Tecnología de microarrays de proteínas extracelulares para detección de alto rendimiento de las interacciones ligando-Receptor de baja afinidad

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de pantalla proteína extracelular microarrays para la identificación de las interacciones receptor-ligando novela en alto rendimiento. También se describe un método para mejorar la detección de interacciones proteína-proteína transitorias mediante el uso de complejos de proteína-microbead.

Resumen

Factores secretados, receptores de membrana atada y sus socios interactúan son los reguladores principales de la comunicación celular y la iniciación de cascadas de señalización durante la homeostasis y la enfermedad y como tal representan dianas terapéuticas principales. A pesar de su importancia, estas redes de interacción quedan significativamente subrepresentadas en las bases de datos actuales; por lo tanto, más proteínas extracelulares no tienen ningún socio obligatorio documentado. Esta discrepancia es sobre todo debido a los problemas relacionados con el estudio de las proteínas extracelulares, incluyendo la expresión de proteínas funcionales y la débil, baja afinidad, las interacciones de la proteína a menudo se establece entre receptores de superficie celular. El propósito de este método es describir la impresión de una librería de proteínas extracelulares en un formato de microarray para la detección de interacciones proteína-proteína. Para habilitar la detección de interacciones débiles, se describe un método basado en multimerization de la proteína de consulta bajo estudio. Junto a esta base del microbead multimerization para mayor multivalency, el microarray de proteínas permite la detección robusta de interacciones proteína-proteína transitorias en alto rendimiento. Este método ofrece un muestra rápida y de bajo consumo de enfoque para la identificación de nuevas interacciones aplicables a cualquier proteína extracelular. Impresión de microarrays de la proteína y el protocolo de detección se describen. Esta tecnología será útil para los investigadores que buscan un método robusto para el descubrimiento de las interacciones de la proteína en el espacio extracelular.

Introducción

El método revisado aquí describe la impresión de una colección de proteínas extracelulares en un formato de microarrays, seguido de un método para la detección de un objetivo de interés contra esta biblioteca. Hemos identificado proteínas multimerization como un paso crucial para la detección de interacciones caracterizados por afinidades de unión baja. Para mejorar la detección de estas interacciones, se describe un protocolo basado en multimerization de la proteína de consulta de interés utilizando microesferas.

Segregada y superficie expresan proteínas de la célula (colectivamente llamadas proteínas extracelulares) junto con sus socios de la interacción son reguladores claves de la comunicación celular, la señalización y la interacción con el microambiente. Por lo tanto, son esenciales en la regulación de muchos procesos fisiológicos y patológicos. Aproximadamente un cuarto del genoma humano (≈5, 000 proteínas) codifica para las proteínas extracelulares, que, dada su relevancia y accesibilidad a medicamentos sistemáticamente entregados, representan objetivos claves para el desarrollo de drogas¹. Por lo tanto, proteínas extracelulares representan más del 70% de los objetivos de la proteína con acción farmacológica conocida de medicamentos aprobados en el mercado, conocido como el "proteoma druggable". A pesar de su importancia y abundancia, las redes de interacción (ePPI) proteína extracelular siendo muy subrepresentadas en las bases de datos disponibles. Esto es fundamentalmente debido a la complejidad bioquímica de las proteínas extracelulares, que impide su caracterización utilizando tecnologías más disponibles². En primer lugar, las proteínas de membrana son difíciles de solubilizar, un proceso que implica a menudo las condiciones de lavado áspero y detergentes; en segundo lugar, proteínas extracelulares a menudo carecen de relevantes modificaciones post-traduccionales como glicosilación que están ausentes cuando estas proteínas se expresan en comúnmente utilizados sistemas heterólogos. Finalmente, las interacciones entre los receptores, tales como co receptores expresados en las células inmunes, suelen ser transitorios y caracterizado por afinidades muy bajo (K_D en el ~ 1 μM a > rango μM 100). En conjunto, la naturaleza de estas proteínas y su enlace de socios hacen más ampliamente utilizado tecnologías como afinidad purificación/espectrometría de masas (AP/MS) o levadura-dos-híbrido, inadecuado para la detección de interacciones en el espacio extracelular ^{2 , 3}.

En un esfuerzo por superar estos desafíos técnicos y acelerar el descubrimiento de nuevas interacciones de proteínas extracelulares, hemos desarrollado una cobertura alta proteína extracelular microarray^4,5. Microarrays ofrecen la ventaja de generar superficies de alta densidad con pequeñas cantidades de muestra y son generalmente susceptibles a estudios de alto rendimiento. Estudios basados en microarrays de la proteína anteriormente han proporcionado penetraciones relevantes en las interacciones de la proteína para varios organismos modelo, aunque centrándose principalmente en interacciones citosólicas o proteína específica familias^{6,7, 8}. Por el contrario, trabajo limitado se ha hecho para investigar las interacciones de la proteína extracelular utilizando esta tecnología. Hemos desarrollado un método de microarrays de proteínas para permitir estudios de ePPIs mediante la construcción de una biblioteca amplia y muy diversa de purificado proteínas secretadas y solo receptores transmembranales de (STM) expresan como recombinantes dominios extracelulares (ECD) fusionados a tags comunes para afinidad purificación⁴. El éxito de las pantallas de microarrays de la proteína depende en gran medida la creación de una biblioteca de proteína de alta calidad. Para la expresión de la proteína de la biblioteca y la consulta, células mamíferas o insectos fueron elegidos preferentemente como sistemas de expresión heteróloga, para asegurar la adecuada incorporación de modificaciones post-traduccionales como la glicosilación o disulfuro de bonos. SDS-PAGE, cromatografía por exclusión de tamaño y luz laser multi-angulo de dispersión son técnicas comúnmente utilizadas para evaluar la calidad de la proteína recombinante. La biblioteca de la proteína entonces es vista en diapositivas epoxysilane y almacenada a-20 ° C para uso a largo plazo. Concentraciones de proteína por encima de 0,4 mg/mL se recomiendan para el protocolo que se describe a continuación. Por lo tanto, baja expresando proteínas pueden requerir un paso de concentración antes de la impresión de la muestra y almacenamiento. Sin embargo, la principal ventaja de esta técnica es la escasa cantidad de proteína necesaria (50 μg de proteína es suficiente para llevar a cabo > 2.000 pantallas), junto con el consumo de proteínas de consulta mínima (20-25 μg por pantalla de duplicados). Utilizando el protocolo y el equipo descrito aquí, y siempre que las bibliotecas están disponibles, se pueden generar resultados para proteínas individuales de la consulta dentro de un día de trabajo.

Un desafío importante en la detección de interacciones de proteínas en el ambiente extracelular surge de su naturaleza característico débil o transitoria, que impide la identificación de metodologías más utilizadas. Aumentar la avidez de Unión grandemente mejora la sensibilidad para la detección de proteína débiles interacciones^9,10,11. Basado en este principio se desarrolló un método para multimerize las proteínas de la consulta (expresadas como Fc fusión) usando proteína de granos recubiertos A^4,5. Para evitar cualquier potencial inactivación de la proteína de la consulta por etiquetas al azar, en cambio etiqueta una irrelevante inmunoglobulina humana G con Cy5 y añadirlo junto con la proteína de la consulta a las perlas de proteína A, eliminando así cualquier artefactos debido a la conjugación directa de un colorante a la proteína de interés. Teniendo en cuenta las afinidades micromolar de varios pares de co-receptor, los complejos multivalentes mejoran relación señal a ruido, comparado con las proteínas de consulta de fusión Fc proyectadas como proteínas solubles⁴.

En Resumen, el objetivo de este protocolo es describir la preparación de microarray diapositivas que contiene una biblioteca de proteína extracelular preexistente para la identificación de las interacciones receptor-ligando. Repasamos los pasos para la diapositiva de la impresión, seguido de un protocolo para la detección de una proteína de interés contra la biblioteca de proteína extracelular. Por otra parte, se describe un método para la detección mejorada de ePPIs basados en microesferas para lograr mayor avidez de la proteína bajo estudio. La tecnología de microarrays de la proteína extracelular descrita aquí representa un enfoque rápido, robusto y eficaz para la investigación y detección de ePPI novela con baja proporción de falsos positivos y utilizando solamente cantidades de microgramos de la proteína de consulta bajo investigación. Esta tecnología ha impulsado varios estudios que han proporcionado penetraciones relevantes en funciones celulares desconocidas y vías de señalización para una variedad de receptores^12,13, incluyendo virales immunoregulators¹⁴, y pueden ser utilizados para la orphanize cualquier proteína extracelular de interés.

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Protocolo

1. generación de una biblioteca de extracelulares proteínas humanas

1. Compilar una lista de receptores de superficie celular o proteínas secretadas de interés para la construcción de la biblioteca de microarrays de proteínas. Familias de proteínas específicas (por ejemplo, la superfamilia de las inmunoglobulinas) o proteínas selectivamente expresan en particular tipos pueden seleccionarse para el estudio de la célula.
2. Para receptores de superficie celular, determinar los límites del dominio extracelular (ECD), identificando las regiones transmembranales utilizando herramientas de software y péptido señal. Algunas de las herramientas, libremente disponibles en línea, se hace referencia en la Tabla de materiales^15,16,17,18.
3. Sintetizar el DIT para los genes de interés y clon en el vector correspondiente. Proteínas secretadas o los receptores de ECD de STM fusionados a un número de etiquetas de afinidad común pueden ser purificados de los medios condicionados de células transfectadas con el vector adecuado, o de sistemas de expresión de células de insecto baculovirus.
   Nota: Los sistemas basadas en células mamíferos (como HEK/293 células CHO) se recomiendan para maximizar la probabilidad de plegamiento de la proteína adecuada y además de las modificaciones postraduccionales como la glicosilación.
4. Purificar las proteínas mediante métodos de purificación de la afinidad estándar. Esfuerzos anteriores han descrito procedimientos automatizados o semi-automatizados adecuados para la purificación de cientos de proteínas, que se pueden escalar para generar el conjunto de proteínas de interés^{9,19,20, 21}.
   Nota: SDS-PAGE, cromatografía por exclusión de tamaño (S) o láser multi-angulo luz dispersa (centros comerciales) se recomienda para evaluar cualquier agregación no covalentes y para controlar la calidad de las preparaciones de proteínas.
5. Ajustar las proteínas a 200 o 400 μg/mL en la medida de lo posible y diluir las existencias con glicerol al 80% para el almacenamiento a largo plazo en viales criogénicos a-20 ° C. Estos representan acciones principales y deben accederse sólo cuando sea necesario.
6. Transferir alícuotas de cada proteína (100 μL) para placas de 96 pocillos (chapa), sellar con hoja adhesiva y almacenar a-20 ° C hasta que la preparación de los portaobjetos de microarrays. Chapa se genera para reducir ciclos de congelación-descongelación y asegurar la estabilidad de la proteína.

2. impresión de microarrays de la proteína extracelular

1. Utilice un microarrayer estándar para la impresión de la diapositiva. El instrumento utilizado para el protocolo descrito aquí tiene una capacidad de 57 diapositivas y correr y utiliza un cabezal de impresión con 48 pernos de localización. Estos pernos generar manchas de ~ 100 μm de diámetro separados por una distancia de punto a punto de ~ 350 μm y dibuja 0,25 μL por carga. Bajo esta configuración, hasta 8.000 puntos por diapositiva se pueden acomodar.
2. Generar trabajo placas (placas bien 384, 10 μL de muestra/pozo) de la chapa. Realizar este paso manualmente antes de la impresión de diapositivas utilizando el microarrayer. Proteínas entonces, lugares con los pernos telescopio tipo pluma en epoxysilane se desliza en el 60% de humedad (para evitar deshidratación de las manchas de proteína).
   Nota: Marcado con Cy3 albúmina de suero bovino (BSA) se pueden observar en los duplicados entre cada muestra de proteína (5 μg/mL de glicerol PBS/40%) para visualizar la matriz para el montaje de la máscara (ver sección 4). Si bien se recomienda, este paso es opcional.
3. Con posterioridad a la impresión, retire las diapositivas de microarrays de la proteína del ambiente humidificado y bloquean toda la noche con leche de 5% en SAFT para inactivar la superficie.
   Nota: El método preferido es usar un nebulizador ultrasónico para generar una niebla fina de bloquear la solución que se instala sobre la superficie del portaobjetos.
4. Almacenar diapositivas a-20 ° C en glicerol al 50% para evitar la congelación.

3. preparación de complejos de cebo polivalente

Nota: Las interacciones entre las proteínas extracelulares se caracterizan a menudo por afinidades bajas. Para habilitar la detección de estas interacciones al aumentar la avidez de la Unión, un enfoque polivalente basado en capturar a la proteína de la consulta, expresada como Fc-tagged ECD, microesferas recubiertas A proteína fue desarrollada⁴.

1. Marque el portador IgG utilizado para detección con tinte de monoreactive Cy5 y separar el tinte gratis utilizando columnas de desalación. Determinar el tinte a las relaciones de proteína mediante la medición de la absorbancia ULTRAVIOLETA a 280 y 650 nm.
   Nota: Normalmente se utilizan proporciones de proteína-colorante entre 2.0 y 4.0. Se recomienda hacer girar los conjugados de Cy5 a 100.000 x g durante 15 min eliminar los posibles agregados solubles debido al proceso de etiquetado.
2. Determinar la relación óptima de proteína de microbead valoración de proteína contra una cantidad constante de la proteína de la consulta. El volumen mínimo de saturación de granos donde ninguna proteína gratis tagged Fc sigue siendo, como es medido usando un análisis competitivo determinado por interferometría de biocapa, se utiliza para la proyección.
3. Formar los complejos de proteínas del microbead incubando la consulta tagged Fc y Cy5-IgG con microesferas de proteína A y la mezcla en un agitador de tubo en PBS durante 30 min a temperatura ambiente protegido de la luz.
4. Para formar estos complejos, utilizar la proteína de la consulta a una concentración final de 20 μg/mL. Para calcular la fracción molar de la proteína de la consulta y Cy5-IgG, dividir el peso molecular de la proteína de la consulta por el peso molecular de la IgG (150.000 Da) y multiplicar por 40 μg/mL para determinar la concentración de IgG de Cy5 necesario.
5. Complementar las muestras con una (1 mg/mL) inmediatamente antes de la incubación con el microarray diapositivas (ver sección 4.2) para evitar atascamiento de cualquier proteína libre A los granos a la proteína de fusión Fc que puede estar presente en la matriz de proteína soluble.
   Nota: El volumen de reacción final puede variar dependiendo de la cámara de incubación o estación de hibridación utilizada. La instrumentación que se describe en la Tabla de materiales permite la incubación de la muestra con volúmenes relativamente pequeños (~ 200 μL por portaobjetos).

4. extracelular proteína Microarray de detección y tratamiento.

Nota: Hay un número de fabricantes que ofrecen plataformas de procesamiento automático. Si no hay una estación de hibridación, los pasos siguientes pueden realizarse manualmente, asegurando que no hay suficiente volumen de tampón para mantener las diapositivas sumergido en todo momento.

1. Caliente las diapositivas en temperatura ambiente y enjuagar con PBS/0.1% Tween 20 (SAFT) para eliminar el glicerol residual antes de la carga a la estación de hibridación.
2. Utilizar el protocolo de investigación siguientes:
   1. Lavar con SAFT para 1 minuto.
   2. 200 μL de proteína 1 mg/mL en la leche PBS/5% de carga e incubar durante 30 min evitar la proteína de uncomplexed un microesferas de unión a las proteínas con etiqueta Fc que pueden estar presentes en el microarray.
   3. Lavar cinco veces con SAFT para 1 minuto.
   4. Carga 200 μL de la consulta: microbeads del complejo en presencia de proteína 1 mg/mL e incubar durante 30 min.
   5. Lavar con SAFT para 1 minuto.
3. Después de la hibridación, enjuague los portaobjetos con agua, coloque en los tubos cónicos de 50 mL y seque girar a 900 x g durante 5 minutos.
4. Por último, analizar las diapositivas con un escáner de microarreglos apropiado para detectar Cy3 (si ha sido impresa BSA-Cy3) y Cy5 fluorescencia por excitar en 532 y 635 nm, respectivamente.
5. Realizar el análisis de los datos mediante el análisis de datos microarray que lo acompaña. La lista correspondiente de la matriz (como un archivo .gal) se carga en el software de extracción de datos. En esta etapa, se utilizan los puntos Cy3-BSA para encontrar bloques y utilice las opciones de ajuste automático en el software, seguido por la alineación manual de las funciones cuando sea necesario. Guardar los archivos como archivos de .gpr para su posterior análisis.

5. Análisis de datos

1. Guardar los datos como archivos GPR y proceso en R usando el paquete limma, comúnmente utilizado para el análisis de microarray de datos^4,5.
   1. Para el preprocesamiento, Fondo de corrección y normalización dentro de la diapositiva. Puesto que cada proteína es impreso en puntos duplicados, combinar ambas mediciones replicadas para crear una cuenta solo para la proteína en la biblioteca.
   2. Calcular puntuaciones para cada diapositiva y analizar los resultados para el cruce de candidatos alta puntuación entre las diapositivas.
   3. Utilice microarrays duplicados de diferentes tiradas para control de variabilidad de la diapositiva y parcelas de intersección que representa datos de dos pantallas llamar hits finales.
   4. Por último, realizar un nivel adicional de filtrado para excluir promiscuas proteínas dentro de la matriz. Estas carpetas no específicos son identificados como proteínas superior a un umbral específico frecuencia definida por el usuario a través de pantallas independientes.
      Nota: Este protocolo se describe en detalle en Tom et al 2013⁵. En nuestro caso la carpeta no específica llamada se basa en la determinación de la acumulativa presa tarifa de golpe, y se utiliza un umbral de eliminación basada en datos del 5%.

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Resultados

Figura 1muestra un esquema del flujo de trabajo para la tecnología de microarrays de proteínas extracelulares. Una vez disponibles las diapositivas de microarrays que contiene la biblioteca de la proteína extracelular, la proyección de la proteína de interés y análisis de datos puede completarse en un día. Muchas interacciones fisiológicamente relevantes entre receptores de membrana integrado se caracterizan por fuerzas de enlace muy débil (K_D<...

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Discusión

Un número significativo de receptores huérfanos permanece en el genoma humano, y nuevos socios interactúan siguen apareciendo para proteínas extracelulares con ligandos previamente caracterizados. Definición de las interacciones ligando-receptor en humanos y organismos modelo es esencial para comprender los mecanismos que determinan la comunicación celular durante la homeostasis, así como desregulación conduce a la enfermedad y por lo tanto informar de nuevos o mejorados opciones terapéuticas. Sin embargo, la de...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultra Pure MB Grade glycerol	USB Corporation	56-81-5	Protein storage
SeptoMark blocking buffer	Zeptosens	BB1, 90-40	Blocking buffer microarray slides
Bovine serum albumin	Roche	03-117-957-001	Slide control for mask fitting (optional)
Polypropylene multiwell plates	Greiner Bio One	82050-678	Protein storage
Polypropylene multiwell plates	Arrayit	MMP384	Slide printing
NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer	Arrayit	NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer	Slide printing
Micro spotting pins	Arrayit	Micro spotting pins	Slide printing
ZeptoFOG blocking station	Zeptosens	ZeptoFOG blocking station, 1210	Block slides after printing
Skim milk powder	Thermo Fisher	LP0031	Blocking solution
Epoxysilane-coated glass slide	Nextrion Slide E	1064016	Microarray slides
Glass holder and slide rack set	Wheaton	900303	Slide storage
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA23031	Albumin labeling
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001	Human IgG labeling
Pro-spin desalting column	Princeton Separations	CS-800	Remove free dye
Adhesive aluminum foil seal	AlumaSeal	F-384-100	Seal stock plates
Polypropylene cryogenic vials	Corning	430658	Master vials for protein library storage
Protein A microbeads	Miltenyi	120-000-396	Query protein multimerization
Human IgG	Jackson Immunoresearch	009-000-003	Irrelevant IgG for labeling
Protein A	Sigma	P7837	Microarray slide blocking
Hybridization station, a-Hyb or similar	Miltenyi	Hybridization station, a-Hyb or similar	Automated microarray processing (optional)
GenePix 4000B scanner or similar	Molecular Devices	GenePix 4000B scanner or similar	Slide scanning
GenePix Pro or equivalent data extraction software	Molecular Devices	GenePix Pro or equivalent data extraction software	Data processing
Signal P4.1	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	online software	Prediction tool to determine presence and location of signal peptide cleavage sites
TMHMM 2.0 server	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	online software	Prediction of transmembrane helices in proteins
Phobius	Stockholm Bioinformatics Center	online software	A combined transmembrane topology and signal peptide predictor
TOPCONS	Stockholm University	online software	Prediction of membrane topology and signal peptides