البروتين خارج الخلية ميكرواري تكنولوجيا للكشف عن ارتفاع الإنتاجية منخفضة تقارب مستقبلات-يجند التفاعلات

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا للشاشة البروتين خارج الخلية [ميكروارس] للتعرف على التفاعلات رواية مستقبلات-يجند في إنتاجية عالية. كما يصف لنا طريقة لتحسين الكشف عن تفاعلات البروتين البروتين عابر باستخدام مجمعات البروتين-ميكروبيد.

Abstract

يفرز عوامل ومستقبلات غشاء المربوطة وشركائها المتفاعلة الهيئات التنظيمية الرئيسية للاتصالات الخلوية والشروع في إشارات الشلالات خلال التوازن والمرض، وعلى هذا النحو تمثل الأهداف العلاجية الرئيسية. وعلى الرغم من أهميتها، تظل هذه الشبكات التفاعل الممثلة تمثيلاً ناقصاً إلى حد كبير في قواعد البيانات الحالية؛ ولذلك، يكون معظم البروتينات خارج الخلية لا شريك ملزمة موثقة. هذا التناقض يرجع أساسا إلى التحديات المرتبطة بدراسة البروتينات خارج الخلية، بما في ذلك التعبير عن البروتينات الوظيفية، وتقارب ضعف، وانخفاض، تفاعلات البروتين التي كثيرا ما تنشأ بين مستقبلات سطح الخلية. والغرض من هذا الأسلوب وصف طباعة مكتبة بروتينات خارج الخلية بتنسيق ميكرواري للفرز لتفاعلات البروتين البروتين. لتمكين الكشف عن التفاعلات الضعيفة، ويرد وصف أسلوب يقوم على مولتيميريزيشن البروتين الاستعلام قيد الدراسة. بالإضافة إلى هذا النهج القائم على ميكروبيد مولتيميريزيشن لزيادة مولتيفالينسي، ميكرواري البروتين يتيح الكشف عن قوي لتفاعلات البروتين البروتين عابر في إنتاجية عالية. ويوفر هذا الأسلوب عينة السريع وانخفاض استهلاك--نهجاً للتعرف على التفاعلات الجديدة تنطبق على أي البروتين خارج الخلية. ويرد وصف البروتين ميكرواري الطباعة والفرز بالبروتوكول. هذه التقنية ستكون مفيدة للمحققين التماس وسيلة قوية لاكتشاف تفاعلات البروتين في الفضاء خارج الخلية.

Introduction

ويصف الأسلوب الذي استعرض هنا طباعة مجموعة من البروتينات خارج الخلية في تنسيق ميكرواري، تليها طريقة لفحص هدفا لمصلحة ضد هذه المكتبة. لقد حددنا مولتيميريزيشن البروتين كخطوة حاسمة للكشف عن التفاعلات التي تتميز بالصلات ملزمة منخفضة. تعزيز الكشف عن هذه التفاعلات، يصف لنا بروتوكول استناداً إلى مولتيميريزيشن البروتين الاستعلام من اهتمام باستخدام ميكروبيدس.

يفرز والمنظمين الرئيسيين للاتصالات الخلوية والإشارات والتفاعل مع المكروية الخلية أعرب عن سطح البروتينات (يطلق عليها مجتمعة البروتينات خارج الخلية) جنبا إلى جنب مع شركائها في التفاعل. ولذلك، أنها ضرورية في تنظيم الكثير من العمليات الفسيولوجية والمرضية. تقريبا ربع المجين البشري (إيتش فايف، 000 البروتينات) ترميز للبروتينات خارج الخلية، التي، نظراً لأهميتها وإمكانية الوصول للأدوية تم تسليمها بشكل منهجي، وتمثل أهدافا رئيسية للمخدرات التنمية¹. ونتيجة لذلك، تمثل البروتينات خارج الخلية أكثر من 70% الأهداف البروتين مع العمل الدوائية المعروفة للأدوية المعتمدة على السوق، والمعروفة باسم "البروتين دروجابل". على الرغم من أهميتها ووفرة، شبكات التفاعل (أبي) البروتين البروتين خارج الخلية يظل ناقصاً اللافت للنظر في قواعد البيانات المتاحة. وهذا يعود إلى طبيعة البيوكيميائية المعقدة من البروتينات خارج الخلية، مما يحول دون توصيف استخدام التكنولوجيات المتاحة الأكثر². أولاً، يصعب بروتينات الغشاء من جعل، هي عملية غالباً ما ينطوي على ظروف قاسية الغسيل والمنظفات؛ ثانيا، غالباً ما تفتقد البروتينات خارج الخلية التعديلات ذات الصلة بوستترانسلاشونال مثل جليكوسيليشن التي غائبة عندما ترد هذه البروتينات في عادة تستخدم أنظمة مغايرة. وأخيراً، التفاعلات بين المستقبلات، مثل مستقبلات المشارك في الخلايا المناعية، وأعرب عن غالباً ما تكون عابرة واتسمت بوشائج منخفضة جداً (ك_د في ميكرومتر ~ 1 إلى > 100 ميكرومتر النطاق). بالإجمال، طبيعة هذه البروتينات وملزمة تقديم الشركاء الأكثر على نطاق واسع تستخدم التكنولوجيات، مثل تقارب تنقية/قياس الطيف الكتلي (AP/MS) أو خميرة-اثنين-الهجين، غير مناسب للكشف عن التفاعلات في الفضاء خارج الخلية ^{2 , 3}.

في محاولة للتغلب على هذه التحديات التقنية والتعجيل باكتشاف رواية تفاعلات البروتينات خارج الخلية، قمنا بتطوير تغطية عالية بروتين خارج الخلية ميكرواري^4،5. [ميكروارس] توفر ميزة توليد الأسطح عالية الكثافة مع كميات صغيرة من العينة، وهي عموما قابلة لدراسات الإنتاجية العالية. وفرت الدراسات ميكرواري البروتين سابقا أفكاراً ذات الصلة في تفاعلات البروتين لعدة نموذج الكائنات، أن كانت تركز أساسا على التفاعلات سيتوسوليك أو البروتين محددة الأسر^{6،7، 8}. وفي المقابل، قد أنجز عمل محدودة للتحقيق في تفاعلات البروتين خارج الخلية باستخدام هذه التكنولوجيا. قمنا بتطوير أسلوب ميكرواري بروتين لتمكين الدراسات عبيس ببناء مكتبة شاملة ومتنوعة جداً من البروتينات يفرزها المنقي والمستقبلات (STM) transmembrane واحد أعرب عن المجالات خارج الخلية المؤتلف (النماء) تنصهر فيها العلامات الشائعة ل تنقية تقارب⁴. نجاح على شاشات ميكرواري البروتين تعتمد اعتماداً كبيرا على إنشاء مكتبة البروتين ذات جودة عالية. للتعبير عن البروتين كل مكتبة والاستعلام، خلايا الثدييات أو خلايا الحشرات تفضيلي اختيرت كأنظمة تعبير مغايرة، لضمان الصحيح إضافة التعديلات بوستترانسلاشونال مثل سندات glycosylation أو الميثيل. الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، حجم الاستبعاد اللوني وضوء الليزر زاوية المتعددة تناثر من التقنيات الشائعة المستخدمة لتقييم نوعية البروتين المؤتلف. مكتبة البروتين ثم رصدت على الشرائح ابوكسيسيلاني وتخزينها في-20 درجة مئوية للاستخدام على المدى الطويل. وأوصت تركيزات البروتين تزيد من 0.4 ملغ/مل للبروتوكول هو موضح أدناه. ولذلك، قد تتطلب البروتينات منخفضة-وإذ يعرب عن خطوة تركيز قبل نموذج الطباعة والتخزين. ومع ذلك، مزايا رئيسية لهذا الأسلوب هي حجم صغير البروتين المطلوب (50 ميكروغرام من البروتين كافية لأداء > شاشات 2,000)، جنبا إلى جنب مع استهلاك البروتين الاستعلام الحد الأدنى (20-25 ميكروغرام كل التكرارات الشاشة). استخدام البروتوكول والمعدات الموصوفة هنا، وشريطة توافر المكتبات، يمكن توليد نتائج لاستعلام فردي البروتينات خلال يوم عمل واحد.

تحديا كبيرا في الكشف عن تفاعلات البروتين في البيئة خارج الخلية تنشأ من طبيعتها ضعيفة أو عابر مميز، مما يحول دون تحديد المنهجيات الأكثر استخداماً. ويحسن حساسية للكشف عن البروتين ضعف التفاعلات^9،،من¹⁰¹¹زيادة اللذة ملزمة إلى حد كبير. استناداً إلى هذا المبدأ قمنا بتطوير أسلوب مولتيميريزي البروتينات الاستعلام (معبراً عنها كالانصهار Fc) استخدام البروتين المغلفة بالخرز^4،5. لتجنب أي المنظمة المحتملة من البروتين الاستعلام بوصفها عشوائية، نحن تسمية مناعي البشري غير ذي صلة ز مع Cy5 بدلاً من ذلك وإضافته جنبا إلى جنب مع البروتين الاستعلام الخرز البروتين أ، وبالتالي القضاء على أي القطع الأثرية بسبب تصريف مباشر صبغ لبروتين الفائدة. ونظرا للصلات micromolar عدة مستقبلات المشارك أزواج، يعزز المجمعات متعددي إشارة إلى نسبة الضوضاء، مقارنة بالبروتينات الاستعلام Fc-الانصهار فرزهم كالبروتينات القابلة للذوبان⁴.

وخلاصة القول، والهدف من هذا البروتوكول وصف إعداد الشرائح ميكرواري يحتوي على مكتبة بروتين خارج الخلية موجودة من قبل للتعرف على التفاعلات مستقبلات-يجند. نقوم بمراجعة الخطوات اللازمة للشرائح الطباعة، متبوعاً ببروتوكول لفحص بروتين تهم ضد المكتبة البروتين خارج الخلية. وعلاوة على ذلك، يصف لنا طريقة للكشف المعززة من أبيس استناداً إلى ميكروبيدس لتحقيق اللذة زيادة من البروتين قيد الدراسة. التكنولوجيا ميكرواري البروتين خارج الخلية الموضحة هنا تمثل نهجاً سريعة وقوية وفعالة للفحص والكشف عن أبي رواية مع انخفاض نسب إيجابية كاذبة، وعن طريق استخدام كميات ميكروغرام فقط من البروتين الاستعلام تحت التحقيق. وقد غذت هذه التكنولوجيا الدراسات المتعددة التي قدمت أفكاراً ذات الصلة في الوظائف الخلوية غير معروف سابقا ومسارات الإشارات لمجموعة متنوعة من مستقبلات^12،13، بما في ذلك¹⁴من إيمونوريجولاتورس الفيروسية، ويمكن أن يستفاد من دي أورفانيزي أي البروتين خارج الخلية للفائدة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-جيل مكتبة بروتينات البشرية خارج الخلية

1. تجميع قائمة من مستقبلات سطح الخلية أو البروتينات يفرز من الفائدة لبناء المكتبة ميكرواري البروتين. الأسر البروتين محددة (على سبيل المثال، فوق عائلة الغلوبولين المناعي) أو البروتينات أعربت بشكل انتقائي وبخاصة الخلية يمكن تحديد أنواع للدراسة.
2. لمستقبلات الخلية السطحية، تحديد حدود المجال خارج الخلية (النماء) بتحديد إشارة هضميد ومناطق ترانسميمبراني باستخدام أدوات البرمجيات. بعض ذات الصلة أدوات، متاحة مجاناً على الإنترنت، ويتم الرجوع إليها في الجدول للمواد^15،16،،من¹⁷¹⁸.
3. توليف النماء للجينات للفائدة واستنساخ في ناقلات الأمراض ذات الصلة. يمكن تنقية البروتينات يفرزها أو مستقبلات "نماء الطفولة المبكرة لتحقيق الاستقرار والانتساب" تنصهر فيها إلى عدد من العلامات تقارب مشترك من الوسائط مكيفة من الخلايا transfected مع ناقل مناسب، أو من أنظمة تعبير خلية باكولوفيروس الحشرات.
   ملاحظة: الأنظمة المستندة إلى خلية الثدييات (مثل HEK/293 أو خلايا تشو) ينصح إلى أقصى حد احتمال طي البروتين السليم، وإضافة التعديلات ذات الصلة بوستترانسلاشونال مثل جليكوسيليشن.
4. تنقية البروتينات بأساليب تنقية النسب القياسية. وقد وصف الجهود السابقة الإجراءات التلقائية أو شبه الآلية المناسبة لتنقية المئات من البروتينات، التي يمكن أن يكون تحجيم لتوليد مجموعة البروتينات للفائدة^9،،من^{1920، 21}.
   ملاحظة: يوصي الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، حجم الاستبعاد اللوني (S)، أو الليزر زاوية المتعددة تناثر الضوء (مراكز التسوق) لتقييم أي تجميع غير التساهمية ومراقبة للجودة الشاملة للأعمال التحضيرية البروتين.
5. ضبط البروتينات إلى ميكروغرام/مل 200 أو 400 كلما كان ذلك ممكناً، وتمييع الأرصدة مع والغليسيرول 80% للتخزين على المدى الطويل في قنينات المبردة في-20 درجة مئوية. وهذه تمثل الأرصدة الرئيسية ويجب أن يكون الوصول إليها إلا عند الضرورة.
6. نقل مختبرين لكل البروتين (100 ميكروليتر) إلى 96-جيدا لوحات (لوحات الأسهم) وختم مع إحباط لاصقة وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى ميكرواري إعداد الشرائح. يتم إنشاء لوحات الأسهم لتقليل دورات تجميد أذاب وضمان الاستقرار البروتين.

2-خارج الخلية البروتين ميكرواري الطباعة

1. استخدام ميكروارايير قياسية لطباعة الشرائح. أداة تستخدم للبروتوكول هو موضح هنا له قدرة الشرائح 57/تشغيل ويستخدم رأس طباعة عقد دبابيس اكتشاف 48. هذه الدبابيس توليد البقع ~ 100 ميكرومتر قطرها مفصولة بمسافة بقعة إلى بقعة ميكرومتر ~ 350 وتوجه ميكروليتر 0.25 للتحميل. تحت هذا التكوين، حتى البقع 8,000 كل شريحة يمكن استيعابها.
2. إنشاء لوحات العمل (384 لوحات جيدا، 10 ميكروليتر عينة/حسنا) من لوحات الأسهم. تنفيذ هذه الخطوة يدوياً قبل الطباعة الشريحة باستخدام في ميكروارايير. ثم، بقعة البروتينات مع دبابيس اكتشاف نوع الريشة على الشرائح ابوكسيسيلاني في الرطوبة 60% (منع جفاف البقع البروتين).
   ملاحظة: يمكن رصدها ألبومين المصل البقري المسمى Cy3 (BSA) في التكرارات بين كل عينة البروتين (5 ميكروغرام/مل في الجلسرين PBS/40%) لتصور الصفيف للقناع المناسب (انظر القسم 4). على الرغم من أن أوصى، هذه الخطوة اختيارية.
3. بعد الطباعة، إزالة الشرائح ميكرواري البروتين من البيئة هوميديفيد ومنعها بين عشية وضحاها مع الحليب 5% في ببست لإلغاء تنشيط السطح.
   ملاحظة: هو النهج المفضل لاستخدام هو الموجات فوق الصوتية لتوليد غرامة ضباب لعرقلة الحل الذي يستقر على سطح الشريحة.
4. تخزين الشرائح في-20 درجة مئوية في الجلسرين 50% لمنع تجمده.

3-إعداد مجمعات الطعم متعددي

ملاحظة: التفاعلات بين البروتينات خارج الخلية غالباً ما تتسم بانخفاض الانتماءات. لتمكين الكشف عن هذه التفاعلات بزيادة اللذة ملزمة، نهجاً متعددي استناداً إلى التقاط البروتين الاستعلام، أعرب كمعلم نادي نماء الطفولة المبكرة، على ميكروبيدس المغلفة بالبروتين كان نمواً⁴.

1. تسمية الناقل مفتش المستخدمة للكشف مع صبغة مونوريكتيفي Cy5 وفصل صبغ مجاناً باستخدام أعمدة الملحي. تحديد الصبغة إلى نسب البروتين عن طريق قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 و 650 نانومتر.
   ملاحظة: عادة ما تستخدم نسب البروتين-صبغ بين 2.0 و 4.0. من المستحسن أن تدور يصرف Cy5 في س 100,000 ز لمدة 15 دقيقة لإزالة المجاميع للذوبان المحتملة الناجمة عن عملية وضع العلامات.
2. تحديد نسبة ميكروبيد للبروتين المثلى بمعايرة البروتين A ضد كمية ثابتة من البروتين الاستعلام. حجم الحد الأدنى تشبع الخرز حيث لا يزال أي البروتين معلم Fc مجاناً، كما تقاس باستخدام مقايسة تنافسية يحددها قياس التداخل بيولايير، يستخدم للفحص.
3. تشكل مجمعات ميكروبيد بالبروتين التي تفرخ الاستعلام Fc معلم ومفتش Cy5 مع ميكروبيدس البروتين A والمزيج على المدورة أنبوب في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء.
4. لتشكيل هذه المجمعات، استخدم البروتين الاستعلام بتركيز نهائي من 20 ميكروغرام/مل. لحساب نسبة البروتين الاستعلام ومفتش Cy5 المولى، تقسم الوزن الجزيئي للبروتين الاستعلام بالوزن الجزيئي لمفتش (150,000 دا) وقم بضرب 40 ميكروغرام/مل لتحديد تركيز Cy5-مفتش اللازمة.
5. الملحق عينات مع البروتين للذوبان (1 ملغ/مل) مباشرة قبل الحضانة مع ميكرواري الشرائح (انظر القسم 4.2 أدناه) لمنع ملزمة لأي الخرز بالبروتين مجاناً إلى نادي الانصهار البروتينات التي قد تكون موجودة في الصفيف.
   ملاحظة: قد تختلف عن حجم الرد النهائي الدائرة محطة أو حضانة التهجين باستخدام. الأجهزة المذكورة في الجدول للمواد يسمح حضانة العينات باستخدام كميات صغيرة نسبيا (~ 200 ميكروليتر كل شريحة).

4-خارج الخلية البروتين ميكرواري الفحص والمعالجة.

ملاحظة: هناك عدد من الشركات المصنعة التي توفر منصات المعالجة التلقائية. إذا لم يتوفر محطة تهجين، يمكن تنفيذ الخطوات التالية يدوياً، وضمان عدم وجود حجم كاف للمخزن المؤقت للحفاظ على الشرائح المغمورة في جميع الأوقات.

1. الشرائح في درجة حرارة الغرفة دافئة وشطف مع توين PBS/0.1% 20 (ببست) لإزالة والغليسيرول المتبقية قبل تحميلها على محطة التهجين.
2. استخدام بروتوكول الفحص التالية:
   1. غسل مع ببست لمدة 1 دقيقة.
   2. تحميل 200 ميكروليتر من البروتين 1 ملغ/مل A في اللبن PBS/5% واحتضان لمدة 30 دقيقة لمنع البروتين أونكومبليكسيد ميكروبيدس من الربط إلى معلم Fc البروتينات التي قد تكون موجودة في ميكرواري.
   3. غسل خمس مرات مع ببست لمدة 1 دقيقة.
   4. تحميل 200 ميكروليتر من مجمع حضور البروتين 1 ملغ/مل بالاستعلام: ميكروبيدس واحتضان لمدة 30 دقيقة.
   5. غسل مع ببست لمدة 1 دقيقة.
3. بعد التهجين، شطف الشرائح مع المياه ووضع في أنابيب مخروطية 50 مل الفردية والجاف بالغزل في 900 غ س لمدة 5 دقائق.
4. وأخيراً، مسح الشرائح مع الماسح الضوئي ميكرواري المناسبة للكشف عن Cy3 (إذا كان قد تم طبع جيش صرب البوسنة-Cy3) والأسفار Cy5 بإثارة في 532 و 635 نانومتر، على التوالي.
5. القيام بتحليل البيانات باستخدام تحليل البيانات ميكرواري المصاحبة لها. يتم تحميل قائمة المصفوفة ذات الصلة (كملف.gal) إلى برنامج استخراج البيانات. وفي هذه المرحلة، الاستفادة من البقع Cy3-جيش صرب البوسنة للبحث عن القطع واستخدام خيارات السيارات لتركيب البرمجيات، متبوعاً بمحاذاة يدوياً من الميزات عند الضرورة. حفظ الملفات كملفات.gpr لمزيد من التحليل.

5-بيانات التحليل

1. حفظ البيانات كملفات لائحة برلمان غرينلاند وعملية في البحث والتطوير باستخدام حزمة ليما، يشيع استخدامها لتحليل البيانات ميكرواري^4،5.
   1. خلفية لتجهيزها، تصحيح والتطبيع داخل الشريحة. حيث تتم طباعة كل البروتين في البقع المكررة، الجمع بين كلا القياسات نسخ متماثل لإنشاء درجة واحدة لهذا البروتين في المكتبة.
   2. حساب الدرجات لكل شريحة، وتحليل النتائج للتقاطع بين المرشحين التهديف عالية بين الشرائح.
   3. [ميكروارس] مكررة من تشغيل طباعة منفصلة للتحكم لتقلب الشرائح واستخدامها المؤامرات تقاطع تمثل البيانات من كل من الشاشات لاستدعاء يضرب النهائي.
   4. وأخيراً، أداء مستوى إضافي من تصفية لاستبعاد البروتينات منحل داخل الصفيف. وتحدد هذه الاضبارات غير محددة البروتينات التي تتجاوز عتبة معينة ضرب التردد حسب تعريف المستخدم عبر شاشات مستقلة.
      ملاحظة: يرد هذا البروتوكول بالتفصيل في توم et al. عام 2013⁵. في حالتنا الموثق غير محددة تدعو يستند تحديد التراكمي فريسة بلغ معدل، ويتم استخدام عتبة القضاء المبنية على البيانات من 5%.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويرد في الشكل 1تخطيطي لسير العمل للتكنولوجيا ميكرواري البروتين خارج الخلية. حالما تتوفر ميكرواري الشرائح التي تحتوي على مكتبة البروتين خارج الخلية، يمكن إكمال فحص البروتين الفائدة وتحليل البيانات خلال يوم واحد. العديد من التفاعلات الفيزيولوجية الصلة ب?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يظل عدد كبير من مستقبلات اليتيمة في الجينوم البشري، ويواصل الشركاء المتفاعلة رواية الخروج للبروتينات خارج الخلية مع يغاندس تتسم سابقا. تحديد التفاعلات مستقبلات-يجند في الإنسان والكائنات نموذج أمر ضروري لفهم الآليات التي تملي الاتصالات الخلوية أثناء التوازن، فضلا عن التقلبات التي تؤدي ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultra Pure MB Grade glycerol	USB Corporation	56-81-5	Protein storage
SeptoMark blocking buffer	Zeptosens	BB1, 90-40	Blocking buffer microarray slides
Bovine serum albumin	Roche	03-117-957-001	Slide control for mask fitting (optional)
Polypropylene multiwell plates	Greiner Bio One	82050-678	Protein storage
Polypropylene multiwell plates	Arrayit	MMP384	Slide printing
NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer	Arrayit	NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer	Slide printing
Micro spotting pins	Arrayit	Micro spotting pins	Slide printing
ZeptoFOG blocking station	Zeptosens	ZeptoFOG blocking station, 1210	Block slides after printing
Skim milk powder	Thermo Fisher	LP0031	Blocking solution
Epoxysilane-coated glass slide	Nextrion Slide E	1064016	Microarray slides
Glass holder and slide rack set	Wheaton	900303	Slide storage
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA23031	Albumin labeling
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001	Human IgG labeling
Pro-spin desalting column	Princeton Separations	CS-800	Remove free dye
Adhesive aluminum foil seal	AlumaSeal	F-384-100	Seal stock plates
Polypropylene cryogenic vials	Corning	430658	Master vials for protein library storage
Protein A microbeads	Miltenyi	120-000-396	Query protein multimerization
Human IgG	Jackson Immunoresearch	009-000-003	Irrelevant IgG for labeling
Protein A	Sigma	P7837	Microarray slide blocking
Hybridization station, a-Hyb or similar	Miltenyi	Hybridization station, a-Hyb or similar	Automated microarray processing (optional)
GenePix 4000B scanner or similar	Molecular Devices	GenePix 4000B scanner or similar	Slide scanning
GenePix Pro or equivalent data extraction software	Molecular Devices	GenePix Pro or equivalent data extraction software	Data processing
Signal P4.1	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	online software	Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites
TMHMM 2.0 server	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	online software	Prediction of transmembrane helices in proteins
Phobius	Stockholm Bioinformatics Center	online software	A combined transmembrane topology and signal peptide predictor
TOPCONS	Stockholm University	online software	Prediction of membrane topology and signal peptides