Constitution génétique biosynthétisée L-dihydroxyphénylalanine (DOPA) et son Application à la conjugaison de protéine

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour la constitution génétique de L-dihydroxyphénylalanine biosynthétisée à partir de matières premières simples et son application à la conjugaison de la protéine.

Résumé

L-dihydroxyphénylalanine (DOPA) est un acide aminé présent dans la biosynthèse des catécholamines dans les animaux et les plantes. En raison de ses propriétés biochimiques particulières, l’acide aminé a des utilisations multiples applications biochimiques. Ce rapport décrit un protocole pour la constitution génétique de biosynthétisée DOPA et son application à la conjugaison de la protéine. DOPA est biosynthétisée par une tyrosine phénol-lyase (TPL) de catéchol, le pyruvate et l’ammoniac et l’acide aminé est incorporé directement dans des protéines par la méthode de constitution génétique utilisant un aminoacyl-tRNA évoluée et paire d’aminoacyl-tRNA synthétase. Ce système d’incorporation directe intègre efficacement DOPA avec peu d’incorporation d’autres acides aminés naturels et avec le meilleur rendement de protéine que le précédent système de constitution génétique pour DOPA. Conjugaison de protéine avec des protéines contenant de DOPA est efficace et spécifique au site et montre son utilité pour des applications diverses. Ce protocole prévoit scientifiques de protéine avec des procédures détaillées pour la biosynthèse efficace de protéines mutantes contenant DOPA aux sites désirés et leur conjugaison pour applications industrielles et pharmaceutiques.

Introduction

DOPA est un acide aminé impliqué dans la biosynthèse des catécholamines dans les animaux et les plantes. Cet acide aminé est synthétisé à partir de Tyr par la tyrosine hydroxylase et la molécule de dioxygène (O₂)¹. Parce que la DOPA est un précurseur de la dopamine et peut pénétrer la barrière hémato - encéphalique, il a été utilisé dans le traitement de la maladie de Parkinson,². DOPA se trouve également dans les protéines d’adhérence moule (cartes), qui sont responsables des propriétés adhésives des moules dans des conditions humides^3,4,5,6,7. Tyr est initialement codé dans les positions où la DOPA se trouve dans les cartes et est ensuite converti en DOPA par tyrosinases^8,9. En raison de ses propriétés biochimiques intéressantes, DOPA a été utilisé dans une variété d’applications. Le groupe dicarbométhoxyl de DOPA est chimiquement sujets à l’oxydation, et l’acide aminé est facilement transformé en L-dopaquinone, un précurseur des mélanines. En raison de son caractère électrophile haut, L-dopaquinone et ses dérivés ont été utilisés pour la réticulation et conjugaison avec les thiols et amines^10,11,12,13. 1, 2-quinones peuvent également fonctionner comme un diène pour les réactions de cycloaddition et ont été utilisés pour bioconjugaison par contrainte-favorisé oxydation contrôlée cyclooctyne-1,2-quinone (SPOCQ) cycloaddition¹⁴. En outre, le groupe dicarbométhoxyl peut chélater les ions métalliques tels que Fe^{3 +} et Cu^{2 +}, et les protéines contenant DOPA ont été utilisés pour l’administration des médicaments et des ions métalliques détection^15,16.

DOPA a été génétiquement incorporé dans les protéines en utilisant un orthogonal aminoacyl-ARNt (aa-ARNt) et aminoacyl-ARNt synthétase (RAA) paire¹⁷ et utilisé pour la protéine conjugaison et réticulation^{10,11, 12,},¹³. Dans le présent rapport, les résultats expérimentaux et des protocoles pour la constitution génétique de DOPA biosynthétisée à partir de matières premières bon marchés et de ses applications à bioconjugaison sont décrits. DOPA est biosynthétisée à l’aide d’un TPL et à partir de catéchol, le pyruvate et l’ammoniac chez Escherichia coli. La biosynthèse DOPA est directement incorporée dans les protéines en exprimant une paire aa-ARNt et aaRS évoluée pour DOPA. En outre, la protéine biosynthétisée contenant la DOPA est relativement conjuguée avec une sonde fluorescente et réticulé pour produire des oligomères de protéine. Ce protocole sera utile pour les scientifiques de protéine, à biosynthétiser les protéines mutantes contenant DOPA et conjuguer les protéines avec sondes biochimiques ou de médicaments destinés à des applications industrielles et pharmaceutiques.

Protocole

1. Construction de plasmide

1. Construire un plasmide d’expression (pBAD-double-TPL-GFP-WT) qui exprime le gène TPL de Citrobacter freundii , sous le contrôle d’un promoteur constitutif et le gène de la protéine fluorescente verte (GFP) avec un son₆-tag sous le contrôle de la araBAD promoteur. Pour pBAD-double-TPL-GFP-E90TAG, remplacer le codon pour le site (E90) de DOPA avec un codon ambre (TAG), à l’aide d’un protocole de mutagénèse dirigée. Les détails pour la construction de ce plasmide a été décrit dans notre précédent rapport¹⁸.
2. Construire un ARNt/RAA-exprimant plasmide (pEVOL-DHPRS2)^18,19 de la constitution génétique de DOPA. pEVOL est un vecteur plasmidique spécial exprimant deux copies des gènes de l’aaRS avec promoteurs indépendants, et les informations détaillées du plasmide sont décrite dans un précédent rapport¹⁹.
3. Trousses de préparation de plasmide disponibles dans le commerce permet d’obtenir haute pureté plasmide DNAs. Vérifier la pureté de l’ADN préparés à l’aide de gel d’agarose, si nécessaire.

2. préparation de la culture

1. Électroporation
   1. Utilisation de l’electro-compétente DH10β souche d’e. coli pour cette expérience. Ajouter 1 µL de chaque plasmide d’ADN (pEVOL-DHPRS2 et pBAD-double-TPL-GFP-E90TAG) à 20 µL de cellules compétentes. Mélanger doucement pour faire un mélange homogène, à l’aide d’une pipette.
   2. Transvaser le mélange dans les cuvettes d’électroporation. Placez la cuve dans le compartiment d’électroporation. Pousser la cuvette dans la chambre faire cuvette-chambre ferme contacter.
   3. Choquer la cuvette, à l’aide de 25 µF et 2,5 kV pour cuvettes de 0,1 cm.
   4. Ajouter 1 mL de bouillon super optimale préchauffée (SOC), contenant 2 % (p/v) tryptone, 0,5 % (p/v), extrait de levure, 10 mM NaCl, KCl 2,5 mM, 10 mM MgCl₂et 20 mM de glucose, de la cuvette et transférer les cellules dans un tube de culture. Sauver les cellules en les incubant pendant 1 h à 37 ° C sous agitation.
   5. Diffuser 10-100 µL de cellules sauvées sur une gélose de bouillon (LB) de lysogénie contenant 35 µg/mL chloramphénicol et 100 ampicilline µg/mL. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 16 h.
2. Préparation de la culture de démarreur
   1. Ensemencer une seule colonie transformée dans 5 mL de milieu LB contenant des antibiotiques. Incuber la colonie pendant 12 h à 37 ° C sous agitation.

3. expression et Purification de GFP-E90DOPA par un système de biosynthèse

1. Expression de GFP-E90DOPA par un système de biosynthèse
   1. Transférer la culture starter (2 mL) pour 100 mL de PA-5052 moyenne²⁰ (50 mM Na₂HPO₄, 50 mM KH₂PO₄, 25 mM [NH₄]₂pour métaux, 0,5 % [p/v] glycérol, traces de₄, 2 mM MgSO₄, 0,1 % [p/v] 0.05 % [p/v] glucose et des acides aminés 5 % [p/v] [pH 7.25]) contenant 35 µg/mL chloramphénicol, ampicilline de µg/mL 100, pyruvate de 100 mM, catéchol 10 mM, ammoniaque 25 mM et 300 µM le dithiothréitol (DTT) suivie d’une incubation à 30 ° C sous agitation.
   2. Ajouter 2 mL de 0,2 % (p/v) L-arabinose quand la densité optique (do) à 550 nm atteint 0,8. Incuber l’échantillon pendant 12 h à 30 ° C sous agitation.
   3. Tournez en bas les cellules à 11 000 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et geler le culot cellulaire à-80 ° C.
2. Lyse cellulaire
   1. Décongeler le culot cellulaire sur la glace et remettre en suspension les cellules dans 10 mL de tampon de lyse contenant 50 mM NaH₂PO₄ (pH 8,0), imidazole de 10 mM et 300 mM NaCl.
   2. Laisser agir les cellules resuspendues sur glace pendant environ 10 minutes utilisation 80 % sonication amplitude avec une impulsion de 25 s sur et 35 s éteint.
   3. Tournez en bas le lysat à 18 000 x g à 4 ° C pendant 15 min. Transférez le surnageant dans un tube frais pour la purification cellulaire et jeter le culot.
3. Chromatographie d’affinité ni-NTA
   1. Résine de Ni-NTA (acide nitrilotriacétique) (300 µL de suspension de résine pour une culture de 100 mL) s’ajoute le surnageant et lier les protéines à la résine de Ni-NTA à 4 ° C en le secouant doucement la suspension pendant 1 h.
   2. Transférer la suspension à une colonne en polypropylène et laver la résine 3 x 5 ml de tampon de lavage contenant 50 mM NaH₂PO₄ (pH 8,0), imidazole de 20 mM et 300 mM NaCl.
   3. Éluer les protéines 3 x 300 µl de tampon d’élution contenant 50 mM NaH₂PO₄ (pH 8,0), imidazole de 250 mM et 300 mM NaCl.
   4. Déterminer la concentration de la protéine en mesurant l’absorbance à 280 nm. Le coefficient d’extinction (24 630 M^-1cm^-1) pour GFP-E90DOPA à 280 nm a été évaluée par un calculateur de coefficient protéine extinction (p. ex., https://web.expasy.org/protparam/) et l’extinction mesurée indépendamment coefficiennt (2630 M^-1cm^-1) pour DOPA. Comme méthode alternative, utiliser la Bradford protéine test²¹ pour la détermination de la concentration de protéine.

4. l’oligomérisation de purifiée GFP-E90DOPA

1. Ajouter 1 µL de sodium periodate H₂O (6 mM) (1,0 équivalent à GFP-E90DOPA) à une solution de 20 µL de GFP-E90DOPA (300 µM) dans un tampon phosphate contenant 50 mM Na₂HPO₄ (pH 8,0) et 300 mM NaCl.
2. Permettre la réaction de l’oligomérisation de rouler à 25 ° C pendant 48 h.
3. Analyser le mélange réactionnel par électrophorèse sur gel sodium dodécyl sulfate polyacrylamide) (SDS-PAGE) tel que décrit à l’étape 6.

5. conjugaison de GFP-E90DOPA avec une sonde alcyne par SPOCQ

1. Ajouter 1 µL de l’azadibenzocyclooctyne lié à Cy5.5 (Cy5.5-ONEMBOTEH)²² H₂O (4,0 mM) (10 équivalent à GFP-E90DOPA) à une solution de 20 µL de GFP-E90DOPA (20 µM) dans un tampon phosphate contenant 50 mM Na₂HPO₄ (pH 8,0) et 300 mM NaCl.
2. Ajouter 1 µL de sodium periodate H₂O (400 µM) (1,0 équivalent à GFP-E90DOPA) au mélange réactionnel.
3. Permettre la réaction SPOCQ de rouler à 25 ° C pendant 1 h. Si on utilise une sonde sensible à la lumière, couvrir la cuve de réaction avec du papier aluminium.

6. la purification de la GFP étiquetée

1. Diluer le mélange réactionnel de SPOCQ en ajoutant un tampon phosphate, contenant 50 mM Na₂HPO₄ (pH 8,0) et 300 mM NaCl, jusqu'à 500 µL.
2. Transférer la solution diluée dans une colonne filtre centrifuge. Centrifuger la colonne à centrifuger à 14 000 x g à 4 ° C pendant 15 min et éliminer les intermédiaires. Répétez cette opération 3 fois afin d’éliminer tout excès de Cy5.5-ONEMBOTEH.
3. Transférer l’échantillon purifié de la colonne dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
4. Vous pouvez également effectuer une purification par la dialyse contre le même tampon.
5. Stocker la GFP purifiée à 4 ° C.

7. SDS-PAGE analyse et Gel de Fluorescence Scanning

1. Préparer des échantillons de protéines pour l’analyse de SDS-PAGE en ajoutant 5 µL de tampon de protéine (voir la Table des matières) et 2 µL de la TNT (1,00 M) à 13 µL de purifiée, ou brut, l’étiquette GFP (13,6 µM ou 0,38 mg/mL). Pour une analyse des oligomère GFP, utiliser une concentration plus élevée de GFP (67,8 µM ou 1,9 mg/mL). Dénaturer les protéines en les incubant à 95 ° C pendant 10 min.
2. Placer une cassette de gel Bis-Tris SDS-PAGE 4-12 % (cassettes achetées, premade gel) à la cellule de l’électrophorèse et ajouter une mémoire tampon en cours d’exécution (voir la Table des matières). Charger les échantillons de protéine et un marqueur de poids moléculaire. Exécutez l’électrophorèse pour 35-40 min à 200 V.
   Remarque : Évitez toute exposition des échantillons de protéines à la lumière en effectuant tous les processus dans l’obscurité, afin de minimiser la photo-blanchiment de la sonde fluorescente.
3. Utiliser un scanner de fluorescence pour l’imagerie de fluorescence. Enveloppez un gel de la protéine de l’électrophorèse et placez-le sur un scanner de fluorescence. Scannez le gel à l’aide d’un paramètre de longueur d’onde appropriée. Pour Cy5.5, sélectionnez le mode de Cy5 fourni dans le logiciel de numérisation.
4. Souillez le gel avec une protéine commerciale réactif de coloration.

8. MALDI-TOF MS analyse par Digestion trypsique

1. Incuber à 100 µL de GFP-E90DOPA (2,2 mg/mL ou 80 µM) dans un tampon contenant 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 % (p/v) SDS purifiée et 25 mM TNT à 60 ° C pendant 1 h.
2. Ajouter 1 µL d’iodoacétamide H₂O (IAA, 4.0 M) (500 équivalent à GFP-E90DOPA) à la solution purifiée de GFP-E90DOPA (80 µM) dans le même tampon. Incuber le mélange à 25 ° C pendant 30 min avec protection contre la lumière.
3. Digérer l’échantillon de GFP-E90DOPA en ajoutant la trypsine (rapport de protéase-à-substrat-protéine au 1/100 [w/o]) et incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 4 h.
4. Purifier l’échantillon digéré peptide en utilisant une méthode standard de dessalement avec C₁₈ colonnes à centrifuger.
5. Analyser les peptides digérées par le protocole signalé pour laser assistée par matrice désorption-ionisation time-of-flight spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS) à l’aide de l’acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique (ACSSD) comme une matrice²³.

Résultats

Le système d’expression pour l’incorporation directe de DOPA biosynthétisée à partir d’un TPL est illustré à la Figure 1. Les gènes codant pour la paire aa-ARNt et aaRS évoluée sont placés dans un plasmide, et le gène de la GFP (GFP-E90TAG) contenant un codon ambre à la position 90 se trouve dans un autre plasmide pour évaluer l’incorporation de DOPA par fluorescence GFP. Le gène TPL est placé dans le même plasmide d’expression conte...

Discussion

Dans ce protocole, la biosynthèse et l’incorporation directe de DOPA sont décrites. La cellule bactérienne utilisée dans cette méthode peut synthétiser un acide aminé supplémentaire et utilisez-le comme un bloc de construction artificiel pour la synthèse des protéines. La constitution génétique des acides aminés non naturels a été une technologie clé pour le développement de l’organisme contre nature avec un code génétique élargi. Toutefois, cette méthode a été techniquement incomplète et est ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG			optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS2			1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10β	Invitrogen	C6400-03	Expression Host
Plasmid Mini-prep kit	Nucleogen	5112	200/pack
Agarose	Intron biotechnology	32034	500 g
Ethidium bromide	Alfa Aesar	L07482	1 g
LB Broth	BD Difco	244620	500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser	BIO-RAD	165-2100
Micro pulser cuvette	BIO-RAD	165-2089	0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium	Wako	018-10372	25 g
Chloramphenicol	Alfa Aesar	B20841	25 g
Agar	SAMCHUN	214230	500 g
SOC medium	Sigma	S1797	100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99%	Acros	104981000	100 g
Pyrocatechol, 99%	SAMCHUN	P1387	25 g
Ammonium sulfate, 99%	SAMCHUN	A0943	500 g
pyruvic acid, 98%	Alfa Aesar	A13875	100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99%	SAMCHUN	S0891	1 kg
Potassium phophate, monobasic, 99%	SAMCHUN	P1127	1 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99%	SAMCHUN	M0146	1 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99%	SAMCHUN	D0092	500 g
Glycerol, 99%	SAMCHUN	G0269	1 kg
Trace metal mix a5 with co	Sigma	92949	25 mL
L-Proline, 99%	SAMCHUN	P1257	25 g
L-Phenylalanine, 98.5%	SAMCHUN	P1982	25 g
L-Tryptophane	JUNSEI	49550-0310	25 g
L-Arginine, 98%	SAMCHUN	A1149	25 g
L-Glutamine, 98%	JUNSEI	27340-0310	25 g
L-Asparagine monohydrate, 99%	SAMCHUN	A1198	25 g
L-Methionine	JUNSEI	73190-0410	25 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99%	SAMCHUN	H0604	25 g
L-Threonine, 99%	SAMCHUN	T2938	25 g
L-Leucine	JUNSEI	87070-0310	25 g
Glycine, 99%	SAMCHUN	G0286	25 g
L-Glutamic acid, 99%	SAMCHUN	G0233	25 g
L-Alanine, 99%	SAMCHUN	A1543	25 g
L-Isoleucine, 99%	SAMCHUN	I1049	25 g
L-Valine, 99%	SAMCHUN	V0088	25 g
L-Serine	SAMCHUN	S2447	25 g
L-Aspartic acid	SAMCHUN	A1205	25 g
L-Lysine monohydrochloride, 99%	SAMCHUN	L0592	25 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99%	SAMCHUN	I0578	1kg
Sodium phosphate monobasic, 98%	SAMCHUN	S0919	1 kg
Sodium Chloride, 99%	SAMCHUN	S2907	1 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters	SONIC & MATERIALS	VCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin	QIAGEN	30210	25 mL
Polypropylene column	QIAGEN	34924	50/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA
Sodium periodate, 99.8&	Acros	419610050	5 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ)
Cy5.5-ADIBO	FutureChem	FC-6119	1mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters	MILLIPORE	UFC500396	96/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 %	Sigma	10708984001	10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X	Thermofisher	NP0007	10 mL
MES running buffer	Thermofisher	NP0002	500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels	Thermofisher	NO0321	12 well
Coomassie Brilliant Blue R-250	Wako	031-17922	25 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System	Syngene		G BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%	SAMCHUN	T1351	500 g
Hydrochloric acid, 35~37%	SAMCHUN	H0256	500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85%	SAMCHUN	D1070	250 g
Iodoacetamide	Sigma	I6125	5 g
Trypsin Protease, MS Grade	Thermofisher	90057	5 x 20 µg/pack
C-18 spin columns	Thermofisher	89870	25/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5%	SAMCHUN	A0125	500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Sigma	C2020	10 g
Trifluoroacetic acid, 99%	SAMCHUN	T1666	100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targets	Bruker	8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer	Bruker