세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

요약

여기, 우리는 높은 처리량 프로토콜 화면 extracellular 단백질 microarrays 소설 수용 체 ligand 상호 작용의 식별을 제시. 우리는 또한 단백질 microbead 복합물을 사용 하 여 일시적인 단백질-단백질 상호 작용의 탐지를 강화 하는 방법을 설명 합니다.

초록

분 비 요인, 곁에 막 수용 체 그리고 그들의 상호 작용 협동자 셀룰러 통신의 주요 레 귤 레이 터 및 항상성 및 질병, 폭포를 신호의 시작 이며 같은 대표 주요 치료 대상. 이러한 상호 작용 네트워크 그들의 관련성에도 불구 하 고 현재 데이터베이스;에서 크게 이루어지지 남아 따라서, 세포 외 단백질 가장 문서화 바인딩 파트너가 있다. 이 불일치는 주로 기능 단백질, 고 약한, 낮은 선호도, 단백질 상호 작용 세포 표면 수용 체 간에 자주 설정의 식을 포함 하 여 세포 외 단백질의 연구와 관련 된 문제 때문입니다. 이 방법의 목적은 세포 외 단백질 단백질 단백질 상호 작용의 심사에 대 한 microarray 형식 라이브러리의 설명 이다. 약한 상호 작용의 탐지를 사용 하려면 쿼리 단백질 연구의 multimerization에 따라 메서드를 설명 합니다. 증가 multivalency이 multimerization microbead 기반 접근을 결합, 단백질 microarray 높은 처리량 과도 단백질-단백질 상호 작용의 강력한 검색을 수 있습니다. 이 메서드는 신속 하 고 낮은 샘플 사용-접근 어떤 세포 외 단백질에 적용 가능한 새로운 상호 작용의 식별을 위해 제공합니다. 단백질 microarray 인쇄 및 심사 프로토콜을 설명 합니다. 이 기술은 세포 외 공간 상호 작용 단백질의 발견에 대 한 강력한 방법을 추구 하는 수 사관을 위해 유용할 것 이다.

서문

여기에 검토 하는 방법은 세포 외 단백질 microarray 형식,이 라이브러리에 대 한 관심의 대상의 심사에 대 한 방법으로 다음의 컬렉션의 인쇄를 설명 합니다. 우리는 낮은 바인딩 선호도 특징 상호 작용 검출을 위한 중요 한 단계로 단백질 multimerization를 확인 했습니다. 이러한 상호 작용의 탐지를 향상 시키기 위해, 우리 microbeads를 사용 하 여 관심사의 쿼리 단백질의 multimerization에 따라 프로토콜을 설명 합니다.

분 비 되며 세포 표면 표현 단백질 (총칭 하 여 세포 외 단백질에 게 불리는) 그들의 상호 작용 협동자 함께 셀룰러 통신, 신호 및는 microenvironment와의 상호 작용의 주요 레 귤 레이 터. 그들은, 따라서, 많은 생리와 병리학 과정 조절에 필수적인입니다. 인간 게놈 (≈5, 000 단백질)의 4 분의 1 약 extracellular 단백질에 대 한 인코딩, 체계적으로 전달 된 약물에 게 그들의 의미 및 접근성, 대표 약물 개발¹에 대 한 주요 대상. 따라서, 세포 외 단백질 단백질 목표 시장, "druggable proteome"로 알려진에 승인 된 약물에 대 한 알려진 약리 작업의 70% 이상 대표. 그들의 중요성 및 풍부에도 불구 하 고 세포 외 단백질-단백질 상호 작용 (ePPI) 네트워크 현저 하 게 underrepresented 사용 가능한 데이터베이스에 남아 있습니다. 이것은 근본적으로 대부분의 사용 가능한 기술²를 사용 하 여 그들의 특성화 하는 걸로 extracellular 단백질의 복잡 한 생 화 확 적인 성격 때문 이다. 첫째, 막 단백질은 어려운 solubilize, 종종 거친 세척 조건 및 세제;를 포함 하는 프로세스 둘째, 세포 외 단백질 종종 부족 관련 포스트 번역 상 수정 때이 단백질은 표현에 일반적으로 결 석 있다 glycosylation 분리 시스템을 사용 합니다. 마지막으로, 같은 공동 수용 체 면역 세포에 수용 체 사이 상호 작용은 종종 과도 하 고 특징이 매우 낮은 선호도 (하 ~ 1 μ M에서 K_D > 100 μ M 범위). 모두,이 단백질과 그들의 바인딩 파트너 가장 널리 렌더링의 자연 친 화력 정화/질량 분석 (AP/MS) 또는 효 모-2-하이브리드, 세포 외 공간에서 상호 작용의 탐지에 대 한 부적 절 한 같은 기술을 활용 ^{2 , 3}.

이러한 기술적 과제를 극복 하 고 extracellular 단백질에 대 한 새로운 상호 작용의 발견을 촉진 하기 위해, 우리는 높은 범위 extracellular 단백질 microarray^4,5를 개발 했습니다. Microarrays 소량 샘플, 고밀도 표면 생성의 이점을 제공 하 고 높은 처리량 연구를 일반적으로 받을. 주로 특정 단백질 가족^{6,7, 또는 cytosolic 상호 작용에 초점을 맞추고 이기는 하지만 단백질 microarray 기반 연구 이전 여러 모델에 대 한 유기 체를 위한 단백질 상호 작용에 관련 된 통찰력 제공 8}. 반면, 제한 된 작업은이 기술을 사용 하 여 세포 외 단백질 상호 작용을 조사 하기 위해 수행 되었습니다. 우리 정화 분 비 단백질의 포괄적이 고 매우 다양 한 라이브러리를 구축 하 여 ePPIs의 연구를 활성화 하는 단백질 microarray 방법을 개발 하 고 하나의 막 횡단 (STM) 수용 체 표현으로 재조합 세포 외 도메인 (ECD)에 융합 친 화력 정화⁴공통 태그 단백질 microarray 스크린의 성공 고품질 단백질 라이브러리의 설립에 크게 의존합니다. 라이브러리 및 쿼리 단백질의 표현을 위한 포유류 세포 또는 곤충 세포 우선적으로 선택 되었다 분리 식 시스템, 포스트 번역 상 수정 glycosylation 또는 이황화 채권 등의 적절 한 추가 되도록. SDS 페이지, 크기 배제 크로마토그래피 및 멀티 앵글 레이저 광 산란 일반적으로 재조합 단백질 품질을 평가 하기 위해 활용 하는 기술이 있습니다. 단백질 라이브러리는 다음 epoxysilane 슬라이드에 발견 하 고 장기간 사용-20 ° C에 저장. 0.4 mg/mL의 위 단백질 농도 프로토콜 아래에 설명 된 권장 됩니다. 따라서, 낮은 표현 단백질 농도 단계 샘플 인쇄 및 저장 하기 전에 필요할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고,이 기술의 주요 장점은 작은 양의 필요한 단백질 (단백질의 50 μ g은 수행 하기에 충분 한 > 2000 화면), 최소 쿼리 단백질 소비 (중복 화면 당 20-25 μ g)와 함께. 프로토콜 및 장비를 사용 하 여 설명, 그리고 제공 하는 라이브러리를 사용할 수 있는 개별 쿼리 단백질에 대 한 결과 1 작업 일 안에 생성 될 수 있습니다.

Extracellular 환경에 있는 단백질 상호 작용을 감지 하는 주요 과제는 가장 일반적으로 사용 되는 방법론에 의해 식별을 방해 그들의 특질 상 약하거나 과도 자연에서 발생 합니다. 바인딩 갈망을 크게 증가 약한 단백질 상호 작용^9,,1011의 검출 감도 향상 시킵니다. 우리 multimerize 하는 방법을 개발 하는이 원칙에 따라 (Fc 융합으로 표현) 쿼리 단백질 단백질 A 코팅 구슬^4,5를 사용 하 여. 무작위 라벨 쿼리 단백질의 어떤 잠재적인 비활성화를 방지, 우리 대신는 무관 한 인간 면역 글로불린 G와 Cy5 라벨을 추가 쿼리 단백질 함께 단백질 A 구슬에 따라서의 직접 활용으로 인해 모든 아티팩트를 제거는 관심사의 단백질에 염료. 여러 공동 수용 체 쌍의 micromolar 선호도 감안할 때, multivalent 단지 크게 신호 대 잡음 비, Fc-퓨전 쿼리 단백질 용 해 단백질⁴상영에 비해 향상 시킬.

요약 하자면,이 프로토콜의 목표 microarray 슬라이드 포함 하는 수용 체 ligand 상호 작용의 식별을 위해 기존의 세포 외 단백질 라이브러리의 준비를 설명 하는입니다. 우리는 슬라이드 인쇄, extracellular 단백질 라이브러리에 대 한 관심사의 단백질의 심사에 대 한 프로토콜에 대 한 단계를 검토 합니다. 또한, 우리는 연구에서 단백질의 증가 된 갈망을 달성 하기 위해 microbeads에 따라 ePPIs의 향상 된 검색 하는 방법을 설명 합니다. 여기에 설명 된 세포 외 단백질 microarray 기술 심사 및 낮은 허위 양성 비율와 소설 ePPI 감지만 그램 양의 아래 쿼리 단백질을 이용 하 여 빠르고, 강력 하 고 효과적인 접근 방식을 나타냅니다. 조사입니다. 이 기술 수용 체^12,13,¹⁴, 바이러스 성 immunoregulators 포함 하 여 다양 한을 위한 이전에 알려지지 않은 세포 기능 및 신호 경로에 관련 된 통찰력을 제공 하는 여러 연구를 자극 했다 그리고 드 orphanize 관심사의 어떤 세포 외 단백질을 이용 될 수 있다.

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프로토콜

1. 휴먼 Extracellular 단백질의 라이브러리의 생성

1. 세포 표면 수용 체 또는 단백질 microarray 라이브러리를 구축 하는 관심사의 단백질 분 비의 목록을 컴파일하십시오. 특정 단백질 가족 (예를 들어 면역 글로불린 superfamily) 또는 단백질 선택적으로 표현 특히 세포 연구에 대 한 유형을 선택할 수 있습니다.
2. 세포 표면 수용 체에 대 한 신호 펩 티 드 및 소프트웨어 도구를 사용 하 여 막 횡단 영역을 식별 하 여 세포 외 도메인 (ECD) 경계를 결정 합니다. 관련의 일부, 자유롭게 사용할 수 있는 온라인 도구, 재료의 표^15,,1617,18에서 참조.
3. 관련 벡터에 관심과 클론의 유전자에 대 한 ECD를 음성 합성. 분 비 단백질 또는 일반적인 선호도 태그의 수에 융합 ECD의 STM 수용 체 적절 한 벡터와 페 셀의 조건된 미디어에서 또는 잠재-곤충 세포 식 시스템에서 정화 될 수 있습니다.
   참고: 포유류 세포 기반 시스템 (HEK/293 또는 조 세포)는 적절 한 단백질 접기의 가능성과 glycosylation 등 관련 posttranslational 수정 추가 극대화 하기 위해 권장 됩니다.
4. 표준 선호도 정화 방법으로 단백질 정화. 자동 또는 반자동 절차 관심^{9,,1920의 단백질 집합 생성을 확장할 수 있는 단백질의 수백의 정화에 적합을 설명 하는 이전 노력 21}.
   참고: SDS 페이지, 크기 배제 크로마토그래피 (S), 또는 다 각 레이저 빛 (쇼핑몰)를 뿌리는 권장 모든 비 공유 집계를 평가 하 고 단백질 준비의 전반적인 품질에 대 한 제어.
5. 200 또는 400 μ g/mL, 가능 하면 단백질을 조정-20 ° c.에 극저온 튜브에서 장기 저장을 위한 80% 글리세롤과 주식 희석 이러한 마스터 주식 진술 하 고 필요한 경우에 액세스 해야 합니다.
6. 각 단백질 (100 μ)의 aliquots 96 잘 접시 (주식 접시)을 전송 하 고 접착 호 일 인감 microarray 슬라이드 준비까지-20 ° C에서 저장. 주식 판 freeze-thaw 주기를 최소화 하 고 단백질 안정성 보장을 생성 됩니다.

2. 세포 외 단백질 Microarray 인쇄

1. 표준 microarrayer를 사용 하 여 슬라이드 인쇄. 여기에 설명 된 프로토콜에 대 한 활용 악기 57 슬라이드/실행의 용량이 고 48 탐지 핀을 잡고 프린트 헤드를 사용 합니다. 이 핀 ~ 100 μ m 직경 구분 ~ 350 μ m의 반점 거리의 관광 명소를 생성 하 고 로드 당 0.25 μ를 그립니다. 이 구성에서 슬라이드 당 8000 명소까지 가질 수 있습니다.
2. 주식 판에서 작업 플레이트 (384 잘 접시, 10 μ 샘플/잘)를 생성 합니다. 슬라이드 인쇄는 microarrayer를 사용 하 여 이전에 수동으로이 단계를 수행 합니다. 그런 다음, 단백질 (단백질 반점의 탈수를 방지)을 60% 습도 epoxysilane 슬라이드에 퀼 형 스포팅 핀 자리.
   참고: Cy3 표시 된 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 발견하실 수 있습니다 각 단백질 샘플 (PBS/40% 글리세롤에 5 μ g/mL) 간의 중복에 마스크 피팅 (4 절 참조)에 대 한 배열 시각화. 좋지만,이 단계는 선택 사항입니다.
3. 인쇄, 후 습도 환경에서 단백질 microarray 슬라이드를 제거 하 고 하룻밤 비활성화 표면에 PBST에 5% 우유와 함께 그들을 차단 합니다.
   참고: 선호 접근 차단 솔루션을 슬라이드 표면에 침전의 정밀한 안개를 생성 하는 초음파 fogger를 사용 하는.
4. 동결을 방지 하기 위해 50% 글리세롤에-20 ° C에 슬라이드를 저장 합니다.

3입니다. Multivalent 미끼 복합물의 준비

참고: extracellular 단백질 사이 상호 작용 종종 낮은 친 화력에 의해 특징. 단백질 A 코팅 microbeads에 바인딩 갈망, Fc 태그 ECD로 쿼리 단백질, 캡처 기반으로 multivalent 접근을 증가 하 여 이러한 상호 작용의 검색을 사용 하려면 개발된⁴했다.

1. Label 캐리어 IgG Cy5 monoreactive 염료와 검색에 사용 되 고 염 열을 사용 하 여 무료로 염료를 구분. 280, 650 nm에 자외선 흡 광도 측정 하 여 염료 단백질 비율을 결정 합니다.
   참고: 2.0과 4.0 사이의 단백질-염료 비율이 일반적으로 사용 됩니다. 100000 x g 15 분 라벨링 과정으로 인해 잠재적인 가용성 집계 제거에서 Cy5 어원이 같은 말을 회전 하는 것이 좋습니다.
2. 단백질 쿼리 단백질의 일정 금액에 대 한 A의 적정에 의해 최적의 microbead 단백질 비율을 결정 합니다. 아니 무료 Fc 태그 단백질의 남아 있는 구슬의 최소 saturating 볼륨 biolayer 간섭계에 의해 결정 경쟁력 분석 결과 사용 하 여 측정으로 심사에 사용 됩니다.
3. Fc 태그 쿼리와 Cy5 IgG 단백질 A microbeads와 빛 으로부터 보호 하는 실 온에서 30 분 PBS에 튜브 회전자에 혼합 배양 하 여 microbead-단백질 복합물을 형성 한다.
4. 이 단지를 형성, 최종 농도 20 μ g/ml에서 쿼리 단백질을 사용 합니다. 쿼리 단백질과 Cy5 IgG의 어 금 니 비율을 계산 하려면 분할 IgG의 분자량에 의해 쿼리 단백질의 분자량 (150000 Da)와 Cy5-IgG 필요의 농도 결정 하기 위해 40 μ g/mL를 곱합니다.
5. 샘플 한 (1 mg/mL) 부 화 직전에 microarray와 Fc 융합 단백질 배열에 있을 수 있는 모든 무료 단백질 A 구슬의 바인딩 방지 (4.2 섹션 아래 참조) 슬라이드 하는 수용 성 단백질을 보충 한다.
   참고: 최종 반응 볼륨 활용 교 잡 역 또는 보육 실에 따라 달라질 수 있습니다. 계측 자료의 테이블에 에서 설명 된 비교적 작은 볼륨 (슬라이드 당 ~ 200 μ)을 사용 하 여 샘플 보육을 수 있습니다.

4. 심사 및 처리에 Microarray를 세포 외 단백질

참고: 자동 처리 플랫폼을 제공 하는 제조 업체의 숫자가 있다. 교 잡 역, 사용할 수 없는 경우 다음 단계를 수동으로 수행할 수 있습니다, 그리고 항상 물속에 충분 한 양의 슬라이드를 유지 하는 버퍼는 보장.

1. 따뜻한 실내 온도에 슬라이드와 교 잡 역에 로드 하기 전에 잔여 글리세롤을 제거 하려면 PBS/0.1% 트윈 20 (PBST)와 린스.
2. 다음 심사 프로토콜 사용 하 여:
   1. PBST 1 분 동안 씻어.
   2. 1 mg/mL 단백질 A PBS/5% 우유의 200 μ를 로드 하 고 있는 microarray에 있을 수 있는 Fc 태그 단백질 바인딩에서 microbeads uncomplexed 단백질을 방지 하기 위해 30 분 동안 품 어.
   3. 1 분 동안 PBST 5 번 씻어.
   4. 쿼리: microbeads 1 mg/mL 단백질의 복잡 한의 200 μ를 로드 하 고 30 분 동안 품 어.
   5. PBST 1 분 동안 씻어.
3. 교 잡 후 슬라이드를 물으로 씻어, 개별 50 mL 원뿔 튜브에 놓고 5 분 900 x g에서 회전 하 여 건조 합니다.
4. 마지막으로, 각각 532와 635 nm, 흥미로운 여 microarray 스캐너 Cy3 (해당 되는 경우 BSA Cy3 인쇄 되었다) 검출에 적합 한와 Cy5 형광 슬라이드를 스캔 합니다.
5. 동반 microarray 데이터 분석을 사용 하 여 데이터 분석을 수행 합니다. (.Gal 파일)로 관련 배열 목록 데이터 추출 소프트웨어에 로드 됩니다. 이 단계에서 Cy3 BSA 명소 블록을 찾을 때 필요한 기능의 수동 정렬 다음 소프트웨어에서 자동 맞춤 옵션을 사용 하 여를 사용 합니다. 추가 분석을 위해.gpr 파일로 파일을 저장할.

5. 데이터 분석

1. GPR 파일 및 프로세스 r microarray 데이터^4,5의 분석을 위해 일반적으로 이용 하는 limma 패키지를 사용 하 여 데이터를 저장 합니다.
   1. 전처리, 교정 및 슬라이드 내의 정규화 배경 할. 이후 각 단백질은 중복된 장소에서 인쇄, 두 복제 측정 라이브러리에서 해당 단백질에 대 한 하나의 점수를 만들 결합.
   2. 각 슬라이드에 대 한 점수를 계산 하 고 슬라이드 사이 높은 점수를 받은 후보자의 교차로 대 한 결과 분석.
   3. 슬라이드 변화에 대 한 제어를 별도 인쇄 실행에서 중복 된 microarrays를 사용 하 고 두 화면에서 데이터를 나타내는 교차 플롯을 사용 하 여 최종 안타를 호출.
   4. 마지막으로, 추가 수준을 필터링 제외는 배열 내에서 무차별 단백질을 수행 합니다. 이러한 일반적인 바인더 충돌로 특정 임계값을 초과 하는 단백질 주파수 독립 화면에서 사용자에 의해 정의 된 대로 식별 됩니다.
      참고:이 프로토콜은 톰 외. 2013⁵에서 자세히 설명 되어 있습니다. 호출 하는 일반적인 바인더는 누적의 결정에 따라 우리의 경우에서 적중률, 먹이 그리고 5%의 데이터 기반 제거 임계값 사용 됩니다.

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결과

세포 외 단백질 microarray 기술에 대 한 워크플로의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 세포 외 단백질 라이브러리를 포함 하는 microarray 슬라이드 사용할 수 있습니다, 일단 관심 및 데이터 분석의 단백질의 심사는 1 일 안에 완료할 수 있습니다. 멤브레인 포함 수용 체 간의 많은 순수 관련 상호 작용 매우 약한 바인딩 강점 (K_D micromolar 범위에서) 특?...

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토론

고아 수용 체의 상당수는 인간 게놈에 남아 고 소설 상호 작용 파트너 이전 특징이 ligands과 세포 외 단백질에 대 한 등장을 계속 합니다. 항상성, 뿐만 아니라 질병, 이어지는 dysregulation 셀룰러 통신을 지정 하는 메커니즘을 이해 하 고 따라서 새로운 또는 향상 된 알려 필수적 이다 모형 유기 체 및 인간 상호 작용 수용 체 ligand 정의 치료 옵션입니다. 그럼에도 불구 하 고, 널리 사용 되는 기술에 의...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultra Pure MB Grade glycerol	USB Corporation	56-81-5	Protein storage
SeptoMark blocking buffer	Zeptosens	BB1, 90-40	Blocking buffer microarray slides
Bovine serum albumin	Roche	03-117-957-001	Slide control for mask fitting (optional)
Polypropylene multiwell plates	Greiner Bio One	82050-678	Protein storage
Polypropylene multiwell plates	Arrayit	MMP384	Slide printing
NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer	Arrayit	NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer	Slide printing
Micro spotting pins	Arrayit	Micro spotting pins	Slide printing
ZeptoFOG blocking station	Zeptosens	ZeptoFOG blocking station, 1210	Block slides after printing
Skim milk powder	Thermo Fisher	LP0031	Blocking solution
Epoxysilane-coated glass slide	Nextrion Slide E	1064016	Microarray slides
Glass holder and slide rack set	Wheaton	900303	Slide storage
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA23031	Albumin labeling
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001	Human IgG labeling
Pro-spin desalting column	Princeton Separations	CS-800	Remove free dye
Adhesive aluminum foil seal	AlumaSeal	F-384-100	Seal stock plates
Polypropylene cryogenic vials	Corning	430658	Master vials for protein library storage
Protein A microbeads	Miltenyi	120-000-396	Query protein multimerization
Human IgG	Jackson Immunoresearch	009-000-003	Irrelevant IgG for labeling
Protein A	Sigma	P7837	Microarray slide blocking
Hybridization station, a-Hyb or similar	Miltenyi	Hybridization station, a-Hyb or similar	Automated microarray processing (optional)
GenePix 4000B scanner or similar	Molecular Devices	GenePix 4000B scanner or similar	Slide scanning
GenePix Pro or equivalent data extraction software	Molecular Devices	GenePix Pro or equivalent data extraction software	Data processing
Signal P4.1	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	online software	Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites
TMHMM 2.0 server	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	online software	Prediction of transmembrane helices in proteins
Phobius	Stockholm Bioinformatics Center	online software	A combined transmembrane topology and signal peptide predictor
TOPCONS	Stockholm University	online software	Prediction of membrane topology and signal peptides