Genetik birleşmesiyle uzarlar L-dihydroxyphenylalanine (basıncın) ve uygulama için Protein konjugasyon

Özet

Burada, L-dihydroxyphenylalanine uzarlar basit başlangıç malzemelerden genetik birleşme ve protein konjugasyon için uygulama için bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

L-dihydroxyphenylalanine (basıncın) katekolaminler hayvanlar ve bitkiler içinde biyosentezi bulunan bir amino asittir. Belirli biyokimyasal özellikleri nedeniyle, amino asit biyokimyasal uygulamalarda birden çok faydası vardır. Bu rapor bir protokol uzarlar basıncın genetik birleşme ve protein konjugasyon için uygulama açıklar. BASINCIN bir Tirozin fenol-liyaz (TPL) katekol, pyruvate ve amonyak tarafından uzarlar olduğunu ve amino asit doğrudan bir Gelişmiş Aminoasil tRNA ve Aminoasil tRNA sentetaz çiftini kullanarak genetik birleşme yöntemi tarafından proteinlerin dahil edilmiştir. Bu doğrudan birleşme sistemi verimli basıncın daha iyi protein verimini basıncın daha önceki genetik birleşme sistemi ile diğer doğal amino asitler ve küçük eklenmesi ile birleştirmek. Protein konjugasyon basıncın içeren proteinler ile verimli ve siteye özel ve kullanışlılığı çeşitli uygulamalar için gösterir. Bu iletişim kuralı protein bilim adamları ile istediğiniz siteleri ve onların konjugasyon Sanayi ve ilaç uygulamaları için basıncın içeren mutasyona uğramış proteinlerin verimli biyosentezi için ayrıntılı yordamlar sağlar.

Giriş

BASINCIN katekolaminler hayvanlar ve bitkiler içinde biyosentezi katılan bir amino asittir. Bu amino asit tirozin hidroksilaz ve moleküler oksijen (O₂)¹tarafından Tyr sentezlenir. BASINCIN dopamin öncüsüdür ve kan - beyin bariyerini nüfuz için Parkinson hastalığı²tedavisinde kullanılmıştır. BASINCIN da midye ıslak koşullar^3,4,5,6,7yapışkanlı özelliklerini sorumludur midye yapışma proteinler (haritalar) bulunur. Tyr başlangıçta nerede basıncın haritalar bulunur ve basıncın tyrosinases^8,9tarafından daha sonra dönüştürülür pozisyonlarda kodlanır. İlginç biyokimyasal özellikleri nedeniyle, basıncın çeşitli uygulamalarda kullanılmaktadır. BASINCIN dihidroksi grup kimyasal oksidasyon yatkın ve amino asit L-dopaquinone, melanins habercisi kolayca dönüştürülür. Onun yüksek electrophilicity nedeniyle, L-dopaquinone ve onun türevleri crosslinking ve fiil ile^10,11,12,13thiols ve aminler için kullanılmaktadır. 1,2-quinones Dien cycloaddition tepkiler gibi de davranabilir ve bioconjugation için zorlanma terfi oksidasyon kontrollü cyclooctyne-1,2-quinone (SPOCQ) cycloaddition¹⁴tarafından kullanılmıştır. Buna ek olarak, dihidroksi grup Fe^{3 +} ve Cu^{2 +}gibi metal iyonlarının şelasyon yapın ve basıncın içeren proteinler ilaç dağıtım ve metal iyon^15,16algılama için kullanılmıştır.

BASINCIN edilmiş genetik olarak protein bir dik Aminoasil tRNA (aa-tRNA) ve Aminoasil tRNA sentetaz (aaRS) çifti¹⁷ kullanarak dahil ve protein konjügasyon ve crosslinking^10,11için^, kullanılan ^12,13. Bu raporda, deneysel sonuçlar ve protokolleri basıncın uzarlar ucuz başlangıç malzemeleri ve uygulamaları bioconjugation için genetik birleşme açıklanmıştır. BASINCIN bir TPL kullanarak ve katekol, pyruvate ve Escherichia coliamonyak başlayarak uzarlar var. BASINCIN uzarlar doğrudan evrimleşmiş bir aa-tRNA ve aaRS çifti için basıncın ifade ederek protein kurulmuştur. Buna ek olarak, basıncın içeren uzarlar protein site-specifically bir floresan sonda ve protein reaksiyonlar üretmek için çapraz ile Birleşik. Bu iletişim kuralı için biosynthesize mutasyona uğramış proteinlerin basıncın içeren protein bilim adamları için yararlı olduğu ve proteinler ile biyokimyasal probları veya ilaç sanayi ve ilaç uygulamaları için eşlenik.

Protokol

1. plazmid İnşaat

1. Sitrobacter freundii üzerinden TPL gen bir bünye organizatörü kontrol altında ve yeşil flüoresan protein (GFP) gen bir His ile ifade bir ifade plazmid (pBAD-çift-TPL-GFP-WT) inşa₆-etiket denetimi altında araBAD organizatörü. PBAD-çift-TPL-GFP-E90TAG için kodon (E90) site için bir site Yönetmen: mutagenesis iletişim kuralı kullanılarak basıncın kehribar bir kodon (TAG), ile değiştirin. Bu plazmid inşası için Ayrıntılar bizim önceki rapor¹⁸' açıklanan.
2. Bir tRNA/aaRS-ifade plazmid (pEVOL-DHPRS2)^18,19 basıncın genetik birleşme oluşturmak. pEVOL aaRS genlerin iki kopya bağımsız organizatör ile ifade bir özel plazmid vektörü olduğu ve plazmid ayrıntılı bilgi bir önceki rapor¹⁹' de açıklanmıştır.
3. Piyasada bulunan plazmid hazırlık setleri yüksek saflıkta plazmid DNA'lar almak için kullanın. Hazırlandı DNA'lar saflığı özel jel elektroforez, kullanarak gerekirse gözden geçirin.

2. kültür hazırlama

1. Elektroporasyon
   1. Bu deney için kullanım elektro-yetkili E. coli DH10β zor. Her plazmid DNA (pEVOL-DHPRS2 ve pBAD-çift-TPL-GFP-E90TAG) 1 µL yetkili hücreleri 20 µL için ekleyin. Mix onları hafifçe bir pipet kullanarak homojen bir karışım yapmak.
   2. Karışım Elektroporasyon cuvettes aktarın. Küvet Elektroporasyon odasına koyun. Firma küvet-odası yapmak için odasına küvet itmek başvurun.
   3. 25 µF kullanarak küvet, şok ve 2,5 kV 0.1 cm cuvettes için.
   4. Prewarmed süper en iyi suyu (SOC), 1 %2 (w/v) tryptone içeren mL ekleyin, %0,5 (w/v) özü, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂ve 20 mM glikoz, küvet için Maya ve hücreleri bir kültür tüp transfer. Hücreleri onları 37 ° C'de sallayarak ile 1 h için kuluçka kurtarma.
   5. 10-100 µL 35 µg/mL kloramfenikol ve 100 µg/mL ampisilin içeren bir tabakta lysogeny suyu (LB) agar kurtarıldı hücrelerinin yayıldı. 16 h için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
2. Starter kültür hazırlama
   1. Antibiyotik içeren LB orta 5 ml dönüştürülmüş bir koloni aşılamak. Colony 37 ° C'de sallayarak ile 12 h için kuluçkaya.

3. ifade ve arıtma GFP-E90DOPA biyosentetik sistemi tarafından

1. GFP-E90DOPA ifade biyosentetik sistem tarafından
   1. Starter kültür (2 mL) 100 mL PA-5052 orta²⁰ (50 mM Na₂HPO₄, 50 mM KH₂PO₄,₄, 2 mM MgSO₄, % 0,1 [w/v] izlemek böylece metaller, %0,5 [w/v] gliserol, 25 mM [NH₄]₂aktarım %0,05 [w/v] glikoz ve %5 [w/v] amino asitler [pH 7.25]) 35 µg/mL kloramfenikol, 100 µg/mL ampisilin, 100 mM pyruvate, 10 mM katekol, 25 mM amonyak ve 300 µM dithiothreitol (DTT) içeren bir kuluçka 30 ° C'de sallayarak ile izledi.
   2. 2 mL %0,2 (w/v) L-arabinoz eklediğinizde 550 nm ulaşır 0.8, optik yoğunluk (OD). Örnek 12 h 30 ° C'de sallayarak ile için kuluçkaya.
   3. Spin aşağı hücreleri 11.000 x g 5 min için de, süpernatant atmak ve hücre Pelet-80 ° C'de dondurmak
2. Hücre lizis
   1. Hücre Pelet buz çözme ve 10 mL lizis arabellek 50 mM NaH₂PO₄ (pH 8.0), içeren hücrelerde resuspend 10 mM imidazole ve 300 mM NaCl.
   2. 10 dk. kullanım % 80 sonication genlik bir darbe ile 25 buzda resuspended hücreleri solüsyon içeren temizleyicide s kapalı açık ve 35 s.
   3. Spin aşağı lysate 18.000 x g 15 dk. arıtma için taze bir tüp süpernatant aktarmak için 4 ° C'de, hücre ve Pelet atın.
3. Ni-NTA benzeşme Kromatografi
   1. Ni-NTA (nitrilotriacetic asit) reçine (reçine süspansiyon bir 100 mL kültür için 300 µL) süpernatant için ekleyebilir ve süspansiyon 1 h için hafifçe sallayarak proteinler 4 ° C'de Ni-NTA reçine bağlayabilirsiniz.
   2. Süspansiyon Polipropilen bir sütuna aktarmak ve reçine 3 yıkama yıkama arabelleği 50 mM NaH₂PO₄ (pH 8.0), içeren 5 mL x 20 mM imidazole ve 300 mM NaCl.
   3. Proteinler 3 elute x 50 mM NaH₂PO₄ (pH 8.0), içeren elüsyon arabelleği 300 µL ile 250 mM imidazole ve 300 mM NaCl.
   4. 280 absorbans ölçerek protein konsantrasyonu belirlemek nm. Yok olma (24,630 M^-1cm^-1) için katsayısı GFP-E90DOPA, 280 nm olarak hesaplanır bir protein yok olma katsayısı hesaplama (Örneğin, https://web.expasy.org/protparam/) ve bağımsız olarak ölçülen yok tarafından coefficiennt (2630 M^-1cm^-1) basıncın için. Alternatif bir yöntem, Bradford protein tahlil²¹ protein konsantrasyonu tayini için kullanın.

4. Oligomerizasyonda arıtılmış GFP-E90DOPA

1. Sodyum 1 µL periodate H₂O (6 mM) eklemek (1.0 eşdeğeri GFP-E90DOPA için) 20 µL GFP-E90DOPA bir çözüm için (300 µM) 50 mM Na₂HPO₄ (pH 8.0) içeren bir fosfat tampon ve 300 mM NaCl.
2. Oligomerizasyonda tepki için 48 h 25 ° C'de devam etmek izin verir.
3. Reaksiyon karışımı Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide jel elektroforez tarafından analiz) (SDS-sayfa) 6. adımda açıklandığı gibi.

5. GFP-E90DOPA SPOCQ tarafından bir alkin sonda ile konjugasyon

1. Cy5.5 bağlı azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO)²² H₂O (4.0 mM) 1 µL ekleyin (10 GFP-E90DOPA eşdeğeri) 20 µL GFP-E90DOPA bir çözüm için (20 µM) 50 mM Na₂HPO₄ (pH 8.0) içeren bir fosfat tampon ve 300 mM NaCl.
2. Sodyum 1 µL H₂O periodate Ekle (400 µM) (1.0 GFP-E90DOPA eşdeğeri) tepki karışıma.
3. 25 ° c 1 h için devam etmek SPOCQ tepki sağlar. Bir ışığa duyarlı prob kullanılıyorsa, alüminyum folyo ile reaksiyon gemi kapsar.

6. etiketli GFP saflaştırılması

1. 50 mM Na₂HPO₄ (pH 8.0) içeren bir fosfat tampon ekleyerek SPOCQ reaksiyon karışımı sulandırmak ve 300 mM NaCl, 500 µL.
2. Seyreltik çözüm bir santrifüj filtre spin sütuna aktarmak. Spin sütun sırasında 14.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi ve akışı aracılığıyla atın. Bu 3 x herhangi bir aşırı Cy5.5 ADIBO kaldırmak için adımları yineleyin.
3. Arıtılmış örnek spin sütundan bir 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
4. Alternatif olarak, aynı tampon karşı diyaliz tarafından bir saflaştırma taşımak.
5. Arıtılmış GFP 4 ° C'de depolayın

7. SDS-sayfa analizi ve floresan jel tarama

1. Protein örnekleri 5 µL protein örnek arabelleği ekleyerek SDS-sayfa analizi için hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) ve DTT (1.00 M) 2 µL arıtılmış veya ham, 13 µL için etiketli GFP (13,6 µM veya 0,38 mg/mL). Oligomeric GFP bir analizi için GFP (67.8 µM veya 1,9 mg/mL) daha yüksek bir konsantrasyon kullanın. Onları 95 ° c 10 min için kuluçka proteinler denatüre.
2. Elektroforez için % 4 - % 12 Bis-Tris SDS-sayfa jel kaset (satın alınan, hazır jel kaset) yerleştirin ve çalışan bir arabellek ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek). Protein örnekleri ve molekül ağırlığı marker yükleyin. 35-40 dk Elektroforez 200 V çalıştırın.
   Not: fotoğraf ağartma-floresan probe en aza indirmek için karanlıkta tüm işlemler gerçekleştirerek gün ışığına protein örneklerinin herhangi bir yay.
3. Bir floresan tarayıcı floresans görüntüleme için kullanın. Protein jel elektroforez üzerinden sarın ve bir floresan tarayıcıya yerleştirin. Jel bir uygun dalga boyu ayarını kullanarak tarayın. Cy5.5 için tarayıcı yazılımını sağlanan Cy5 modunu seçin.
4. Jel reaktif boyama ticari bir protein ile leke.

8. MALDI-TOF MS Analizi tripsin sindirim tarafından

1. Arıtılmış GFP-E90DOPA (2.2 mg/mL veya 80 µM) arabellekte (w/v) SDS %0,1 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), içeren ve 25 mM DTT 60 ° c için 1 h 100 µL kuluçkaya.
2. Iodoacetamide (IAA, 4.0 M) H₂O 1 µL ekleyin (500 eşdeğeri GFP-E90DOPA için) aynı arabellek arıtılmış GFP-E90DOPA çözüm (80 µM) için. Karışımı 30 dk ışık koruma için 25 ° C'de kuluçkaya.
3. Tripsin (1: 100 proteaz-substrat protein oranı [w/w]) ekleyerek GFP-E90DOPA örnek sindirmek ve 37 ° C 4 h için tepki karisimin kuluçkaya.
4. Sindirilir peptid örnek C₁₈ spin sütunlarla desalting için standart bir yol kullanarak arındırmak.
5. Alfa-cyano-4-hydroxycinnamic asit (CHCA) bir matris²³kullanarak matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma uçuş zaman kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS) için bildirilen protokolü tarafından sindirilmiş peptidler analiz.

Sonuçlar

BASINCIN uzarlar bir TPL üzerinden doğrudan birleşme ifade sistem Şekil 1' de gösterilen. Gelişmiş aa-tRNA ve aaRS çifti için gen bir plazmid yerleştirilir ve 90 konumundaki sarı bir kodon içeren GFP gen (GFP-E90TAG) başka bir plazmid basıncın birleşme değerlendirmek için GFP floresans tarafından bulunur. TPL gen GFP gen içeren aynı ifade plazmid içinde yerleştirilir ve yapısal basıncın biyosentezi verimi en üst düzeye çıkarmak i...

Tartışmalar

Bu protokol için biyosentezi ve basıncın doğrudan birleşme açıklanmıştır. Bu yöntemde kullanılan bakteri hücre sentez ek bir amino asit ve protein sentezi için doğal olmayan bir yapı taşı olarak kullanabilirsiniz. Doğal olmayan amino asitler genetik birleşme genişletilmiş bir genetik kod ile doğal olmayan organizma gelişimi için anahtar bir teknoloji olmuştur. Ancak, bu yöntem Teknik olarak eksik oldu ve birleşme verimliliği artırmak ve pertürbasyon endojen çeviri sistemleri için en aza i...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG			optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS2			1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10β	Invitrogen	C6400-03	Expression Host
Plasmid Mini-prep kit	Nucleogen	5112	200/pack
Agarose	Intron biotechnology	32034	500 g
Ethidium bromide	Alfa Aesar	L07482	1 g
LB Broth	BD Difco	244620	500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser	BIO-RAD	165-2100
Micro pulser cuvette	BIO-RAD	165-2089	0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium	Wako	018-10372	25 g
Chloramphenicol	Alfa Aesar	B20841	25 g
Agar	SAMCHUN	214230	500 g
SOC medium	Sigma	S1797	100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99%	Acros	104981000	100 g
Pyrocatechol, 99%	SAMCHUN	P1387	25 g
Ammonium sulfate, 99%	SAMCHUN	A0943	500 g
pyruvic acid, 98%	Alfa Aesar	A13875	100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99%	SAMCHUN	S0891	1 kg
Potassium phophate, monobasic, 99%	SAMCHUN	P1127	1 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99%	SAMCHUN	M0146	1 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99%	SAMCHUN	D0092	500 g
Glycerol, 99%	SAMCHUN	G0269	1 kg
Trace metal mix a5 with co	Sigma	92949	25 mL
L-Proline, 99%	SAMCHUN	P1257	25 g
L-Phenylalanine, 98.5%	SAMCHUN	P1982	25 g
L-Tryptophane	JUNSEI	49550-0310	25 g
L-Arginine, 98%	SAMCHUN	A1149	25 g
L-Glutamine, 98%	JUNSEI	27340-0310	25 g
L-Asparagine monohydrate, 99%	SAMCHUN	A1198	25 g
L-Methionine	JUNSEI	73190-0410	25 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99%	SAMCHUN	H0604	25 g
L-Threonine, 99%	SAMCHUN	T2938	25 g
L-Leucine	JUNSEI	87070-0310	25 g
Glycine, 99%	SAMCHUN	G0286	25 g
L-Glutamic acid, 99%	SAMCHUN	G0233	25 g
L-Alanine, 99%	SAMCHUN	A1543	25 g
L-Isoleucine, 99%	SAMCHUN	I1049	25 g
L-Valine, 99%	SAMCHUN	V0088	25 g
L-Serine	SAMCHUN	S2447	25 g
L-Aspartic acid	SAMCHUN	A1205	25 g
L-Lysine monohydrochloride, 99%	SAMCHUN	L0592	25 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99%	SAMCHUN	I0578	1kg
Sodium phosphate monobasic, 98%	SAMCHUN	S0919	1 kg
Sodium Chloride, 99%	SAMCHUN	S2907	1 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters	SONIC & MATERIALS	VCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin	QIAGEN	30210	25 mL
Polypropylene column	QIAGEN	34924	50/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA
Sodium periodate, 99.8&	Acros	419610050	5 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ)
Cy5.5-ADIBO	FutureChem	FC-6119	1mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters	MILLIPORE	UFC500396	96/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 %	Sigma	10708984001	10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X	Thermofisher	NP0007	10 mL
MES running buffer	Thermofisher	NP0002	500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels	Thermofisher	NO0321	12 well
Coomassie Brilliant Blue R-250	Wako	031-17922	25 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System	Syngene		G BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%	SAMCHUN	T1351	500 g
Hydrochloric acid, 35~37%	SAMCHUN	H0256	500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85%	SAMCHUN	D1070	250 g
Iodoacetamide	Sigma	I6125	5 g
Trypsin Protease, MS Grade	Thermofisher	90057	5 x 20 µg/pack
C-18 spin columns	Thermofisher	89870	25/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5%	SAMCHUN	A0125	500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Sigma	C2020	10 g
Trifluoroacetic acid, 99%	SAMCHUN	T1666	100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targets	Bruker	8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer	Bruker