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要約

高スループットで新規受容体-リガンド相互作用の同定のため画面細胞外蛋白質のマイクロ アレイのプロトコルを紹介します。タンパク質マイクロ ビーズの複合体を使用して、一時的なタンパク質-タンパク質相互作用の検出を強化する方法について述べる。

要約

分泌因子、つなが膜の受容体と相互作用する相手は携帯電話通信の主なレギュレータと恒常性と病の間にカスケードをシグナル伝達の開始など治療の主な対象を表します。その妥当性にもかかわらずこれらの相互作用のネットワーク現在データベースで著しく過小評価のまましたがって、最も細胞外タンパク質が、文書化された結合パートナーを持っていることはないです。この不一致は主に機能性タンパク質と弱い、低親和性蛋白質の相互作用の細胞表面受容体の間が確立の表情など、細胞外のタンパク質の研究に関連する課題。このメソッドの目的は、細胞外蛋白質蛋白質蛋白質の相互作用のスクリーニングのためのマイクロ アレイ フォーマットのライブラリの印刷を記述することです。弱い相互作用の検出を有効にするには、調査の下でクエリ タンパク質の多量体形成に基づく方法が説明されています。増加 multivalency のこのビーズ ベースの多量体形成のアプローチに結合、蛋白質のマイクロ アレイは、高スループットの一時的なタンパク質-タンパク質相互作用の検出をことができます。この手法アプローチを提供迅速かつ低サンプル消費-細胞外蛋白質を適用可能な新しい相互作用を識別するため。蛋白質のマイクロ アレイの印刷とスクリーニング プロトコルを説明します。この技術は、細胞外空間におけるタンパク質相互作用の検出のための堅牢なメソッドを求めて捜査の役に立つでしょう。

概要

ここを見直してメソッドでは、このライブラリに対して関心の対象のスクリーニングの試みに続いて、マイクロ アレイ フォーマットの細胞外蛋白質のコレクションの印刷について説明します。低結合親和性によって特徴付けられる相互作用の検出のための重要なステップとしてタンパク質の多量体形成を同定しました。これらの相互作用の検出を高めるためには、マイクロ ビーズを使用して興味のクエリ タンパク質の多量体形成に基づくプロトコルについて述べる。

分泌され、細胞表面発現タンパク質 (総称して細胞外蛋白質と呼ばれる) その相互作用パートナーと一緒に、細胞間コミュニケーション、シグナリングと、微小環境との相互作用の主調整装置。彼らは、したがって、多くの生理学的および病理学的プロセスの調節に不可欠であります。人間のゲノム (≈5、000 の蛋白質) のおよそ四分の一を細胞外蛋白質のためエンコード、薬品開発1主要なターゲットを表す体系的に提供された薬の意義とアクセシビリティを考えると。その結果、細胞外蛋白質は「druggable プロテオーム」として知られている、市場で承認された薬の既知の薬理作用を持つ蛋白質ターゲットの 70% 以上を表します。にもかかわらず、その重要性と豊かさ、細胞外のタンパク質-タンパク質相互作用 (ePPI) ネットワーク利用可能なデータベースで著しく過小評価のまま。これは根本的に利用可能なほとんどの技術2を使用してその特性を排除する細胞外蛋白質の複雑な生化学的性質のためです。まず、膜タンパク質は、過酷な洗浄の条件と洗剤; をしばしば含むプロセスの可溶化困難第二に、細胞外蛋白質は、不在のこれらの蛋白質の表現は、一般的には、糖鎖修飾異種システムに使用されるなど、関連する翻訳後修飾をしばしば欠いています。最後に、免疫細胞に発現共受容体などの受容体間の相互作用は、しばしば一時的なと非常に低い親和性によって特徴付けられる (〜 1 μ M ~ KD > 100 μ M の範囲)。完全に、これらの蛋白質と最も広くパートナーをレンダリングの自然利用アフィニティ精製/質量分析法 (AP/ミリ秒) または細胞外空間における相互作用の検出には不向き酵母-2-ハイブリッドなどの技術2,3。

これらの技術的課題を克服するため、細胞外蛋白質の小説の相互作用の発見を加速するために、我々 は高いカバレッジの細胞外タンパク質マイクロ アレイ4,5を開発しました。マイクロ アレイ、高スループット研究に一般に従うサンプルの少量の高密度サーフェスの生成の利点を提供します。ゾル性細胞質の相互作用または特定の蛋白質家族6,7、中心とはいえタンパク質マイクロ アレイを用いた研究がいくつかのモデル有機体の蛋白質の相互作用に関連する洞察力を提供している以前 8。対照的に、限られた仕事は、この技術を使って細胞外蛋白質の相互作用を調査するため行われています。単一膜貫通 (STM) 受容器表現に融合として遺伝子組換え細胞外ドメイン (ECD) と浄化された分泌蛋白質の包括的で非常に多様なライブラリを構築することで ePPIs の研究蛋白質マイクロ アレイ法を開発しました。アフィニティ精製4共通のタグ。蛋白質のマイクロ アレイのスクリーンの成功は、高品質タンパク質ライブラリの確立に大きく依存します。ライブラリとクエリの両方のタンパク質の発現、哺乳動物細胞や昆虫細胞優先的に選ばれた異種発現システムとして適切な添加糖またはジスルフィド結合などの翻訳後修飾を確保するため。SDS ページとサイズ排除クロマトグラフィー多角度レーザ光散乱は、組換え蛋白質の品質を評価するためによく利用されている手法です。タンパク質ライブラリは、エポキシシランのスライドに斑点を付けるし、長期使用のための-20 ° C で保存します。0.4 mg/ml を超えるタンパク質濃度は、以下のプロトコルに適しています。したがって、低発現タンパク質は、濃度ステップ前にサンプル印刷とストレージを必要があります。それにもかかわらず、この手法の主な利点は、必要なタンパク質の少量 (50 μ g のタンパク質が実行するための十分な > 2,000 画面)、最小限のクエリ蛋白質の消費量 (重複画面あたり 20 25 μ g) と一緒に。プロトコルおよび装置を使用して、ここで説明し、1 営業日以内蛋白質個々 のクエリの結果を生成できるライブラリが使用可能で、提供されます。

細胞外の環境の蛋白質の相互作用を検出するに主要な課題は、最も一般的に使用される方法論によって識別を排除、その特質上弱いまたは非定常自然から発生します。結合親和が大きく増えて弱いタンパク質相互作用9,10,11の検出感度を向上させます。(Fc 融合として表される) クエリ蛋白質 multimerize する手法を開発した原理に基づく蛋白質 A をコートしたビーズ4,5を使用しています。クエリ タンパク質の任意の潜在的な不活性化を避けるためには、ランダムなラベリング、我々 代わりに Cy5 と無関係な人間グロブリン G にラベルを付けるし、クエリ タンパク質と一緒にに追加タンパク質 A ビーズの直接接合のための成果物がなくなり、興味の蛋白質を染めます。いくつかの受容体ペアのマイクロモル親和性を考えると、非常に多価の錯体は信号対雑音比、可溶性タンパク質4として上映 Fc 融合クエリ蛋白質と比較してを高めます。

要約すると、このプロトコルの目標は受容体-リガンド相互作用の同定の既存の細胞外タンパク質ライブラリを含むマイクロ アレイ スライドの準備を記述するためです。スライド印刷、その後細胞外タンパク質ライブラリに対する興味の蛋白質のスクリーニングのためのプロトコルにするための手順を確認します。さらに、研究中のタンパク質の増加の親和を達成するためにマイクロ ビーズに基づく ePPIs の強化された検出法について述べる.ここで説明細胞外蛋白質のマイクロ アレイの技術は唯一蛋白質のマイクログラム量、クエリの下を用いてスクリーニングおよび低い偽陽性率と新規 ePPI を検出するための高速、堅牢で効率的なアプローチを表します調査。この技術は、各種受容体12,13, を含むウイルス immunoregulators14、未知の細胞機能やシグナル伝達経路に関連する洞察力を提供している複数の研究を煽っています。デ orphanize 興味の任意の細胞外蛋白質に利用することができます。

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プロトコル

1. 人間の細胞外蛋白質のライブラリの生成

  1. 細胞表面受容体またはタンパク質マイクロ アレイ ライブラリのビルドに興味の分泌された蛋白質のリストをコンパイルします。特定の蛋白質家族 (たとえば、免疫グロブリン スーパーファミリー) または蛋白質特に研究のタイプを選択できるセル選択的に発現。
  2. 細胞表面受容体シグナルペプチドとソフトウェア ツールを使用して膜貫通領域を識別することによって細胞外ドメイン (ECD) の境界を決定します。いくつかの関連するツールの自由に利用できるオンライン、材料表15,16,17,18で参照されます。
  3. 関連するベクトルに興味とクローンの遺伝子の ECD を合成します。適切なベクトルをトランスフェクトした細胞の調節されたメディアまたはバキュロ ウイルス昆虫細胞発現系から、分泌タンパク質や一般的な親和性の札の数を融合した ECD の STM 受容体を浄化することが。
    注: 適切なタンパク質の折り畳みの尤度と関連する修飾糖などの添加を最大化する (HEK 293/CHO 細胞など) の哺乳類細胞を用いたシステムが推奨されます。
  4. 標準的な親和性の浄化方法で蛋白質を浄化します。以前の努力は、何百もの関心9,19,20の蛋白質のセットを生成するために量ることができる、タンパク質の精製に適した自動または半自動の手順を説明しています。 21。
    注: SDS ページ、サイズ排除クロマトグラフィー (S)、または多角度レーザ光散乱 (モール) 任意の非共有結合集計を評価するために、タンパク質製剤の全体的な品質を制御する適しています。
  5. 可能な限り、200 または 400 μ g/mL にタンパク質を調整-20 ° C のセラム チューブの長期貯蔵のための 80% グリセロールと株式を希薄化とこれらはマスターの株式を表し、必要なときだけアクセスする必要があります。
  6. 96 ウェルのプレート (株式板) に各蛋白質 (100 μ L) の因数を転送、接着箔シールし、マイクロ アレイ スライド準備まで-20 ° C で保存します。凍結融解サイクルを最小限に抑え、タンパク質の安定性は、株式板が生成されます。

2. 細胞外蛋白質のマイクロ アレイの印刷

  1. スライドの印刷の標準的な microarrayer を使用します。ここで説明されているプロトコルの利用楽器は 57 スライド/実行能力し、ホールディング 48 スポッティング ピン印字ヘッドを使用します。これらのピンは ~ 350 μ m のスポットを距離で区切られた ~ 100 μ m 径のスポットを生成し、負荷ごとの 0.25 μ L を描画します。この設定では、スライドあたり 8,000 点まで対応できます。
  2. 株式板から作業プレート (10 μ L のサンプル/ウェル、384 ウェル プレート) を生成します。この手順では、手動で、microarrayer を使用してスライド印刷する前に。その後、クイル型 (蛋白スポットの脱水を防ぐため) に 60% 湿度でエポキシシラン スライドにスポッティング ピンが付いている蛋白質を見つけます。
    注: Cy3 標識ウシ血清アルブミン (BSA) は、マスクのフィッティング (セクション 4 を参照) の配列を視覚化する各蛋白質のサンプル (PBS/40% グリセロールの 5 μ g/mL) 間での重複の発見することができます。お勧めは、この手順は省略できます。
  3. 印刷後加湿環境からタンパク質マイクロ アレイ スライドを削除し、一晩 pbst; 表面を不活性化するために 5% ミルクでそれらをブロックします。
    注: 推奨されるアプローチは、超音波噴霧器を使用して、スライド面上に配置ソリューションをブロックの細かい霧を生成することです。
  4. 凍結を防ぐために 50% のグリセロールに-20 ° C でスライドを保存します。

3 多価餌錯体の合成

注: 細胞外タンパク質間相互作用は、低親和性によって特徴付けられる多くの場合。結合親和、ECD、タグ付きの Fc として表されるクエリ タンパク質を捉えるに基づく多価アプローチを増やすことによってこれらの相互作用の検出を有効にするには、蛋白質のコーティング ビーズの開発4であった。

  1. キャリア IgG Cy5 monoreactive 色素の検出のためにラベルを付けるし、脱塩カラムを使用して無料の色素を分離します。280 と 650 nm 帯紫外吸光度を測定することによりタンパク質の比率に色素を決定します。
    注: タンパク質-色素の比率は 2.0、4.0 は、通常使用されます。ラベリング処理のための潜在的な水溶性集計を削除する 15 分間 100,000 × g Cy5 抱合体をスピンすることをお勧めします。
  2. クエリの蛋白質の一定量に対して蛋白質の滴定によって最適なビーズとタンパク質比を決定します。Biolayer 干渉法による決定競争の試金を使用して測定される最小限の飽和量のビーズ無料 Fc タグ付きタンパク質が残っていない場所はスクリーニングに使用されます。
  3. タグ付きの Fc クエリおよび蛋白質のマイクロ ビーズと光から保護部屋の温度で 30 分間、PBS でチューブ回転子にミックス Cy5 IgG の孵化によってビーズ タンパク質複合体を形成します。
  4. これらの複合体を形成、20 μ g/mL の最終的な集中でクエリ タンパク質を使用します。IgG の分子量によってクエリ蛋白質の分子量を分割クエリ蛋白質および Cy5 IgG のモル比を計算する (150,000 Da) 必要と Cy5 IgG 濃度を決定するため 40 μ g/mL を掛けると。
  5. 可溶性タンパク質の配列に存在する Fc 融合タンパク質の任意無料蛋白質 A ビーズの結合を防ぐため、(1 mg/mL) 孵化直前でマイクロ アレイ スライド (後述の 4.2 を参照) でサンプルを補足します。
    メモ: 最終的な反応ボリュームは利用交配駅、インキュベーション室によって異なります。材料の表に記載されているインストルメンテーションにより、比較的小さなボリューム (スライドごと 〜 200 μ L) を使用してサンプルの培養です。

4. 細胞外蛋白質のマイクロ アレイのスクリーニングおよび処理します。

注意: 自動処理プラットフォームを提供するメーカーの数があります。交配駅が使用できない場合次の手順を手動で実行することができます、すべての回で冠水したスライドを保持するバッファーの十分な量があることを確保します。

  1. 暖かい室温でスライドと交配ステーションにロードする前に残留グリセリンを削除する PBS/0.1% Tween 20 (pbst;) ですすいでください。
  2. 次のスクリーニング プロトコルを使用します。
    1. 1 分の PBST で洗ってください。
    2. PBS/5% ミルクで 1 mg/mL 蛋白質 A の 200 μ L を読み込み、マイクロ アレイに存在する Fc タグ付きタンパク質へ結合ビーズ単量体蛋白質を防ぐために 30 分間インキュベートします。
    3. 1 分の PBST で 5 回を洗ってください。
    4. 1 mg/mL 蛋白質の存在下で複雑なクエリ: ビーズの 200 μ L を読み込み、30 分間インキュベートします。
    5. 1 分の PBST で洗ってください。
  3. 交配後すすぎ水スライド、各 50 mL の円錐管に配置し、5 分間 900 x g で回して乾燥します。
  4. 最後に、それぞれ 532 と 635 nm で励起することにより (BSA Cy3 がプリントされた) 場合、Cy3 を検出する適切なマイクロ アレイ スキャナーと Cy5 蛍光スライドをスキャンします。
  5. 付属のマイクロ アレイ データ解析を用いたデータ解析を実行します。(.Gal ファイル) として関連する配列リストは、データ抽出ソフトウェアに読み込まれます。この段階でブロックを検索し、必要に応じて機能の手動配置に続いて、ソフトウェアの自動調整オプションを使用する Cy3 BSA スポットを利用します。さらに分析のための .gpr ファイルとしてファイルを保存します。

5. データの解析

  1. GPR ファイルと r 一般マイクロ アレイ データ4、5の解析のために利用、limma パッケージを使用してプロセスとしてデータを保存します。
    1. 前処理を行う背景補正とスライド内正規化。以来、各蛋白質を重複スポットで印刷すると、ライブラリでそのタンパク質の 1 つスコアを作成する両方のレプリケートの測定を組み合わせます。
    2. スライドごとにスコアを計算し、高得点候補者スライド間の交差の結果を分析します。
    3. スライド変動のコントロールに別の印刷実行から重複するマイクロ アレイを使用して、両方の画面からデータを表す交点プロットを使用して最終ヒットを呼び出します。
    4. 最後に、アレイ内での無差別の蛋白質を除外するフィルタ リングの追加レベルを実行します。このような非固有のバインダーは、蛋白質が特定のしきい値を超えるヒット頻度の独立した画面で、ユーザーが定義したように識別されます。
      注: このプロトコル、トムら20135で詳しく説明します。呼び出す非特異的バインダーは累積の決定に基づいて我々 の場合ヒット率の餌食し、5% のデータ駆動型消去しきい値が使用されます。

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結果

細胞外蛋白質のマイクロ アレイの技術のワークフローの図を図 1に示します。細胞外タンパク質ライブラリを含むマイクロ アレイ スライドがあります、一度関心とデータ分析のタンパク質のスクリーニングは 1 日以内で完了できます。受容体の膜に埋め込まれた間多くの生理学的に関連する相互作用は非常に弱い結合力 (KDマイクロモ?...

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ディスカッション

人間のゲノムでは、オーファン受容体のかなりの数が残っているし、以前特徴付けられる配位子を細胞外蛋白質のために出現し続ける小説の相互作用のパートナー。ディクテーション中不全疾患につながるだけでなく、恒常性は、携帯電話通信のメカニズムを理解し、したがって新しいまたは強化された機能を知らせる重要な人間の受容体-リガンド相互作用やモデル生物の定義は治療オプシ...

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開示事項

学、S.R R と N.M M。ジェネンテック社の従業員は、ジェネンテック社/ロシュ ・ グループの株式。

謝辞

原稿を批判的に読み、Philamer Calses と神戸ユンに感謝します。ランディ円優れた技術的なアドバイスに感謝しております。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Ultra Pure MB Grade glycerolUSB Corporation56-81-5Protein storage
SeptoMark blocking buffer ZeptosensBB1, 90-40Blocking buffer microarray slides
Bovine serum albuminRoche03-117-957-001Slide control for mask fitting (optional)
Polypropylene multiwell platesGreiner Bio One82050-678Protein storage
Polypropylene multiwell platesArrayitMMP384Slide printing
NanoPrint LM60, or similar contact microarrayerArrayitNanoPrint LM60, or similar contact microarrayerSlide printing
Micro spotting pinsArrayitMicro spotting pinsSlide printing
ZeptoFOG blocking stationZeptosensZeptoFOG blocking station, 1210Block slides after printing
Skim milk powderThermo FisherLP0031Blocking solution
Epoxysilane-coated glass slideNextrion Slide E1064016Microarray slides
Glass holder and slide rack setWheaton900303Slide storage
Cy5 monoreactive dyeGE HealthcarePA23031Albumin labeling
Cy5 monoreactive dyeGE HealthcarePA25001Human IgG labeling
Pro-spin desalting columnPrinceton SeparationsCS-800Remove free dye
Adhesive aluminum foil sealAlumaSealF-384-100Seal stock plates
Polypropylene cryogenic vialsCorning430658Master vials for protein library storage
Protein A microbeadsMiltenyi120-000-396Query protein multimerization
Human IgGJackson Immunoresearch 009-000-003Irrelevant IgG for labeling
Protein ASigma P7837Microarray slide blocking
Hybridization station, a-Hyb or similarMiltenyiHybridization station, a-Hyb or similarAutomated microarray processing (optional)
GenePix 4000B scanner or similarMolecular DevicesGenePix 4000B scanner or similarSlide scanning
GenePix Pro or equivalent data extraction softwareMolecular DevicesGenePix Pro or equivalent data extraction softwareData processing
Signal P4.1DTU Bioinformatics, Technical University of Denmarkonline softwarePrediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites
TMHMM 2.0 serverDTU Bioinformatics, Technical University of Denmarkonline softwarePrediction of transmembrane helices in proteins
PhobiusStockholm Bioinformatics Centeronline softwareA combined transmembrane topology and signal peptide predictor
TOPCONSStockholm Universityonline softwarePrediction of membrane topology and signal peptides

参考文献

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