Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bildschirm extrazelluläre Protein Microarrays zur Identifizierung von Roman-Rezeptor-Ligand-Interaktionen in hohem Durchsatz. Wir beschreiben auch eine Methode zur Erkennung von transienten Proteinprotein Interaktionen zu verbessern mithilfe von Protein-Microbead-komplexe.

Zusammenfassung

Sezernierten Faktoren, Membran-angebunden-Rezeptoren und ihren Interaktionspartnern sind wichtigsten Regulatoren des Mobilfunkes und Einleitung der Signalisierung Kaskaden während der Homöostase und Krankheit, und als solche therapeutischen Ziele dar. Trotz ihrer Relevanz bleiben diese Interaktion Netze deutlich unterrepräsentiert in aktuellen Datenbanken; Daher müssen die extrazellulären Proteine keine dokumentierten Bindungspartner. Diese Diskrepanz ist vor allem auf die Herausforderungen im Zusammenhang mit dem Studium der extrazellulären Proteine, einschließlich Ausdruck Funktionsproteine und der schwachen, niedrige Affinität, Protein-Interaktionen, die oft zwischen Zellrezeptoren Oberfläche hergestellt. Diese Methode dient zum Drucken einer Bibliothek von extrazellulären Proteinen in einem Microarray-Format für das Screening von Protein-Protein-Wechselwirkungen beschreiben. Zur Erkennung der schwachen Wechselwirkungen zu ermöglichen, wird eine Methode basiert auf Multimerization des Proteins Abfrage unter Studie beschrieben. Dabei Microbead-basierte Multimerization für erhöhte Multivalenz gekoppelt, ermöglicht die Protein-Microarray robuste Erkennung von transienten Protein-Protein-Interaktionen in hohem Durchsatz. Diese Methode bietet einen schnellen und niedrigen Probe verbraucht-Ansatz zur Identifizierung von jedem extrazelluläre Protein für neue Interaktionen. Protein-Microarray-Druck und screening-Protokoll werden beschrieben. Diese Technologie wird für die Ermittler suchen eine robuste Methode zur Entdeckung von Protein-Interaktionen in den Extrazellulärraum nützlich sein.

Einleitung

Die Methode überprüft hier beschreibt das Drucken aus einer Sammlung von extrazellulären Proteine in einem Microarray-Format, gefolgt von einer Methode für das Screening eines Ziels des Interesses gegen diese Bibliothek. Wir haben als ein entscheidender Schritt für die Erkennung von Interaktionen gekennzeichnet durch niedrige verbindliche Affinitäten Protein Multimerization identifiziert. Zur Erkennung dieser Interaktionen zu verbessern, beschreiben wir ein Protokoll basiert auf Multimerization der Abfrage-Proteins des Interesses mit Microbeads.

Sezerniert und Oberfläche ausgedrückt Zellproteinen (kollektiv extrazellulären Proteine genannt) zusammen mit ihren Interaktionspartnern sind wichtige Regulatoren des Mobilfunkes, Signalisierung und Interaktion mit der Mikroumgebung. Sie sind daher unerlässlich bei der Regulierung der vielen physiologischer und pathologischer Prozessen. Etwa ein Viertel des menschlichen Genoms (≈5, 000 Proteine) für extrazelluläre Proteine kodiert, die aufgrund ihrer Bedeutung und Zugänglichkeit systematisch gelieferten Medikamente, wesentliche Ziele für Droge-Entwicklung-¹vertreten. Folglich stellen extrazellulären Proteine mehr als 70 % der Protein-Targets mit bekannten pharmakologischen Wirkung für zugelassene Medikamente auf dem Markt, bekannt als das "druggable Proteom". Trotz ihrer Bedeutung und Fülle bleiben die extrazelluläre Protein-Protein Interaktion (ePPI) Netze auffallend unterrepräsentiert in den verfügbaren Datenbanken. Dies ist grundsätzlich aufgrund der komplexen biochemischen Natur der extrazellulären Proteine, die deren Charakterisierung mit den meisten verfügbaren Technologien²ausschließt. Erstens sind Membranproteine schwer zu lösen, einen Prozess, der oft harten waschen Bedingungen und Reinigungsmittel beinhaltet; Zweitens fehlt extrazellulären Proteine häufig relevanten post-translationalen Modifikationen wie Glykosylierung, die fehlen, wenn diese Proteine in allgemein ausgedrückt werden heterologe Systemen verwendet. Schließlich, Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren, wie Co-Rezeptoren auf Immunzellen, ausgedrückt sind oft vorübergehend und zeichnet sich durch sehr niedrige Affinitäten (K-_D in ~ 1 μM bis > 100 μM-Bereich). Insgesamt verwendet die Natur dieser Proteine und deren Bindung, die am weitesten verbreitete Partner erbringen Technologien wie Affinität Reinigung/Massenspektrometrie (AP/MS) oder Hefe-zwei-Hybrid, ungeeignet für die Erkennung von Interaktionen in den Extrazellulärraum ^{2 , 3}.

In dem Bemühen, diese technische Herausforderungen zu meistern und beschleunigen die Entdeckung neuartiger Interaktionen für extrazelluläre Proteine entwickelten wir eine hohe Abdeckung extrazelluläre Protein Microarray^4,5. Microarrays bieten den Vorteil hoher Dichte Oberflächen mit kleinen Probenmengen zu erzeugen und sind in der Regel für Hochdurchsatz Studien zugänglich. Protein Microarray-basierte Studien haben bereits relevante Einblicke in Protein-Interaktionen für mehrere Modellorganismen vorgesehen, allerdings mit Schwerpunkt vor allem auf cytosolischen Interaktionen oder spezifisches Protein Familien^{6,7, 8}. Im Gegensatz dazu hat begrenzte gearbeitet um extrazelluläre Protein-Interaktionen mit dieser Technologie zu untersuchen. Haben wir eine Protein Microarray Methode zum Studium der ePPIs ermöglichen durch den Aufbau einer umfassenden und vielseitigen Bibliothek der gereinigten sekretierten Proteine und einzelne transmembrane (STM) Rezeptoren ausgedrückt als rekombinante extrazelluläre Domänen (ECD) verschmolzen häufige Tags für Affinität Reinigung⁴. Der Erfolg der Protein-Microarray-Bildschirme stützt sich auf die Schaffung einer qualitativ hochwertigen Protein-Bibliothek. Für den Ausdruck von der Bibliothek und die Abfrage Protein wurden Säugerzellen oder Insektenzellen bevorzugt als heterologe Expressionssysteme gewählt um richtige Zugabe von post-translationalen Modifikationen wie Glykosylierung oder umgeformt Anleihen sicherzustellen. SDS-PAGE, Größe Ausgrenzung Chromatographie und Laser Multiwinkel Lichtstreuung sind Techniken häufig genutzt, um rekombinante Proteinqualität zu bewerten. Die Protein-Bibliothek ist dann auf Epoxysilane Dias gesichtet und bei-20 ° C für die langfristige Nutzung gespeichert. Proteinkonzentrationen oberhalb von 0,4 mg/mL sind für die nachfolgend beschriebenen Protokoll empfohlen. Daher erfordern niedrig exprimierenden Proteine einen Konzentration Schritt vor der Probe drucken und speichern. Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik ist jedoch das geringe Volumen des Proteins erforderlich (50 μg des Proteins ist ausreichend, um ausführen > 2.000 Bildschirme), neben minimalen Abfrage Proteinkonsum (20-25 μg pro Duplikate Bildschirm). Mit dem Protokoll und Ausrüstung hier beschrieben und Bibliotheken zur Verfügung gestellt, können Ergebnisse für Einzelabfrage Proteine erzeugt werden, innerhalb eines Arbeitstages.

Eine große Herausforderung bei der Aufdeckung von Protein-Interaktionen in der extrazellulären Umgebung ergibt sich aus ihrer charakteristisch schwach oder vorübergehender Natur, die Identifizierung durch die am häufigsten verwendeten Methoden ausschließt. Erhöhung der verbindlichen Avidity stark verbessert Empfindlichkeit zur Erkennung von schwachen Protein Interaktionen^9,10,11. Basierend auf diesem Prinzip wir entwickelten eine Methode, um Multimerize die Abfrage-Proteine (ausgedrückt als Fc Fusion) mit Protein A-beschichtete Perlen^4,5. Um jede mögliche Inaktivierung des Abfrage-Proteins durch zufällige Kennzeichnung zu vermeiden, wir stattdessen eine irrelevante menschliche Immunglobulin G mit Cy5 beschriften und fügen Sie es zusammen mit dem Abfrage-Protein Protein A-Perlen, wodurch Artefakte aufgrund der direkten Konjugation von einem Färben Sie, das Protein des Interesses. Angesichts der mikromolaren Affinitäten von mehreren Paaren Ko-Rezeptor, verbessern die multivalente Anlagen stark Signal-Rausch-Verhältnis, im Vergleich zu Fc-Abfrage Fusionsproteine als lösliche Proteine⁴gezeigt.

Zusammenfassend lässt sich sagen ist das Ziel dieses Protokolls, die Vorbereitung der Microarray-Folien mit einer vorbestehenden extrazelluläre Protein Bibliothek zur Identifizierung von Rezeptor-Ligand-Interaktionen zu beschreiben. Wir überprüfen die Schritte für die Folie drucken, gefolgt von einem Protokoll für das Screening von einem Protein des Interesses gegen die extrazelluläre Protein-Bibliothek. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode für die erweiterte Erkennung von ePPIs basierend auf Microbeads erhöhte Avidität des Proteins unter Studie zu erreichen. Die hier beschriebenen extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie stellt einen schnellen, robusten und effektiven Ansatz für screening und Erkennung von neuartigen ePPI mit niedrige False-Positive-Verhältnisse und durch die einzige Mikrogramm Mengen des Proteins Abfrage unter Verwendung Untersuchung. Diese Technologie hat mehrere Studien angeheizt, die relevante Einblicke in bisher unbekannte Zellfunktionen und Signalwege für eine Vielzahl von Rezeptoren^12,13, darunter virale Immunoregulators¹⁴zur Verfügung gestellt haben, und kann genutzt werden, um eine extrazelluläre Protein des Interesses de-orphanize.

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Protokoll

1. Generation aus einer Bibliothek von extrazellulären menschliche Proteine

1. Stellen Sie eine Liste der Zelle Oberfläche Rezeptoren oder sekretierten Proteine des Interesses, die Protein-Microarray-Bibliothek zu bauen. Bestimmte Proteinfamilien (z. B. der Immunglobulin-Superfamilie) oder Proteine selektiv ausgedrückt insbesondere Zelle Arten für die Studie ausgewählt werden können.
2. Bestimmen Sie für Oberfläche Zellrezeptoren die Domänengrenzen der extrazellulären (ECD) durch Ermittlung der Signalpeptid und transmembranen Regionen mit Software-Tools. Einige der einschlägigen Werkzeuge, online frei verfügbar, sind in der Tabelle der Materialien^15,16,17,18verwiesen.
3. ECD für die Gene von Interesse und Klon in den relevanten Vektor zu synthetisieren. Sekretierten Proteine oder die ECD STM-Rezeptoren verschmolzen zu einer Reihe von gemeinsamen Affinität-Tags können von den konditionierten Medien mit den entsprechenden Vektor transfected Zellen oder Baculovirus-Insekt Zelle Expressionssysteme gereinigt werden.
   Hinweis: Säugetier-Zelle-basierten Systemen (z. B. HEK/293 oder CHO-Zellen) werden empfohlen, um die Wahrscheinlichkeit der richtigen Proteinfalte und Zugabe von relevanten posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierung zu maximieren.
4. Reinigen Sie die Proteine durch standard Affinität Reinigungsverfahren. Frühere Bemühungen haben geeignet für die Reinigung von Hunderten von Proteinen, automatische oder halbautomatische Verfahren beschrieben, die skaliert werden kann, um die Menge der Proteine des Interesses^{9,19,20zu generieren, 21}.
   Hinweis: SDS-PAGE, Größe Ausgrenzung Chromatographie (S) oder Multi-Angle-Laser Licht Streuung (MALLS) sind empfehlenswert, nicht-kovalente Aggregation zu bewerten und für die Gesamtqualität der Protein-Vorbereitungen zu kontrollieren.
5. Proteine, 200 oder 400 μg/mL wann immer möglich, anpassen und verdünnen Sie Aktien mit 80 % Glycerin für die Langzeitlagerung in kryogenen Fläschchen bei-20 ° C. Diese Meister Aktien und sollte nur bei Bedarf abgerufen werden.
6. Aliquote jedes Proteins (100 μl) auf 96-Well-Platten (Lager-Platten) übertragen, versiegeln mit Klebefolie und bei-20 ° C bis zur Microarray Folie Vorbereitung lagern. Lager-Platten werden generiert, um Frost-Tau-Wechseln zu minimieren und Proteinstabilität zu gewährleisten.

(2) extrazelluläre Protein Microarray drucken

1. Verwenden Sie ein standard Microarrayer für Folie drucken. Das Instrument für das hier beschriebene Protokoll verwendet hat eine Kapazität von 57 Folien/Lauf und nutzt einen Druckkopf 48 spotting Stifte halten. Diese Pins generieren Spots von ~ 100 μm Durchmesser eine Punkt-zu-Punkt-Abstand von ~ 350 μm und zieht 0,25 μl pro Ladung. Bei dieser Konfiguration können bis zu 8.000 Punkte pro Folie untergebracht werden.
2. Generieren Sie Arbeits-Platten (384 well-Platten, 10 μl Probe/Brunnen) von den Lager-Platten. Führen Sie diesen Schritt manuell vor dem Folie drucken mit der Microarrayer. Vor Ort dann Proteine mit Feder-Typ spotting Pins auf Epoxysilane Folien bei 60 % Luftfeuchtigkeit (um Austrocknung der Proteinspots zu verhindern).
   Hinweis: Cy3 beschriftet Rinderserumalbumin (BSA) kann in Duplikate zwischen jedes Protein Sample (5 μg/mL in PBS/40% Glycerin) gesichtet werden, um das Array für Maske passend (siehe Abschnitt 4) zu visualisieren. Obwohl empfohlen wird, ist dieser Schritt optional.
3. Im Anschluss an drucken, entfernen Sie die Protein-Microarray-Folien aus der feuchte Umgebung und blockieren sie über Nacht mit 5 % Milch in PBST, die Oberfläche zu inaktivieren.
   Hinweis: Der bevorzugte Ansatz ist mit einem Ultraschall Nebelmaschine erzeugen einen feinen Nebel blockiert Lösung, die auf der Folie Oberfläche ablagern.
4. Speichern Sie Folien bei-20 ° C in 50 % Glycerin, Einfrieren zu verhindern.

3. Vorbereitung der multivalente Köder-komplexe

Hinweis: Interaktionen zwischen extrazellulären Proteinen zeichnen sich oft durch niedrige Affinitäten. Zur Erkennung dieser Interaktionen zu ermöglichen, durch die Erhöhung der Bindung Avidität, einen multivalente Ansatz basiert auf der Erfassung der Abfrage Proteins, ausgedrückt als Fc-Tags ECD wurde auf Protein A-beschichtete Microbeads entwickelten⁴.

1. Beschriften des Trägers IgG für die Erkennung mit Cy5 Monoreactive Farbstoff eingesetzt und den freien Farbstoff mit Entsalzung Spalten zu trennen. Bestimmen Sie den Farbstoff zu Protein-Verhältnis durch UV Absorption bei 280 bis 650 nm messen.
   Hinweis: Protein-Farbstoff Verhältnisse zwischen 2.0 und 4.0 werden normalerweise verwendet. Es empfiehlt sich, drehen Sie die Cy5 Konjugate bei 100.000 x g für 15 min, potenzielle lösliche Aggregate aufgrund der Kennzeichnung zu entfernen.
2. Bestimmen Sie die optimale Microbead-Protein-Verhältnis durch Titration von Protein A gegen eine konstante Menge des Proteins Abfrage. Minimal ist Sättigung von Perlen, wo keine kostenlosen Fc-markierte Protein bleibt, gemessen mit einem wettbewerbsfähigen Assay durch Biolayer Interferometrie, bestimmt für das Screening verwendet.
3. Bilden Sie das Microbead-Protein-komplexe durch Inkubation der Fc-Tags Abfrage und Cy5-IgG mit Protein A Microbeads und Mischung auf ein Rohr-Rotator mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur vor Licht geschützt werden.
4. Um diese komplexe bilden, verwenden Sie das Abfrage-Protein eine Endkonzentration von 20 μg/mL. Um das molare Verhältnis von Abfrage-Protein und Cy5-IgG zu berechnen, teilen Sie das Molekulargewicht des Abfrage-Proteins durch das Molekulargewicht der IgG (150.000 Da) und multiplizieren Sie mit 40 μg/mL zur Bestimmung der Konzentration von Cy5-IgG benötigt.
5. Ergänzen Sie Proben mit lösliche Protein eine (1 mg/mL) unmittelbar vor der Inkubation mit dem Microarray (siehe Abschnitt 4.2) gleitet nach Bindung von jeder freie Protein A Perlen der Fc Fusionsproteine zu verhindern, die auf das Array vorhanden sein können.
   Hinweis: Die endgültige Reaktionsvolumen variieren je nach der Hybridisierung Station oder Inkubation Kammer genutzt. Die Instrumentation in der Tabelle der Materialien beschrieben können Probe Inkubation mit relativ kleinen Mengen (~ 200 μL pro Folie).

(4) extrazelluläre Protein Microarray Screening und Verarbeitung.

Hinweis: Es gibt eine Reihe von Herstellern, die automatische Verarbeitungsplattformen bereitstellen. Wenn eine Hybridisierung-Station nicht verfügbar ist, können die folgenden Schritte manuell durchgeführt werden, sicherstellen, dass Sie ausreichendes Volumen des Puffers, die Folien halten zu allen Zeiten eingetaucht.

1. Die Folien bei Raumtemperatur erwärmen und Spülen mit PBS/0.1% Tween 20 (PBST), restliche Glycerin vor der Verladung auf die Hybridisierung Station zu entfernen.
2. Verwenden Sie das folgende Screening-Protokoll:
   1. Für 1 min mit PBST waschen.
   2. Laden Sie 200 μL von 1 mg/mL Protein A in PBS/5% Milch und inkubieren Sie für 30 min, Uncomplexed Protein zu verhindern ein Microbeads aus der Bindung an Fc-markierten Proteine, die möglicherweise in der Microarray vorhanden.
   3. Waschen Sie fünf Mal für 1 min mit PBST.
   4. Laden Sie 200 μL der Abfrage: Microbeads Komplex in Anwesenheit von 1 mg/mL Protein A und 30 min inkubieren.
   5. Für 1 min mit PBST waschen.
3. Legen Sie nach Hybridisierung in 50 mL konische Einzelrohre Folien mit Wasser spülen und Trocknen von Spinnen bei 900 X g für 5 min.
4. Schließlich Scannen der Dias mit einem Microarray Scanner angebracht, Cy3 erkennen (Wenn BSA-Cy3 gedruckt wurde) und Cy5 Fluoreszenz durch spannende bei 532 und 635 nm bzw..
5. Datenanalyse mit den begleitenden Microarray-Datenanalyse. Die entsprechenden Array-Liste (als .gal Datei) wird in den Daten-Extraktion-Software geladen. Nutzen Sie in dieser Phase die Cy3-BSA-Spots um Blöcke zu finden und verwenden Sie die Auto-Montage-Optionen in der Software, gefolgt von manuelle Ausrichtung der Funktionen bei Bedarf. Speichern Sie die Dateien als .gpr-Dateien für die weitere Analyse.

(5) Datenanalyse

1. Speichern Sie Daten als GPR-Dateien und einen Prozess mit dem Limma-Paket, allgemein verwendet für die Analyse von Microarray Daten^4,5R.
   1. Für die Vorverarbeitung, Hintergrund-Korrektur und in Folie Normalisierung. Da jedes Protein in doppelte Punkte gedruckt wird, kombinieren Sie beide wiederholte Messungen, um eine einzelne Partitur für das Protein in der Bibliothek zu erstellen.
   2. Berechnen Sie Noten für jede Folie zu und analysieren Sie die Ergebnisse für die Kreuzung von High-scoring Kandidaten zwischen den Folien.
   3. Verwenden Sie doppelte Microarrays aus separaten Auflagen zu steuern für Folie Variabilität und Kreuzung Grundstücke Darstellung von Daten aus beiden Bildschirmen letzten Hits zu nennen.
   4. Schließlich führen Sie ein zusätzliches Maß an Filtern um promiscuous Proteine innerhalb des Arrays auszuschließen. Solche unspezifischen Bindemittel werden identifiziert, wie Proteine, die einen bestimmten Schwellenwert überschreiten Häufigkeit getroffen, als unabhängige Monitoren vom Benutzer definiert.
      Hinweis: Dieses Protokoll ist in Tom Et Al. 2013⁵ausführlich beschrieben. In unserem Fall das unspezifische Bindemittel Aufruf basiert auf der Bestimmung von der kumulativen Beute Trefferquote und eine datenbasierte Beseitigung Schwelle von 5 % verwendet.

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Ergebnisse

Eine schematische Darstellung des Workflows für die extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie ist in Abbildung 1dargestellt. Sobald die Microarray-Folien mit der extrazelluläre Protein-Bibliothek zur Verfügung stehen, kann das Screening des Proteins des Interesses und Datenanalyse innerhalb eines Tages abgeschlossen werden. Viele physiologisch relevante Wechselwirkungen zwischen Membran eingebettet Rezeptoren zeichnen sich durch sehr schwache Bindung ...

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Diskussion

Eine beträchtliche Anzahl von Orphan Rezeptoren bleiben im menschlichen Genom und neuartige interagierenden Partner weiterhin für die extrazellulären Proteine mit bisher charakterisierten Liganden entstehen. Festlegung der Rezeptor-Ligand-Interaktionen in der Human- und Modellorganismen ist wichtig zum Verständnis der Mechanismen, die zelluläre Kommunikation während der Homöostase sowie Dysregulation führt zu Krankheit zu bestimmen, und daher zu informieren, neue oder verbesserte therapeutische Optionen. Erkennun...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultra Pure MB Grade glycerol	USB Corporation	56-81-5	Protein storage
SeptoMark blocking buffer	Zeptosens	BB1, 90-40	Blocking buffer microarray slides
Bovine serum albumin	Roche	03-117-957-001	Slide control for mask fitting (optional)
Polypropylene multiwell plates	Greiner Bio One	82050-678	Protein storage
Polypropylene multiwell plates	Arrayit	MMP384	Slide printing
NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer	Arrayit	NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer	Slide printing
Micro spotting pins	Arrayit	Micro spotting pins	Slide printing
ZeptoFOG blocking station	Zeptosens	ZeptoFOG blocking station, 1210	Block slides after printing
Skim milk powder	Thermo Fisher	LP0031	Blocking solution
Epoxysilane-coated glass slide	Nextrion Slide E	1064016	Microarray slides
Glass holder and slide rack set	Wheaton	900303	Slide storage
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA23031	Albumin labeling
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001	Human IgG labeling
Pro-spin desalting column	Princeton Separations	CS-800	Remove free dye
Adhesive aluminum foil seal	AlumaSeal	F-384-100	Seal stock plates
Polypropylene cryogenic vials	Corning	430658	Master vials for protein library storage
Protein A microbeads	Miltenyi	120-000-396	Query protein multimerization
Human IgG	Jackson Immunoresearch	009-000-003	Irrelevant IgG for labeling
Protein A	Sigma	P7837	Microarray slide blocking
Hybridization station, a-Hyb or similar	Miltenyi	Hybridization station, a-Hyb or similar	Automated microarray processing (optional)
GenePix 4000B scanner or similar	Molecular Devices	GenePix 4000B scanner or similar	Slide scanning
GenePix Pro or equivalent data extraction software	Molecular Devices	GenePix Pro or equivalent data extraction software	Data processing
Signal P4.1	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	online software	Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites
TMHMM 2.0 server	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	online software	Prediction of transmembrane helices in proteins
Phobius	Stockholm Bioinformatics Center	online software	A combined transmembrane topology and signal peptide predictor
TOPCONS	Stockholm University	online software	Prediction of membrane topology and signal peptides