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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die genetische Aufnahme von L-Dihydroxyphenylalanine Biosynthesized aus einfachen Ausgangsmaterialien und seine Anwendung auf Protein Konjugation.

Zusammenfassung

L-Dihydroxyphenylalanine (DOPA) ist eine Aminosäure, die in die Biosynthese der Katecholamine bei Tieren und Pflanzen gefunden. Wegen seiner besonderen biochemischen Eigenschaften hat die Aminosäure Mehrfachnutzung in biochemische Anwendungen. Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll für die genetische Einbeziehung der Biosynthesized DOPA und seine Anwendung auf Protein Konjugation. DOPA ist Biosynthesized durch ein Tyrosin Phenol-Lyase (TPL) von brenzcatechins, Pyruvat und Ammoniak und die Aminosäure ist direkt durch die genetische Einbau-Methode mit einem weiterentwickelten Aminoacyl-tRNA und Aminoacyl-tRNA synthestase Paar in Proteine aufgenommen. Dieses direkte Einbindung System beinhaltet effizient DOPA mit wenig Einbindung anderer natürlicher Aminosäuren und bessere Proteinausbeute als das Vorgängersystem genetische Aufnahme für DOPA. Protein-Konjugation mit DOPA-haltige Proteine ist effizient und ortsspezifische und zeigt seine Nützlichkeit für die verschiedensten Anwendungen. Dieses Protokoll bietet Protein Wissenschaftler mit detaillierten Verfahren für die effiziente Biosynthese von mutierten Proteine mit DOPA an gewünschten Standorten und deren Konjugation für industrielle und pharmazeutische Anwendungen.

Einleitung

DOPA ist eine Aminosäure, die in die Biosynthese der Katecholamine bei Tieren und Pflanzen beteiligt. Diese Aminosäure wird von Tyr von Tyrosin-Hydroxylase und molekularer Sauerstoff (O2)1synthetisiert. Da DOPA eine Vorstufe von Dopamin ist und die Blut - Hirn-Schranke durchdringen kann, hat es bei der Behandlung von Parkinson-Krankheit2eingesetzt. DOPA findet sich auch in Muschel Adhäsion Proteine (MAPs), die für die Hafteigenschaften der Muscheln in nassen Bedingungen3,4,5,6,7zuständig sind. Tyr wird zunächst an den Positionen kodiert, wo DOPA findet sich in Karten und dann durch tyrosinasen8,9in DOPA umgewandelt wird. Wegen seiner interessanten biochemischen Eigenschaften wurde DOPA in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt. Die Dihydroxyl Gruppe von DOPA ist chemisch anfällig für Oxidation und die Aminosäure ist in L-Dopaquinone, ein Vorläufer der Melanine umfunktioniert. Aufgrund seiner hohen Electrophilicity wurden für Vernetzung und Konjugation mit Thiole und Amine10,11,12,13L-Dopaquinone und seine Derivate eingesetzt. 1,2-Chinonen können auch als ein Diens für Cycloaddition Reaktionen und werden durch Belastung gefördert Oxidation-gesteuerten Cyclooctyne-1,2-Quinone (SPOCQ) deutscher14seit biokonjugaten. Darüber hinaus die Dihydroxyl Gruppe kann Metallionen wie Fe3 + und Cu2 +Chelat und Proteine mit DOPA haben für Drug Delivery und Metallion sensing15,16verwendet worden.

DOPA hat genetisch in Proteine mit einem orthogonalen Aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) und die Aminoacyl-tRNA synthestase (AaRS) Paar17 integriert und verwendet für Protein Konjugation und Vernetzung10,11, 12,13. In diesem Bericht werden experimentelle Ergebnisse und Protokolle für die genetische Einbeziehung von DOPA Biosynthesized von billige Ausgangsmaterialien und ihre Anwendungen auf biokonjugaten beschrieben. DOPA ist Biosynthesized mit einem TPL und ausgehend von brenzcatechins, Pyruvat und Ammoniak in Escherichia coli. Biosynthesized DOPA ist direkt integriert Proteine ein weiterentwickelter aa-tRNA und AaRS Pair für DOPA zum Ausdruck zu bringen. Darüber hinaus ist das Biosynthesized Protein mit DOPA mit einem fluoreszierenden Sonde und vernetzt zu produzieren Protein Oligomere ortspezifisch konjugiert. Dieses Protokoll wird nützlich sein für Protein Wissenschaftler zur Biosynthese mutierte Proteine mit DOPA und konjugieren der Proteine mit biochemischen Sonden oder Drogen für industrielle und pharmazeutische Anwendungen.

Protokoll

(1) Plasmid Bau

  1. Konstruieren ein expressionsplasmid (Madothertrucker-Dual-TPL-GFP-WT), die das TPL-gen aus Citrobacter Freundii unter der Kontrolle der konstitutiven Promoter und das grün fluoreszierende Protein (GFP) Gen mit einem seiner drückt6-Tag unter der Kontrolle der AraBAD Förderer. Ersetzen Sie für Madothertrucker-Dual-TPL-GLP-E90TAG das Codon für den Standort (E90) von DOPA mit einem Bernstein-Codon (TAG), mit einem Site-verwiesene Mutagenese-Protokoll. Die Details für den Bau dieses Plasmid wurde in unserem vorherigen Bericht18beschrieben.
  2. Ein tRNA/AaRS-Ausdruck Plasmid (pEVOL-DHPRS2)18,19 für die genetische Einbeziehung von DOPA zu konstruieren. pEVOL ist ein spezielles Plasmid-Vektor zwei Kopien des AaRS Gene mit unabhängigen Veranstaltern zum Ausdruck zu bringen, und die detaillierte Informationen des Plasmids wird in einem früheren Bericht19beschrieben.
  3. Verwenden Sie im Handel erhältlichen Plasmid Vorbereitung Kits, um hochreine Plasmid DNA zu erhalten. Überprüfen Sie die Reinheit der vorbereitet DNAs mit Agarose-Gelelektrophorese, falls erforderlich.

(2) Kultur Vorbereitung

  1. Elektroporation
    1. Verwendung der Elektro-kompetente E. Coli DH10β Belastung für dieses Experiment. 1 µL jedes Plasmid DNA (pEVOL-DHPRS2 und Madothertrucker-Dual-TPL-GLP-E90TAG) zu 20 µL kompetente Zellen hinzufügen. Mischen Sie sie vorsichtig, um eine homogene Mischung, mit einer Pipette zu machen.
    2. Übertragen Sie die Mischung auf die Elektroporation Küvetten. Legen Sie die Küvette in die Elektroporation Kammer. Schieben Sie die Küvette in die Kammer zu festen Küvette-Kammer zu kontaktieren.
    3. Die Küvette mit 25 µF schockieren und 2,5 kV für 0,1 cm-Küvetten.
    4. Fügen Sie 1 mL vorgewärmte super optimale Brühe (SOC), mit 2 % (w/V) Tryptone, 0,5 % (w/V) Hefe-Extrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2und 20 mM Glukose, die Küvette und die Zellen zu einem Kultur-Schlauch übertragen. Die Zellen zu retten, indem sie Inkubation für 1 h bei 37 ° C mit schütteln.
    5. 10-100 µL der geretteten Zellen auf einer Lysogeny Brühe (LB) Agarplatte mit 35 µg/mL Chloramphenicol und 100 µg/mL Ampicillin zu verbreiten. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C 16 h.
  2. Starter-Kultur-Vorbereitung
    1. Eine einzige transformierte Kolonie in 5 mL LB-Medium mit Antibiotika immun. Inkubieren Sie die Kolonie für 12 h bei 37 ° C mit schütteln.

3. Ausdruck und Aufreinigung von GFP-E90DOPA von einem biosynthetischen System

  1. Ausdruck der GFP-E90DOPA von einem biosynthetischen system
    1. Übertragen Sie die Starterkultur (2 mL) auf 100 mL PA-5052 mittleren20 (50 mM Na2HPO4, 50 mM KH2PO4, 25 mM [NH4]2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1 % [w/V] Spur Metalle, 0,5 % [w/V] Glycerin, 0,05 % [w/V] Glucose und Aminosäuren 5 % [w/V] [pH 7.25]) mit 35 µg/mL Chloramphenicol, 100 µg/mL Ampicillin, 100 mM Pyruvat, brenzcatechins 10 mM, 25 mM Ammoniak und 300 µM Dithiothreitol (DTT) gefolgt von einer Inkubation bei 30 ° C mit schütteln.
    2. Fügen Sie 2 mL 0,2 % (w/V) L-Arabinose wenn die optische Dichte (OD) bei 550 nm erreicht 0,8. Inkubation der Probe für 12 h bei 30 ° C mit schütteln.
    3. Spin-down der Zellen bei 11.000 x g für 5 min, den überstand verwerfen und Einfrieren der Zelle Pellet bei-80 ° C.
  2. Zell-Lyse
    1. Die Zelle Pellet auf Eis Auftauen und Aufschwemmen der Zellen in 10 mL Lyse-Puffer mit 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 10 mM Imidazol und 300 mM NaCl.
    2. Beschallen die resuspendierte Zellen auf Eis für 10 min. Einsatz 80 % Beschallung Amplitude mit einem Puls von 25 s ein und 35 s aus.
    3. Spin-down der Zelle lysate bei 18.000 x g bei 4 ° C für 15 min. Transfer der Überstand zu einem frischen Schlauch für Reinigung und das Pellet zu verwerfen.
  3. NI-NTA Affinitätschromatographie
    1. Der Überstand Ni-NTA (Nitrilotriacetic Säure) Harz (300 µL der Harz-Aussetzung für eine 100-mL-Kultur) hinzu und binden Sie die Proteine, die Ni-NTA-Harz bei 4 ° C durch sanft schütteln Sie die Suspension für 1 h.
    2. Die Aussetzung einer Polypropylen Spalte übertragen und waschen Sie das Harz 3 X mit 5 mL Waschpuffer mit 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 20 mM Imidazol und 300 mM NaCl.
    3. Eluieren Proteine 3 X mit 300 µL der Elution Puffer mit 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 250 mM Imidazol und 300 mM NaCl.
    4. Konzentration des Proteins zu bestimmen, durch Messung der Absorption bei 280 nm. Die vom Aussterben bedroht-Koeffizient (24.630 M-1cm-1) für GLP-E90DOPA bei 280 nm wurde berechnet, indem ein Protein Aussterben Koeffizient Rechner (z.B. https://web.expasy.org/protparam/) und das unabhängig gemessene Aussterben Coefficiennt (2630 M-1cm-1) für DOPA. Als eine alternative Methode verwenden Sie die Bradford Protein Assay21 für eine Bestimmung der Konzentration des Proteins.

4. Oligomerisierung von gereinigten GLP-E90DOPA

  1. Fügen Sie 1 µL Sodium periodate H2O (6 mM) (1.0 Äquiv, GFP-E90DOPA) zu einer Lösung von 20 µL des GFP-E90DOPA (300 µM) in einem Phosphatpuffer mit 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) und 300 mM NaCl.
  2. Die Oligomerisierung Reaktion bei 25 ° C für 48 h Vorgehen zu ermöglichen.
  3. Analysieren Sie das Reaktionsgemisch durch Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) (SDS-PAGE), wie in Schritt 6 beschrieben.

(5) Konjugation von GFP-E90DOPA mit einem Alkinen Sonde durch SPOCQ

  1. Fügen Sie 1 µL der Cy5.5 Verbindung Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO)22 H2O (4,0 mM) (10 Äquiv, GFP-E90DOPA) zu einer Lösung von 20 µL des GFP-E90DOPA (20 µM) in einem Phosphatpuffer mit 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) und 300 mM NaCl.
  2. Fügen Sie 1 µL des Natriums in H2O periodate (400 µM) (1.0 Äquiv, GFP-E90DOPA) zum Reaktionsgemisch.
  3. Lassen Sie die SPOCQ Reaktion bei 25 ° C für 1 Stunde gehen. Wenn eine lichtempfindliche Sonde verwendet wird, decken Sie das Reaktionsgefäß mit Alufolie ab.

6. Reinigung der beschrifteten GLP

  1. Verdünnen Sie das Reaktionsgemisch SPOCQ durch Zugabe von Phosphatpuffer, mit 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) und 300 mM NaCl, bis zu 500 µL.
  2. Übertragen Sie die verdünnte Lösung auf eine zentrifugale Filterspalte Spin. Zentrifugieren Sie die Spin-Spalte bei 14.000 X g bei 4 ° C für 15 min und entsorgen Sie den Durchfluss. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 X um jede überschüssige Cy5.5-ADIBO zu entfernen.
  3. Übertragen Sie die gereinigte Probe aus der Spalte "Spin" auf einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
  4. Alternativ führen Sie eine Reinigung durch Dialyse gegen den gleichen Puffer.
  5. Speichern Sie die gereinigten GFP bei 4 ° C.

(7) SDS-PAGE-Analyse und Fluoreszenz-Gel Scannen

  1. SDS-PAGE-Analyse durch Zugabe von 5 µL Probenpuffer Protein Proteinproben vorbereiten (siehe Tabelle der Materialien) und 2 µL von DVB-t (1,00 M), 13 µL des gereinigten oder derbe, beschriftet GFP (13,6 µM oder 0,38 mg/mL). Eine Analyse der Oligomere GFP verwenden Sie eine höhere Konzentration von GFP (67,8 µM oder 1,9 mg/mL). Denaturieren Sie die Proteine durch sie bei 95 ° C für 10 min Inkubation.
  2. Legen Sie eine 4 % - 12 % Bis-Tris SDS-PAGE Gel Kassette (gekaufte, vorgefertigten Gel Kassetten) auf die Elektrophorese-Zelle und fügen einen laufenden Puffer (siehe Tabelle der Materialien). Laden Sie die Proteinproben und einem Molekulargewicht Marker. Laufen Sie die Elektrophorese für 35-40 min. bei 200 V.
    Hinweis: Vermeiden Sie jegliche Exposition die Proteinproben Licht durch die Durchführung aller Prozesse in der Dunkelheit, um Foto-Bleichen der fluoreszierenden Sonde zu minimieren.
  3. Verwenden Sie einen Fluoreszenz-Scanner für die Fluoreszenz-Bildgebung. Wickeln Sie eine Protein-Gel von Elektrophorese und legen Sie es auf einem Fluoreszenz-Scanner. Scannen Sie das Gel mit einem geeigneten Wellenlänge-Einstellung. Wählen Sie für Cy5.5 den Cy5-Modus in der Scanner-Software zur Verfügung gestellt.
  4. Färben Sie das Gel mit einem kommerziellen Protein Beflecken Reagenz.

8. MALDI-TOF-MS-Analyse durch Trypsin-Verdauung

  1. Inkubieren Sie 100 µL der gereinigten GLP-E90DOPA (2,2 mg/mL oder 80 µM) in einem Puffer mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 % (w/V) SDS und 25 mM DTT bei 60 ° C für 1 h.
  2. Fügen Sie 1 µL Iodoacetamide in H2O (IAA, 4.0 M) (500 Äquiv, GFP-E90DOPA) auf die gereinigte GLP-E90DOPA Lösung (80 µM) in den gleichen Puffer. Inkubieren Sie die Mischung bei 25 ° C für 30 min mit Lichtschutz.
  3. Verdauen Sie die GLP-E90DOPA Probe durch Zugabe von Trypsin (1: 100-Protease-Substrat-Protein-Verhältnis [w/w]) zu und inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 37 ° C für 4 h.
  4. Reinigen Sie die verdaute Peptid-Probe C18 Spin Spalten eine Entsalzung Standardmethode mit.
  5. Analysieren Sie die verdauten Peptide durch die gemeldeten Protokoll für Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) mit Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure (CHCA) als ein Matrix-23.

Ergebnisse

Expressionssystem für die direkte Einbindung von DOPA Biosynthesized von einer TPL ist in Abbildung 1dargestellt. Die Gene für das weiterentwickelte aa-tRNA und AaRS paar befinden sich in ein Plasmid, und das GFP-gen (GFP-E90TAG) mit einem Bernstein Codon an Position 90 befindet sich in einer anderen Plasmid, die Einbeziehung von DOPA zu bewerten von GFP-Fluoreszenz. Das TPL-gen werden in das gleiche expressionsplasmid mit der GFP-gen und konstitutiv ausged...

Diskussion

In diesem Protokoll werden die Biosynthese und die direkte Einbindung von DOPA beschrieben. Die Bakterienzelle verwendet bei dieser Methode kann eine weitere Aminosäure synthetisieren und verwenden es als unnatürlich Baustein für die Proteinsynthese. Die genetische Einbeziehung der unnatürlichen Aminosäuren ist eine Schlüsseltechnologie für die Entwicklung der unnatürlichen Organismus mit einer erweiterten genetischen Code gewesen. Jedoch diese Methode wurde technisch unvollständigen und zur Effizienzsteigerung ...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Forschung wurde unterstützt durch die Global Frontier Research Program (NRF-2015M3A6A8065833), und die grundlegende Wissenschaft Research Program (2018R1A6A1A03024940) durch National Research Foundation of Korea (NRF) von der Korea-Regierung finanziert.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAGoptionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS21. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10βInvitrogenC6400-03Expression Host
Plasmid Mini-prep kitNucleogen5112200/pack
AgaroseIntron biotechnology32034500 g
Ethidium bromideAlfa AesarL074821 g
LB BrothBD Difco244620500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser BIO-RAD165-2100
Micro pulser cuvetteBIO-RAD165-20890.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin SodiumWako018-1037225 g
ChloramphenicolAlfa AesarB2084125 g
AgarSAMCHUN214230500 g
SOC mediumSigmaS1797100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99%Acros104981000100 g
Pyrocatechol, 99%SAMCHUNP138725 g
Ammonium sulfate, 99%SAMCHUNA0943500 g
pyruvic acid, 98%Alfa AesarA13875100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99%SAMCHUNS08911 kg
Potassium phophate, monobasic, 99%SAMCHUNP11271 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99%SAMCHUNM01461 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99%SAMCHUND0092500 g
Glycerol, 99%SAMCHUNG02691 kg
Trace metal mix a5 with coSigma9294925 mL
L-Proline, 99%SAMCHUNP125725 g
L-Phenylalanine, 98.5%SAMCHUNP198225 g
L-TryptophaneJUNSEI49550-031025 g
L-Arginine, 98%SAMCHUNA114925 g
L-Glutamine, 98%JUNSEI27340-031025 g
L-Asparagine monohydrate, 99%SAMCHUNA119825 g
L-MethionineJUNSEI73190-041025 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99%SAMCHUNH060425 g
L-Threonine, 99%SAMCHUNT293825 g
L-LeucineJUNSEI87070-031025 g
Glycine, 99%SAMCHUNG028625 g
L-Glutamic acid, 99%SAMCHUNG023325 g
L-Alanine, 99%SAMCHUNA154325 g
L-Isoleucine, 99%SAMCHUNI104925 g
L-Valine, 99%SAMCHUNV008825 g
L-SerineSAMCHUNS244725 g
L-Aspartic acidSAMCHUNA120525 g
L-Lysine monohydrochloride, 99%SAMCHUNL059225 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99%SAMCHUNI05781kg
Sodium phosphate monobasic, 98%SAMCHUNS09191 kg
Sodium Chloride, 99%SAMCHUNS29071 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 millilitersSONIC & MATERIALSVCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resinQIAGEN3021025 mL
Polypropylene columnQIAGEN3492450/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA 
Sodium periodate, 99.8&Acros4196100505 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) 
Cy5.5-ADIBO FutureChemFC-61191mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal FiltersMILLIPOREUFC50039696/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 %Sigma1070898400110 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4XThermofisherNP000710 mL
MES running bufferThermofisherNP0002500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gelsThermofisherNO032112 well
Coomassie Brilliant Blue R-250Wako031-1792225 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging SystemSyngeneG BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%SAMCHUNT1351500 g
Hydrochloric acid, 35~37%SAMCHUNH0256500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85%SAMCHUND1070250 g
IodoacetamideSigmaI61255 g
Trypsin Protease, MS GradeThermofisher900575 x 20 µg/pack
C-18 spin columnsThermofisher8987025/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5%SAMCHUNA0125500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acidSigmaC202010 g
Trifluoroacetic acid, 99%SAMCHUNT1666100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targetsBruker8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometerBruker

Referenzen

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