Tecnologia di Microarray di proteina extracellulare per il rilevamento di Throughput elevato di interazioni recettore-ligando bassa affinità

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo di microarrays della proteina extracellulare dello schermo per l'identificazione delle interazioni recettore-ligando romanzo in elevato throughput. Inoltre descriviamo un metodo per migliorare la rilevazione delle interazioni proteina-proteina transitoria utilizzando complessi proteina-Microperlina.

Abstract

Fattori secreti, recettori di membrana-tethered e loro interattori sono regolatori principali di comunicazione cellulare e l'inizio della cascata di segnalazione durante l'omeostasi e la malattia e come tali rappresentano bersagli terapeutici privilegiate. Nonostante la loro rilevanza, queste reti di interazione rimangono notevolmente sottorappresentate nei database correnti; di conseguenza, più proteine extracellulari non hanno documentato associazione partner. Questa discrepanza è principalmente dovuto le sfide connesse con lo studio delle proteine extracellulari, compreso l'espressione di proteine funzionali e la debole, bassa affinità, interazioni della proteina spesso stabiliti tra recettori di superficie. Lo scopo di questo metodo è di descrivere la stampa di una libreria di proteine extracellulari in un formato di microarray per lo screening delle interazioni proteina-proteina. Per attivare il rilevamento delle interazioni deboli, è descritto un metodo basato sul multimerization della proteina query in fase di studio. Accoppiato a questo approccio basato su Microperlina multimerization per maggiore multivalenza, il microarray di proteine permette di rilevamento affidabile delle interazioni proteina-proteina transitoria in elevato throughput. Questo metodo offre un campione rapidi e a basso consumo-approccio per l'identificazione di nuove interazioni applicabile a qualsiasi proteina extracellulare. Stampa di microarray della proteina ed il protocollo di screening sono descritti. Questa tecnologia sarà utile per gli investigatori che cercano un metodo affidabile per la scoperta delle interazioni della proteina nello spazio extracellulare.

Introduzione

Il metodo Recensito qui descrive la stampa di un insieme di proteine extracellulari in un formato di microarray, seguita da un metodo per lo screening di un target di interesse nei confronti di questa libreria. Abbiamo identificato multimerization proteina come un passo fondamentale per il rilevamento delle interazioni caratterizzate da affinità di legame basso. Per migliorare la rilevazione di queste interazioni, descriviamo un protocollo basato su multimerization della proteina di interesse utilizzando microsfere query.

Secreto e superficie-espresse proteine della cellula (collettivamente denominate proteine extracellulari) insieme ai loro partner interagenti sono regolatori chiave della comunicazione cellulare, di segnalazione e di interazione con il microambiente. Essi sono, pertanto, essenziale nella regolazione di molti processi fisiologici e patologici. Circa un quarto del genoma umano (≈5, 000 proteine) codifica per proteine extracellulari, che, dato il loro significato e accessibilità ai farmaci sistematicamente consegnati, rappresentano obiettivi chiave per droga sviluppo¹. Di conseguenza, proteine extracellulari rappresentano oltre il 70% degli obiettivi della proteina con azione farmacologica nota per farmaci approvati sul mercato, conosciuto come il "proteoma trattabili". Nonostante la loro importanza e l'abbondanza, le reti di interazione (ePPI) extracellulare della proteina-proteina rimangono notevolmente sottorappresentate nei database disponibili. Questo è fondamentalmente a causa della natura complessa biochimica delle proteine extracellulari, che preclude loro caratterizzazione utilizzando tecnologie più disponibile². In primo luogo, le proteine di membrana sono difficili da solubilizzare, un processo che coinvolge spesso condizioni di lavaggio difficili e detergenti; in secondo luogo, le proteine extracellulari spesso mancano rilevanti modificazioni post-traduzionali come glicosilazione che sono assenti quando queste proteine sono espresse in comunemente utilizzati sistemi eterologhi. Infine, interazioni tra recettori, quali co-recettori espressi sulle cellule immuni, sono spesso transitori e caratterizzate da bassissima affinità (K_D nel μM ~ 1 a > 100 gamma μM). Complessivamente, la natura di queste proteine e la loro associazione partner di rendering più ampiamente utilizzate tecnologie quali la spettrometria di massa/purificazione di affinità (AP/MS) o lievito-due-ibrido, inadatto per il rilevamento delle interazioni nello spazio extracellulare ^{2 , 3}.

Nel tentativo di superare queste sfide tecniche e accelerare la scoperta di nuove interazioni per proteine extracellulari, abbiamo sviluppato una copertura alta proteina extracellulare microarray^4,5. I microarrays offrono il vantaggio di generare superfici ad alta densità con piccole quantità di campione e sono generalmente favorevoli agli studi elevato throughput. Studi basati su microarray di proteine precedentemente hanno fornito le comprensioni pertinenti in interazioni proteina per diversi organismi di modello, pur concentrandosi principalmente su interazioni citosolici o proteina specifica famiglie^{6,7, 8}. Al contrario, limitati del lavoro è stato fatto per indagare le interazioni proteina extracellulare utilizzando questa tecnologia. Abbiamo sviluppato un metodo di microarray della proteina per attivare studi di ePPIs con la costruzione di una biblioteca completa e altamente diversificata di proteine secrete purificate e singola transmembrana (STM) recettori espressi come ricombinante domini extracellulari (ECD) fusi a comune tag per purificazione di affinità⁴. Il successo delle schermate di microarray di proteine si basa molto sull'istituzione di una biblioteca di proteine di alta qualità. Per l'espressione della proteina la biblioteca e la query, cellule di mammiferi o cellule di insetto preferenzialmente furono scelti come sistemi di espressione eterologa, per garantire la corretta aggiunta di modifiche post-traduzionali quali obbligazioni glicosilazione o bisolfuro. SDS-PAGE, cromatografia di esclusione di formato e diffusione della luce laser multi-angolo sono tecniche comunemente utilizzate per valutare la qualità delle proteine ricombinanti. La libreria di proteina è quindi individuata sui vetrini epoxysilane e conservata a-20 ° C per uso a lungo termine. Le concentrazioni di proteina di sopra di 0,4 mg/mL sono raccomandate per il protocollo descritto di seguito. Pertanto, basso-esprimere proteine possono richiedere un passaggio di concentrazione prima della stampa del campione e deposito. Tuttavia, un vantaggio principale di questa tecnica è la bassa quantità di proteina necessaria (50 μg di proteina è sufficiente effettuare > 2.000 schermi), al fianco di consumo di proteine minimo query (20-25 μg / schermo duplicati). Utilizzando il protocollo e le apparecchiature descritte qui, e purché le librerie siano disponibili, possono essere generati risultati per proteine singole query entro un giorno lavorativo.

Una sfida importante nella rilevazione di interazioni della proteina nell'ambiente extracellulare nasce dalla loro natura tipicamente transitoria o debole, che preclude l'identificazione di metodologie più comunemente utilizzati. Aumentando notevolmente l'avidità di legame, migliora la sensibilità per la rilevazione di proteine deboli interazioni^9,10,11. Basato su questo principio abbiamo sviluppato un metodo per multimerize le proteine di query (espresse come fusione Fc) utilizzando proteine perline rivestite su A^4,5. Per evitare qualsiasi potenziale inattivazione della proteina query di contrassegno casuale, abbiamo invece etichettare un'immunoglobulina umana irrilevante G con Cy5 e aggiungerlo insieme con la proteina di query per le perle di proteina A, eliminando così eventuali artefatti a causa la coniugazione diretta di un colorante per la proteina di interesse. Dato le affinità micromolari di diverse coppie di co-recettore, i complessi multivalenti migliorare notevolmente il rapporto segnale-rumore, rispetto alle proteine di query Fc-fusione proiettati come proteine solubili⁴.

In sintesi, l'obiettivo del presente protocollo è di descrivere la preparazione dei vetrini di microarray contenente una libreria di proteina extracellulare pre-esistenti per l'identificazione delle interazioni recettore-ligando. Esaminiamo i passaggi per slide stampa, seguita da un protocollo per lo screening di una proteina di interesse contro la libreria di proteina extracellulare. Inoltre, descriviamo un metodo per migliorare il rilevamento di ePPIs basato su microsfere per raggiungere una maggiore avidità della proteina in esame. La tecnologia di microarray della proteina extracellulare qui descritta rappresenta un approccio veloce, affidabile ed efficace per lo screening e la rilevazione ePPI romanzo con bassi rapporti di falsi positivi e utilizzando solo quantità di microgrammo della proteina query sotto indagine. Questa tecnologia ha alimentato gli studi multipli che hanno fornito le comprensioni pertinenti in funzioni cellulari precedentemente sconosciute e vie di segnalazione per una varietà di recettori^12,13, inclusi virali immunoregulators¹⁴, e possono essere utilizzate per-orphanize qualsiasi extracellulare della proteina di interesse.

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Protocollo

1. generazione di una libreria di proteine umane extracellulare

1. Compilare un elenco di recettori di superficie o proteine secrete di interesse per generare la libreria di microarray della proteina. Le famiglie di proteine specifiche (ad esempio, superfamiglia delle immunoglobuline) o proteine selettivamente espresso in particolare cella tipi possono essere selezionati per lo studio.
2. Per recettori di superficie, è necessario determinare i limiti del dominio extracellulare (ECD) identificando il peptide segnale e regioni transmembrane utilizzando strumenti software. Alcuni dei pertinenti strumenti, disponibile gratuitamente on-line, si fa riferimento nella Tabella materiali^15,16,17,18.
3. Sintetizzare l'ECD per i geni di interesse e clone nel vettore pertinente. Proteine secrete o i recettori di ECD di STM fusi ad un numero di tag comuni affinità possono essere purificati da media condizionati delle cellule transfected con il vettore appropriato o da sistemi di espressione di baculovirus-insetto cella.
   Nota: Sistemi basati su cellule mammiferi (ad esempio HEK/293 o cellule CHO) sono raccomandati per massimizzare la probabilità di corretto folding e aggiunta di rilevanti modifiche di posttranslational come glicosilazione.
4. Purificare le proteine con metodi di purificazione di affinità standard. Gli sforzi precedenti hanno descritto le procedure automatiche o semi-automatiche adatte per purificazione di centinaia di proteine, che possono essere scalate per generare l'insieme delle proteine di interesse^{9,19,20, 21}.
   Nota: SDS-PAGE, cromatografia di esclusione di formato (S) o multi-angolo laser light scattering (centri commerciali) si raccomanda di valutare qualsiasi aggregazione non-covalente e di controllo per la qualità complessiva delle preparazioni della proteina.
5. Proteine a 200 o 400 μg/mL quando possibile, di regolare e diluire scorte con 80% glicerolo per immagazzinaggio a lungo termine in fiale criogeniche a-20 ° C. Questi rappresentano gli stock master e devono essere accessibili solo quando necessario.
6. Trasferire le aliquote di ogni proteina (100 μL) per piastre da 96 pozzetti (magazzino Piastre), sigillare con pellicola adesiva e conservare a-20 ° C fino alla preparazione del vetrino di microarray. Piastre di magazzino vengono generati per ridurre i cicli di gelo-disgelo e garantire stabilità proteica.

2. extracellulare della proteina Microarray stampa

1. Utilizzare un microarrayer standard per la stampa di diapositive. Lo strumento utilizzato per il protocollo descritto qui ha una capacità di 57 diapositive/Esegui e utilizza una testina di stampa che tiene 48 perni spotting. Questi perni generare macchie di ~ 100 μm di diametro separati da una distanza di spot a spot di ~ 350 μm e disegna 0.25 μL per carico. In questa configurazione, si può ospitare fino a 8.000 punti per ogni diapositiva.
2. Generare lavoro piastre (384 pozzetti, 10 μL di campione/pozzetto) dalle piastre stock. Eseguire questa operazione manualmente prima della stampa di diapositive utilizzando il microarrayer. Quindi, individuare proteine con perni spotting quill-tipo sui vetrini epoxysilane al 60% di umidità (per prevenire la disidratazione dei punti della proteina).
   Nota: Cy3-labeled albumina di siero bovino (BSA) può essere individuato in duplicati tra ogni campione di proteina (5 μg/mL nei PBS/40% glicerolo) per visualizzare la matrice per maschera montaggio (Vedi sezione 4). Sebbene sia consigliato, questo passaggio è facoltativo.
3. A seguito di stampa, rimuovere le diapositive di microarray della proteina dall'ambiente umidificato e bloccarli durante la notte con 5% di latte in PBST per inattivare la superficie.
   Nota: L'approccio consigliato è utilizzare un nebulizzatore ad ultrasuoni per generare una foschia fine di bloccare la soluzione che si deposita sulla superficie del vetrino.
4. Conservare gli scivoli a-20 ° C in glicerolo al 50% per evitare il congelamento.

3. preparazione di complessi multivalenti esca

Nota: Interazioni tra proteine extracellulari sono spesso caratterizzate da bassa affinità. Per abilitare il rilevamento di queste interazioni aumentando avidità di legame, un approccio multivalente basato sulla cattura la proteina query, espressa come Fc-etichetta ECD, era sviluppato⁴proteina rivestite con A microsfere.

1. Etichettare il vettore utilizzato per il rilevamento con Cy5 monoreactive colorante IgG e separare il colorante libero utilizzo di colonne di dissalazione. Determinare la tintura ai rapporti di proteina misurando ultravioletta assorbanza a 280 e 650 nm.
   Nota: I rapporti di proteina-tintura tra 2.0 e 4.0 sono normalmente utilizzati. Si raccomanda di far girare i coniugati di Cy5 a 100.000 x g per 15 min rimuovere potenziali aggregati solubili a causa del processo di etichettatura.
2. Determinare il rapporto ottimale della microperla / proteine mediante titolazione di proteina A contro una quantità costante della proteina di query. Il volume minimo saturante di perline dove nessuna proteina Fc-etichetta libera rimane, come misurato usando un'analisi competitiva determinata dalla biolayer interferometria, è usato per lo screening.
3. Formare i complessi della microperla-proteina incubando la query Fc-etichettate e Cy5-IgG con proteina A microsfere e mescolare in un rotatore del tubo in PBS per 30 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
4. Per formare questi complessi, è possibile utilizzare la proteina query ad una concentrazione finale di 20 μg/mL. Per calcolare il rapporto molare della proteina query e Cy5-IgG, dividere il peso molecolare della proteina query dal peso molecolare del IgG (Da 150.000) e moltiplicare per 40 μg/mL per determinare la concentrazione di Cy5-IgG necessari.
5. Supplemento campioni con proteina solubile A (1 mg/mL), immediatamente prima dell'incubazione con il microarray diapositive (vedere sezione 4.2) per impedire l'associazione di qualsiasi proteina libera A perline per le proteine di fusione Fc che possono essere presenti nell'array.
   Nota: Il volume di reazione finale variano a seconda della camera di ibridazione stazione o incubazione utilizzata. La strumentazione descritta in Tabella materiali permette di incubazione del campione usando i volumi relativamente piccole (~ 200 µ l per vetrino).

4. extracellulare della proteina Microarray di Screening e di elaborazione.

Nota: Ci sono un numero di produttori che offrono piattaforme di elaborazione automatica. Se una stazione di ibridazione non è disponibile, la procedura seguente può essere eseguita manualmente, assicurando che ci sia un volume sufficiente di tampone per mantenere le diapositive sommersa in ogni momento.

1. Scaldare i vetrini a temperatura ambiente e sciacquare con PBS/0.1% Tween 20 (PBST) per rimuovere il residuo glicerolo prima del caricamento sulla stazione di ibridazione.
2. Utilizzare il seguente protocollo di screening:
   1. Lavare con PBST per 1 min.
   2. Caricare 200 μL di proteina di 1 mg/mL A in PBS/5% latte e incubare per 30 min evitare uncomplexed proteina un microsfere di legarsi alle proteine Fc-Tag che possono essere presenti nel microarray.
   3. Lavare 5 volte con PBST per 1 min.
   4. Caricare 200 μL di query: microsfere di complesse in presenza di proteina di 1 mg/mL A ed incubare per 30 min.
   5. Lavare con PBST per 1 min.
3. Dopo l'ibridazione, sciacquare i vetrini con acqua, posto in singole provette coniche da 50 mL e a secco di filatura a 900 x g per 5 min.
4. Infine, la scansione le diapositive con un microarray scanner appropriato per rilevare Cy3 (se è stato stampato BSA-Cy3) e Cy5 fluorescenza eccitando a 532 e 635 nm, rispettivamente.
5. Eseguire analisi di dati utilizzando l'analisi di dati di microarray accompagnamento. L'elenco di matrice pertinente (come file. GAL) viene caricato nel software di estrazione dati. In questa fase, è necessario utilizzare i punti di Cy3-BSA per trovare blocchi e utilizzare le opzioni di adattamento automatico del software, seguita da allineamento manuale delle caratteristiche quando necessario. Salvare i file come file di .gpr per ulteriori analisi.

5. analisi dei dati

1. Salvare i dati come file GPR e processo in R utilizzando il pacchetto limma, comunemente utilizzato per l'analisi di microarray dati^4,5.
   1. Per la pre-elaborazione, sfondo correzione e normalizzazione all'interno della diapositiva. Poiché ogni proteina è stampata in punti duplicati, combinare entrambi replicando la determinazione per creare un unico punteggio per quella proteina nella libreria.
   2. Calcolare i punteggi per ogni diapositiva e analizzare i risultati per l'intersezione dei candidati ad alto punteggio tra le diapositive.
   3. Utilizzare microarray duplicati da stampa-cicli separati per controllo per variabilità di diapositiva e trame di intersezione che rappresenta dati di entrambi gli schermi per chiamare hits finale.
   4. Infine, eseguire un ulteriore livello di filtraggio per escludere promiscue proteine all'interno della matrice. Tali leganti non specifici sono identificati come proteine superiore a una soglia specifica frequenza di accessi come definito dall'utente attraverso schermi indipendenti.
      Nota: Questo protocollo è descritto in dettaglio in Tom et al 2013⁵. Nel nostro caso il raccoglitore non specifica chiamata si basa sulla determinazione del cumulativo preda tasso di successo, e viene utilizzata una soglia di eliminazione basate sui dati del 5%.

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Risultati

Uno schema del flusso di lavoro per la tecnologia di microarray della proteina extracellulare è illustrato nella Figura 1. Una volta che le diapositive di microarray contenente la libreria di proteina extracellulare sono disponibili, lo screening della proteina di interesse e analisi dei dati può essere completato entro un giorno. Fisiologicamente rilevanti molte interazioni tra recettori di membrana incorporato sono caratterizzati da punti di forza molto d...

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Discussione

Un numero significativo di recettori orfani rimanga nel genoma umano, e nuovi interattori continuano ad emergere per proteine extracellulari con ligandi precedentemente caratterizzati. Definizione delle interazioni recettore-ligando in umani e organismi modello è essenziale per comprendere i meccanismi che determinano la comunicazione cellulare durante l'omeostasi, come pure la disregolazione che conducono alla malattia e quindi informare nuovi o migliorati opzioni terapeutiche. Tuttavia, rilevamento delle interazioni p...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultra Pure MB Grade glycerol	USB Corporation	56-81-5	Protein storage
SeptoMark blocking buffer	Zeptosens	BB1, 90-40	Blocking buffer microarray slides
Bovine serum albumin	Roche	03-117-957-001	Slide control for mask fitting (optional)
Polypropylene multiwell plates	Greiner Bio One	82050-678	Protein storage
Polypropylene multiwell plates	Arrayit	MMP384	Slide printing
NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer	Arrayit	NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer	Slide printing
Micro spotting pins	Arrayit	Micro spotting pins	Slide printing
ZeptoFOG blocking station	Zeptosens	ZeptoFOG blocking station, 1210	Block slides after printing
Skim milk powder	Thermo Fisher	LP0031	Blocking solution
Epoxysilane-coated glass slide	Nextrion Slide E	1064016	Microarray slides
Glass holder and slide rack set	Wheaton	900303	Slide storage
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA23031	Albumin labeling
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001	Human IgG labeling
Pro-spin desalting column	Princeton Separations	CS-800	Remove free dye
Adhesive aluminum foil seal	AlumaSeal	F-384-100	Seal stock plates
Polypropylene cryogenic vials	Corning	430658	Master vials for protein library storage
Protein A microbeads	Miltenyi	120-000-396	Query protein multimerization
Human IgG	Jackson Immunoresearch	009-000-003	Irrelevant IgG for labeling
Protein A	Sigma	P7837	Microarray slide blocking
Hybridization station, a-Hyb or similar	Miltenyi	Hybridization station, a-Hyb or similar	Automated microarray processing (optional)
GenePix 4000B scanner or similar	Molecular Devices	GenePix 4000B scanner or similar	Slide scanning
GenePix Pro or equivalent data extraction software	Molecular Devices	GenePix Pro or equivalent data extraction software	Data processing
Signal P4.1	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	online software	Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites
TMHMM 2.0 server	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	online software	Prediction of transmembrane helices in proteins
Phobius	Stockholm Bioinformatics Center	online software	A combined transmembrane topology and signal peptide predictor
TOPCONS	Stockholm University	online software	Prediction of membrane topology and signal peptides