Tecnologia de Microarray da proteína extracelular para a deteção de alta taxa de transferência de interações ligante-Receptor de baixa afinidade

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para tela extracelular da proteína microarrays para identificação de interações ligante-receptor romance em alta taxa de transferência. Também descrevemos um método para realçar a deteção de interações da proteína-proteína transiente usando complexos proteína-Microconta.

Resumo

Fatores secretados, receptores de membrana-amarrados e seus parceiros de interação são os principais reguladores da comunicação celular e início de cascatas de sinalização durante a homeostase e a doença e como tal representam alvos terapêuticos. Apesar de sua relevância, estas redes de interação permanecem significativamente sub-representados em bancos de dados atuais; Portanto, mais proteínas extracelulares não tem nenhum parceiro de vinculação documentada. Esta discrepância deve-se principalmente os desafios associados com o estudo das proteínas extracelulares, incluindo a expressão de proteínas funcionais e a fraca, baixa afinidade, interações proteína frequentemente estabelecidas entre receptores de superfície celular. A finalidade desse método é descrever a impressão de uma biblioteca de proteínas extracelulares em um formato de microarray para rastreio de interações da proteína-proteína. Para habilitar a detecção de interações fracas, é descrito um método baseado na multimerization da proteína consulta sob estudo. Acoplado a essa abordagem baseada em Microconta multimerization para multivalency de aumento, o microarray da proteína permite a detecção robusta de interações da proteína-proteína transitória em alta taxa de transferência. Este método oferece uma amostra rápida e baixo consumo-abordagem para identificação de novas interações aplicáveis para qualquer proteína extracelular. Impressão de microarray de proteína e protocolo de triagem são descritos. Esta tecnologia será útil para os investigadores procuram um método robusto para descoberta de interações da proteína no espaço extracelular.

Introdução

O método aqui analisado descreve a impressão de uma coleção de proteínas extracelulares em um formato de microarray, seguido por um método para a seleção de um alvo de interesse com esta biblioteca. Nós identificamos proteínas multimerization como um passo crucial para a deteção de interações caracterizada por afinidades de ligação baixa. Para realçar a deteção dessas interações, descrevemos um protocolo baseado em multimerization da proteína de interesse usando microbeads consulta.

Segregada e célula superfície-expresso proteínas (coletivamente denominadas proteínas extracelulares) juntamente com seus parceiros de interação são reguladores chaves da comunicação celular, sinalização e interação com o microambiente. Eles são, portanto, essenciais na regulação de muitos processos fisiológicos e patológicos. Aproximadamente um quarto do genoma humano (≈5, 000 proteínas) codifica para proteínas extracelulares, que, dado o seu significado e acessibilidade às drogas sistematicamente entregues, representam os principais alvos para o desenvolvimento de drogas¹. Consequentemente, as proteínas extracellular representam mais de 70% das metas de proteína com ação farmacológica conhecido por drogas aprovadas no mercado, conhecido como o "proteome druggable". Apesar da sua importância e abundância, as redes de interação (ePPI) da proteína-proteína extracelular permanecem notavelmente sub-representados nos bancos de dados disponíveis. Isto é, fundamentalmente, devido à natureza complexa bioquímica das proteínas extracelulares, que impede a sua caracterização usando mais disponíveis tecnologias². Em primeiro lugar, as proteínas de membrana são difíceis de solubilizar, um processo que muitas vezes envolve lavagem duras condições e detergentes; em segundo lugar, as proteínas extracellular faltam frequentemente relevantes modificações borne-translational como glicosilação que estão ausentes quando estas proteínas são expressas em comumente utilizados sistemas heterólogos. Finalmente, interações entre receptores, tais como co receptores expressados em células do sistema imunológico, são muitas vezes transitórios e caracterizada por afinidades muito baixas (K_D no ~ 1 μM para > intervalo de 100 μM). No total, a natureza destas proteínas e sua vinculação parceiros processam mais amplamente utilizadas tecnologias, tais como espectrometria de massa/purificação de afinidade (AP/MS) ou fermento-dois-híbrido, impróprio para a deteção das interações no espaço extracelular ^{2 , 3}.

Em um esforço para superar esses desafios técnicos e acelerar a descoberta de novas interações para proteínas extracelulares, desenvolvemos uma cobertura alta proteína extracelular microarray^4,5. Microarrays oferecem a vantagem de gerar superfícies de alta densidade com pequenas quantidades de amostra e são geralmente favoráveis aos estudos de alto rendimento. Proteína microarray baseado em estudos anteriormente forneceu insights relevantes sobre interações da proteína por vários organismos-modelo, embora concentrando-se principalmente no citosol interações ou na proteína específica famílias^{6,7, 8}. Em contraste, limitado de trabalho tem sido feito para investigar interações de proteínas extracelulares usando esta tecnologia. Nós desenvolvemos um método de microarray da proteína para permitir estudos de ePPIs através da construção de uma biblioteca abrangente e altamente diversa de proteínas purified segregadas e único receptores transmembranares de (STM) expressaram como recombinação domínios extracelulares (ECD) fundidos a tags comuns para afinidade purificação⁴. O sucesso das telas do microarray da proteína baseia-se fortemente sobre a criação de uma biblioteca de proteína de alta qualidade. Para a expressão da proteína de biblioteca e consulta, nas células de mamíferos ou insetos foram preferencialmente escolhidos como sistemas de expressão heteróloga, para garantir a adequada adição de modificações borne-translational como glicosilação ou dissulfureto de títulos. SDS-PAGE, cromatografia de exclusão e espalhamento de luz laser de multi-ângulo são técnicas comumente utilizadas para avaliar a qualidade da proteína recombinante. A biblioteca de proteína é então manchada em epoxysilane slides e armazenada a-20 ° C para uso a longo prazo. As concentrações de proteína acima de 0,4 mg/mL são recomendadas para o protocolo descrito abaixo. Portanto, baixa-expressando proteínas podem exigir uma etapa de concentração antes da impressão de amostra e armazenamento. No entanto, a principal vantagem desta técnica é o pequeno volume de proteína necessária (50 μg de proteína é suficiente para executar > 2.000 telas), juntamente com o consumo de proteína de consulta mínima (20-25 μg por tela de duplicatas). Usando o protocolo e o equipamento descrito aqui, e desde que as bibliotecas estão disponíveis, resultados para proteínas de consultas individuais podem ser gerados dentro de um dia de trabalho.

Um grande desafio na detecção de interações da proteína no meio extracelular decorre sua natureza caracteristicamente fraca ou transitória, que impede a identificação por metodologias mais comumente usadas. A avidez de vinculação a aumentar grandemente melhora a sensibilidade para a deteção de proteínas fracas interações^9,10,11. Baseado neste princípio que desenvolvemos um método para multimerize as proteínas de consulta (expressadas como fusão Fc) usando a proteína grânulos revestidos A^4,5. Para evitar qualquer potencial inactivação da proteína consulta pela rotulagem aleatória, nós em vez disso rotular uma irrelevante a imunoglobulina humana G com Cy5 e adicioná-lo juntamente com a proteína de consulta para os grânulos de proteína A, eliminando assim qualquer artefatos devido a conjugação direta de um tintura à proteína de interesse. Tendo em conta as afinidades micromolar de vários pares de co do receptor, os complexos multivalentes aumentar consideravelmente o sinal à relação de ruído, em comparação com proteínas da consulta Fc-fusão selecionadas como proteínas solúveis⁴.

Em resumo, o objetivo do presente protocolo é descrever a preparação de microarray slides contendo uma biblioteca de proteína extracelular pré-existentes para identificação de interações ligante-receptor. Revemos as etapas para slide, impressão, seguido por um protocolo para a seleção de uma proteína de interesse contra a biblioteca de proteína extracelular. Além disso, descrevemos um método para a detecção avançada de ePPIs baseada microbeads para alcançar maior avidez da proteína em estudo. A tecnologia de microarray de proteína extracelular descrita aqui representa uma abordagem rápida, robusta e eficaz para a seleção e detectando ePPI romance com baixos índices de falso-positivos e utilizando apenas as quantidades de microgramas da proteína sob consulta investigação. Esta tecnologia tem alimentado vários estudos que forneceram insights relevantes sobre previamente desconhecida de funções celulares e vias de sinalização para uma variedade de receptores^12,13, incluindo immunoregulators viral¹⁴, e pode ser utilizado para orphanize de qualquer extracelular da proteína de interesse.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. geração de uma biblioteca de proteínas humanas extracelulares

1. Compile uma lista de receptores de superfície celular ou proteínas secretadas de interesse para criar a biblioteca de microarray de proteína. Famílias de proteínas específicas (por exemplo, a superfamília das imunoglobulinas) ou proteínas seletivamente expressaram em particular célula tipos que podem ser selecionados para o estudo.
2. Para receptores de superfície celular, determine os limites do domínio extracelular (ECD), identificando o peptídeo sinal e regiões transmembranares, usando ferramentas de software. Alguns dos relevantes ferramentas, disponível gratuitamente online, são referenciados na Tabela de materiais^15,16,17,18.
3. Sintetiza a ECD para os genes de interesse e clone para o vector relevante. Proteínas secretadas ou os receptores de ECD do STM fundidos a um número de marcas de afinidade comum podem ser purificados da mídia condicionada de células transfectadas com o vetor apropriado, ou de sistemas de expressão de células de baculovirus-inseto.
   Nota: Sistemas de baseados em células mamíferos (como HEK/293 ou células CHO) são recomendados para maximizar a probabilidade do enovelamento de proteínas adequada e adição de relevantes modificações posttranslational como glicosilação.
4. Purifica as proteínas através de métodos de purificação da afinidade padrão. Esforços anteriores descreveram automatizados ou semi-automatizadas procedimentos adequados para a purificação de centenas de proteínas, que podem ser escaladas para gerar o conjunto de proteínas de interesse^{9,19,20, 21}.
   Nota: SDS-PAGE, cromatografia de exclusão (S) ou multi-ângulo laser luz espalhamento (shoppings) são recomendados para avaliar qualquer agregação não-covalente e controle para a qualidade geral de preparações de proteína.
5. Ajustar as proteínas para 200 ou 400 μg/mL, sempre que possível e diluir as existências com 80% de glicerol para armazenamento a longo prazo em frascos criogênicos, a-20 ° C. Estas representam estoques mestre e devem ser acessadas somente quando necessário.
6. Transferir alíquotas de cada proteína (100 μL) para placas de 96 poços (estoque chapas), selar com folha adesiva e armazenar a-20 ° C até preparação de corrediça microarray. Placas de estoque são geradas para minimizar os ciclos de congelamento e descongelamento e garantir a estabilidade da proteína.

2. extracelular da proteína Microarray impressão

1. Use um padrão microarrayer para impressão de slide. O instrumento utilizado para o protocolo descrito aqui tem uma capacidade de 57 slides/executar e usa uma cabeça de impressão segurando 48 pinos spotting. Esses pinos geram manchas de ~ 100 μm de diâmetro separados por uma distância ponto-a-ponto ~ 350 μm e desenha 0.25 μL por carga. Sob esta configuração, até 8.000 pontos por slide pode ser acomodado.
2. Gere trabalho placas (384 placas bem, amostra de 10 μL/poço) as chapas em estoque. Execute esta etapa manualmente antes da impressão de slide usando o microarrayer. Em seguida, detectar proteínas com pinos de spotting quill-tipo sobre guias de epoxysilane em 60% de umidade (para evitar desidratação dos spots de proteína).
   Nota: Cy3-rotulado albumina de soro bovino (BSA) pode ser vista em duplicatas entre cada amostra de proteína (5 μg/mL de glicerol PBS/40%) para visualizar a matriz de máscara montagem (ver secção 4). Embora seja recomendado, este passo é opcional.
3. Após a impressão, remover os slides de microarray da proteína do ambiente umidificado e bloqueá-los durante a noite com 5% de leite em PBST para inactivar a superfície.
   Nota: A melhor abordagem é usar um nebulizador ultra-sônico para gerar uma névoa fina de bloqueio solução que liquida até a superfície do slide.
4. Armazenar slides a-20 º C em glicerol 50% para evitar o congelamento.

3. preparação dos complexos de isca multivalentes

Nota: Interações entre proteínas extracelulares são frequentemente caracterizadas por baixas afinidades. Para habilitar a detecção dessas interações, aumentando a avidez de vinculação, uma abordagem multivalentes baseada na captura da proteína de consulta, expressada como Fc-com a tag ECD, na proteína revestido A microbeads foi desenvolvido⁴.

1. Rotular a transportadora IgG usado para detecção com Cy5 monoreactive corante e separar o corante livre usando colunas do desalting. Determine o corante para rácios de proteína através da medição ultravioleta absorbância em 280 e 650 nm.
   Nota: Rácios de proteína-tintura entre 2.0 e 4.0 são normalmente utilizados. Recomenda-se girar os Cy5 conjugados a 100.000 x g durante 15 min remover potenciais agregados solúveis devido ao processo de rotulagem.
2. Determine a relação de Microconta-a-proteína ideal por titulação de proteína A contra uma quantidade constante de proteína a consulta. O volume mínimo de impregnação dos grânulos, onde permanece sem proteína livre Fc-marcados, como medido usando um ensaio competitivo determinado pela interferometria de biolayer, é usado para o rastreio.
3. Formam os complexos de Microconta-proteína incubando a consulta Fc-tag e Cy5-IgG com proteína A microbeads e mistura em rotacao tubo em PBS por 30 min em temperatura ambiente protegida da luz.
4. Para formar estes complexos, use a proteína de consulta em uma concentração final de 20 μg/mL. Para calcular a proporção molar da proteína de consulta e Cy5-IgG, dividir o peso molecular da proteína consulta pelo peso molecular do IgG (150.000 Da) e multiplique por 40 μg/mL para determinar a concentração de IgG-Cy5 necessário.
5. Suplemento de amostras com uma (1 mg/mL), imediatamente antes da incubação com o microarray slides (ver seção 4.2 abaixo) para impedir a ligação de qualquer proteína livre A contas para as proteínas de fusão de Fc que podem estar presentes na matriz de proteína solúvel.
   Nota: O volume final da reação pode variar dependendo da câmara de estação ou incubação de hibridação utilizada. A instrumentação descrita na Tabela de materiais permite a incubação de amostra usando volumes relativamente pequenos (~ 200 μL por slide).

4. extracelular da proteína Microarray, triagem e processamento.

Nota: Há um número de fabricantes que oferecem plataformas de processamento automático. Se não houver uma estação de hibridação, as seguintes etapas podem ser executadas manualmente, garantir que não há volume suficiente de buffer para manter os slides submerso em todos os momentos.

1. Aquecer as lâminas à temperatura ambiente e enxágue com PBS/0.1% Tween 20 (PBST) para remover o glicerol residual antes do embarque para a estação de hibridação.
2. Use o seguinte protocolo de triagem:
   1. Lavar com PBST por 1 min.
   2. Carregar 200 μL de proteína 1 mg/mL A PBS/5% leite e incube por 30 min evitar uncomplexed proteína um microbeads de ligação às proteínas Fc-marcados que podem estar presentes no microarray.
   3. Lave cinco vezes com PBST por 1 min.
   4. Carregar 200 μL de consulta: microbeads complexa na presença de proteína 1 mg/mL A e incube por 30 min.
   5. Lavar com PBST por 1 min.
3. Após a hibridização, slides com água de enxágue, coloque em tubos cónicos individuais de 50 mL e secar por girar a 900 x g por 5 min.
4. Finalmente, digitalizar slides com um microarray scanner apropriado para detectar Cy3 (se foi impresso BSA-Cy3) e Cy5 fluorescência excitando a 532 e 635 nm, respectivamente.
5. Realizar análise de dados utilizando a análise de dados microarray que acompanha. A lista de matriz relevantes (como um arquivo de .gal) é carregada no software de extração de dados. Nesta fase, utilize os pontos de Cy3-BSA para encontrar blocos e usar as opções de ajuste automático do software, seguido de alinhamento manual dos recursos quando necessário. Salve arquivos como arquivos de .gpr para posterior análise.

5. análise de dados

1. Salve dados como arquivos GPR e processo em R usando o pacote se, comumente utilizado para a análise de dados de microarray^4,5.
   1. Para pré-processamento, fundo de correção e normalização dentro do slide. Desde que cada proteína é impresso em duplicado spots, combine as duas medições replicar para criar um resultado individual para essa proteína na biblioteca.
   2. Partituras para cada slide de calcular e analisar os resultados para a interseção de alta pontuação candidatos entre os slides.
   3. Use microarrays duplicados de impressão-executa separado para controle variabilidade slide e usar parcelas de interseção que representa dados de ambas as telas para chamar os últimos chutos.
   4. Finalmente, execute um nível adicional de filtragem para excluir promíscuas proteínas dentro da matriz. Tais ligantes não-específicos são identificados como proteínas superior a um limite específico atingiu frequência conforme definido pelo usuário através das telas independentes.
      Nota: Este protocolo é descrito em detalhes no Tom et al . 2013⁵. No nosso caso o fichário específico chamado baseia-se na determinação do cumulativa presa a taxa de acerto, e um limiar de eliminação controlada por dados de 5% é usado.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Um diagrama de fluxo de trabalho para a tecnologia de microarray de proteína extracelular é mostrado na Figura 1. Uma vez que os slides de microarray que contém a biblioteca de proteína extracelular estão disponíveis, o rastreio da proteína de interesse e análise de dados pode ser concluído dentro de um dia. Muitas interações fisiologicamente relevantes entre os receptores de membrana-incorporado são caracterizadas por forças de ligação muito f...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Um número significativo de órfãos receptores permanecem no genoma humano, e novos parceiros de interação continuam a emergir para proteínas extracelulares com ligantes anteriormente caracterizadas. Definindo as interações ligante-receptor em humanos e organismos modelo é essencial para compreender os mecanismos que determinam a comunicação celular durante a homeostase, bem como a desregulação levando a doença e, portanto, informar novos ou melhorados opções terapêuticas. Não obstante, deteção de inter...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultra Pure MB Grade glycerol	USB Corporation	56-81-5	Protein storage
SeptoMark blocking buffer	Zeptosens	BB1, 90-40	Blocking buffer microarray slides
Bovine serum albumin	Roche	03-117-957-001	Slide control for mask fitting (optional)
Polypropylene multiwell plates	Greiner Bio One	82050-678	Protein storage
Polypropylene multiwell plates	Arrayit	MMP384	Slide printing
NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer	Arrayit	NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer	Slide printing
Micro spotting pins	Arrayit	Micro spotting pins	Slide printing
ZeptoFOG blocking station	Zeptosens	ZeptoFOG blocking station, 1210	Block slides after printing
Skim milk powder	Thermo Fisher	LP0031	Blocking solution
Epoxysilane-coated glass slide	Nextrion Slide E	1064016	Microarray slides
Glass holder and slide rack set	Wheaton	900303	Slide storage
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA23031	Albumin labeling
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001	Human IgG labeling
Pro-spin desalting column	Princeton Separations	CS-800	Remove free dye
Adhesive aluminum foil seal	AlumaSeal	F-384-100	Seal stock plates
Polypropylene cryogenic vials	Corning	430658	Master vials for protein library storage
Protein A microbeads	Miltenyi	120-000-396	Query protein multimerization
Human IgG	Jackson Immunoresearch	009-000-003	Irrelevant IgG for labeling
Protein A	Sigma	P7837	Microarray slide blocking
Hybridization station, a-Hyb or similar	Miltenyi	Hybridization station, a-Hyb or similar	Automated microarray processing (optional)
GenePix 4000B scanner or similar	Molecular Devices	GenePix 4000B scanner or similar	Slide scanning
GenePix Pro or equivalent data extraction software	Molecular Devices	GenePix Pro or equivalent data extraction software	Data processing
Signal P4.1	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	online software	Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites
TMHMM 2.0 server	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	online software	Prediction of transmembrane helices in proteins
Phobius	Stockholm Bioinformatics Center	online software	A combined transmembrane topology and signal peptide predictor
TOPCONS	Stockholm University	online software	Prediction of membrane topology and signal peptides