMCHUNP198225 g
L-TryptophaneJUNSEI49550-031025 g
L-Arginine, 98%SAMCHUNA114925 g
L-Glutamine, 98%JUNSEI27340-031025 g
L-Asparagine monohydrate, 99%SAMCHUNA119825 g
L-MethionineJUNSEI73190-041025 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99%SAMCHUNH060425 g
L-Threonine, 99%SAMCHUNT293825 g
L-LeucineJUNSEI87070-031025 g
Glycine, 99%SAMCHUNG028625 g
L-Glutamic acid, 99%SAMCHUNG023325 g
L-Alanine, 99%SAMCHUNA154325 g
L-Isoleucine, 99%SAMCHUNI104925 g
L-Valine, 99%SAMCHUNV008825 g
L-SerineSAMCHUNS244725 g
L-Aspartic acidSAMCHUNA120525 g
L-Lysine monohydrochloride, 99%SAMCHUNL059225 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99%SAMCHUNI05781kg
Sodium phosphate monobasic, 98%SAMCHUNS09191 kg
Sodium Chloride, 99%SAMCHUNS29071 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 millilitersSONIC & MATERIALSVCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resinQIAGEN3021025 mL
Polypropylene columnQIAGEN3492450/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA 
Sodium periodate, 99.8&Acros4196100505 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) 
Cy5.5-ADIBO FutureChemFC-61191mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal FiltersMILLIPOREUFC50039696/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 %Sigma1070898400110 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4XThermofisherNP000710 mL
MES running bufferThermofisherNP0002500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gelsThermofisherNO032112 well
Coomassie Brilliant Blue R-250Wako031-1792225 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging SystemSyngeneG BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%SAMCHUNT1351500 g
Hydrochloric acid, 35~37%SAMCHUNH0256500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85%SAMCHUND1070250 g
IodoacetamideSigmaI61255 g
Trypsin Protease, MS GradeThermofisher900575 x 20 µg/pack
C-18 spin columnsThermofisher8987025/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5%SAMCHUNA0125500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acidSigmaC202010 g
Trifluoroacetic acid, 99%SAMCHUNT1666100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targetsBruker8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometerBruker

Ссылки

  1. Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis. Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).
  2. Pinder, R. M. Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism. Nature. 228 (5269), 358 (1970).
  3. Waite, J. H., Tanzer, M. L. Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline. Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).
  4. Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. Single-molecule mechanics of mussel adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).
  5. Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis. Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).
  6. Waite, J. H., Qin, X. Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis. Biochemistry. 40 (9), 2887-2893 (2001).
  7. Nicklisch, S. C., Waite, J. H. Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion. Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).
  8. Silverman, H. G., Roberto, F. Understanding marine mussel adhesion. Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).
  9. Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. Mussel-inspired adhesives and coatings. Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).
  10. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine. ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).
  11. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker. Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).
  12. Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex. Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).
  13. Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes. Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).
  14. Borrmann, E., et al. Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).
  15. Ayyadurai, N., et al. Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein. Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).
  16. Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery. Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).
  17. Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).
  18. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
  21. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  23. Gobom, J., et al. Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics. Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).
  24. Mukai, T., et al. Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon. Scientific Reports. 5, 9699 (2015).
  25. Lajoie, M. J., et al. Genomically recoded organisms expand biological functions. Science. 342 (6156), 357-360 (2013).
  26. Bryson, D. I., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases. Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).
  27. Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).
  28. Lee, S., et al. A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones. Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).
  29. Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).
  30. Lang, K., Chin, J. W. Bioorthogonal reactions for labeling proteins. ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).
  31. Lang, K., Chin, J. W. Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  32. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  33. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

138cyclooctyne 12 SPOCQ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены