JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذه الدراسة، قمنا بتعديل أسلوب تجريبي موجود للحصول على المزيد من النتائج استنساخه، بوضع نموذج ماوس (ماكاو) انسداد شريان دماغي الأوسط. الإدارة عن طريق الفم من الرقم الأساسي جليسيرهيزاي et جذمور (GR) استخراج الميثانول (جر)، عقب التعريفي السكتة الدماغية، وتناقص حجم احتشاء مجموع مقارنة بمجموعة التحكم غير المعالجة.

Abstract

الاسكيمية تليها ضخه تدفق الدم الدماغي بعد السكتة دماغية يؤدي إلى موت الخلايا العصبية وفقدان أنسجة الدماغ. نموذج الحيوان الأكثر استخداماً لدراسة السكتة الدماغية هو النموذج (ماكاو) انسداد الشريان الدماغي الأوسط. وأفادت الدراسات البحثية السابقة احتشاء مختلفة الأحجام حتى عندما كان يستخدم نفس الأنواع الحيوانية التجريبية ماكاو في ظروف مماثلة. ولذلك، قمنا بتطوير طريقة تجريبية محسنة لمعالجة هذا التناقض. الفئران تعرضوا إلى ماكاو باستخدام خيوط كمادة انسداد لتقليد الشروط السكتة الدماغية البشرية وسمك الشعيرة الأمثل لإنشاء المزيد من حجم احتشاء استنساخه. استخراج الفئران تعامل مع ميثانول من الرقم الأساسي جليسيرهيزاي et جذمور (جر) عقب التعريفي السكتة الدماغية أظهرت وحدة تخزين احتشاء مجموع انخفض إلى حد كبير وزيادة عدد الباقين على قيد الحياة الخلايا مقارنة بمجموعة التحكم غير المعالجة. وهذا تعديل البروتوكول التجريبي بنجاح وتكاثر أثبتت الآثار المفيدة لجر على السكتة الدماغية.

Introduction

تلف في المخ بسبب الاسكيمية وضخه من تدفق الدم الدماغي يؤدي إلى موت الخلايا العصبية وفقدان أنسجة الدماغ. وتواصل هذا النوع من تلف الدماغ تزيد مع تزايد انتشار الأمراض المخية الوعائية نتيجة لانتشار الأمراض الأيضية مثل السمنة وارتفاع ضغط الدم ومرض البول السكري1،2. العدد المطلق للمرضى المسنين مع السكتة الدماغية زاد زيادة كبيرة في جميع أنحاء العالم، وتكلفة الرعاية الطبية لهؤلاء المرضى، الذين كثيرا ما تترك ذوي الإعاقة طويلة الأمد، عبء مجتمعية رئيسية. ولذلك، ينبغي تخفيف الإعاقات الثانوية إلى أقصى حد ممكن للحد من العبء الاقتصادي1،2.

نموذج احتشاء دماغي القوارض الأكثر استخداماً هو النموذج (ماكاو) انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCA)، التي تغطي هيئة مكافحة الاحتكارات مع خيوط سوتورينج جراحية المغلفة بالسليكون لمنع تدفق الدم، مما تسبب في إصابة بالسكتة الدماغية3، 4-استخدام خيوط من المواد انسداد يتيح مراقبة انسداد الوقت والدوام عن طريق التلاعب في مدة الإدراج داخل لومينال الشعيرة.

وقد أظهرت الدراسات السابقة أن حتى عندما يتم استخدام نفس نموذج مكاو القوارض، يختلف الحجم الإجمالي لاحتشاء الدماغية بين التجارب، مما تسبب في انخفاض إمكانية تكرار نتائج الدراسات. لتحسين إمكانية تكرار نتائج، نحن الأمثل سمك منت الشعيرة التي استخدمت في التجربة. نتائج دراسة أولية لفترة السكتة الدماغية واحتشاء المستحث أظهرت أن فترة الدماغية أطول من 60 دقيقة سمح المنطقة الحجمي لتلف أنسجة المخ مراعاتها وتقديرها كمياً.

Radix جليسيرهيزاي et ريزوما (GR)، يعرف أيضا باسم عرق السوس، وتتألف من الجذور المجففة وجذور من أورالينسيس غلابرا و العرقسوس غ. قد استخدمت في الطب التقليدي الصيني والكوري لأغراض مختلفة بما في ذلك المضافات الغذائية وطبي5،6،7.

في سابق دراسة8، معالجة المسبقة مع استخراج الميثانول الموارد الوراثية (جريكس) وأظهرت تأثير apoptotic مكافحة الفئران مكاو، بما في ذلك منع كبير من هذا الانخفاض في تعبير البروتين من سرطان الغدد الليمفاوية الخلية-ب 2 (Bcl-2) وخارج كبيرة Bcl (Bcl-xL). أجريت هذه الدراسة تحسين إمكانية تكرار نتائج نموذج الماوس ماكاو التقليدية عن طريق تقييم كفاءته في تحديد ما إذا كان العلاج ما بعد احتشاء بجر فعالية خفض حجم احتشاء في الأضرار الدماغية الناجمة عن ماكاو.

Protocol

جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات بموافقة لجنة الأخلاقيات التابعة لجامعة بوسان الوطنية (رقم الاعتماد، بنو-2016-1087). ويرد في الشكل 1نظرة عامة رسومية لهذه الدراسة.

1-إعداد وإدارة لجر

ملاحظة: الموارد الوراثية المستخدمة في هذه الدراسة تم شراؤها من شركة تجارية للأدوية.

  1. 200 جرام من الموارد الوراثية في مل 2,000 من الميثانول واحتضان في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) لمدة 5 أيام.
  2. تصفية هذا الخليط باستخدام ورق الترشيح مع سمك 0.26 مم و 5 حجم المسام ميكرومتر، ثم قم بإزالة المادة طافية. إضافة مل 1,000 من الميثانول إلى بقايا غرام وتصفية مرة أخرى.
  3. الجمع بين سوبيرناتانتس اثنين وتصفيتها من خلال تصفية الورق والتركيز تحت الفراغ وثم فريزيدري بقايا لإنتاج جر.
  4. حل جريكس في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، مخفف مع المحلول الملحي الفيزيولوجي 0.9%، وتصفية من خلال عامل تصفية حقنه 0.45 ميكرومتر. ثم ضبط تركيز النهائية [دمس] < 5%.
  5. إدارة جر (300 ملغ/كغ من وزن الجسم) ح 1 بعد ضخه من ماكاو عبر تزقيمية الشفوي. إدارة [دمس] مخففة في المحلول الملحي الفسيولوجي (10 مل/كغ من وزن الجسم) فقط إلى المجموعة العادية ومجموعات المراقبة، على التوالي.
    ملاحظة: تركيز جر المستخدمة في هذه التجربة مصممة وفقا لتركيز التي كانت نشطة من خلال موقعنا الدراسة السابقة8.

2-الفأرة النموذجي من ماكاو

  1. استخدام الفئران C57BL/6 الذكور الذين تتراوح أعمارهم بين 6 أسابيع ووزنها 22-25 غ. توفر جميع الحيوانات مع حرية الوصول إلى تشو القياسية، والمياه، والبيت لهم في بيئة ذات حرارة مضبوطة (22 ± 1 درجة مئوية) ودائرة ضوء/الظلام ح 12.
    1. قم بتقسيم الفئران إلى مجموعات من الفئران ستة كل، التي ينبغي أن تتكون من العادي تعمل بالشام، والتحكم، وجر معاملة الجماعات.
    2. إجراء عمليات جراحية ماكاو (تعديل أسلوب كويزومي et al. 9) المتعلقة بمراقبة وجر معاملة مجموعات باستخدام مجهر ستيريو.
  2. حمل التخدير استنشاق في الفئران باستخدام إيسوفلوراني 2% في 70% ن2س و 30% O2. ويعتبر التخدير كافية عندما يصبح الماوس لا يستجيب للتحفيز الميكانيكية المطبقة على ذيله. الحفاظ على درجة حرارة الجسم للفئران عند 36.5 ± 0.5 درجة مئوية استخدام جسم درجة الحرارة-عقد شامل متصل بمقياس حرارة.
  3. إزالة جميع شعر صدورهم واعناق الفئران بحلق متبوعاً باستخدام كريم لإزالة الشعر، تطهير الموقع الجراحي للجلد مع فرك تدين بالتناوب مع الكحول لمرتين، ومن ثم جعل شق من 2 سم تقريبا منذ فترة طويلة مع العمليات الجراحية شفرة في وسط العنق. عزل بعناية الشريان السباتي المشترك الأيسر (لككا) والشريان السباتي الخارجي، وفرع الشريان السباتي الداخلي من الأنسجة الضامة المحيطة.
  4. سد الشريان السباتي الخارجي والشريان السباتي المشترك مع خياطة جراحية (خياطة الحرير 4-0، عقبة نصف عقده) مؤقتاً عرقلة تدفق الدم في الشريان السباتي الداخلي أثناء العملية.
  5. إدراج خياطة نايلون المغلفة بالسيليكون (شعيرات 8-0، 11 مم طويل) عن طريق الشريان السباتي الداخلي لمنشأ MCA الأيسر. ضبط سمك الجزء المغلفة بالسيليكون للشعيرة إلى طائفة من 0.10-0.12 ملم.
  6. قياس الانخفاض في تدفق الدم الدماغي النسبي (rCBF) في هيئة مكافحة الاحتكارات باستخدام مقياس دوبلر التدفق على ليزر. وسيتم تأكيد مكاو عندما يحتفظ rCBF في < 20% من القيم شرط يستريح خلال كامل الفترة الدماغية.
  7. إصلاح خيوط المدرج للأوعية الدموية ح 2 بينما هو تغطي الشريان الدماغي، وثم سحب خيوط لاستعادة تدفق الدم ح 22 من ضخه بعناية. خياطة الجلد بالخياطة في أماكن 5 (3-0 خياطة الحرير، عقده اثنين نصف عقبات) والسماح لكل الماوس توقظ من التخدير.
  8. في المجموعة العادية، القيام بعملية شام اتباع نفس الإجراء أعلاه (حتى 2.4)، مع الاستثناء التالي. سد الشريان السباتي المشترك وخياطة قطعي العضلات والجلد.

3-قياس حجم الأنسجة التالفة في المخ

  1. بعد القتل رحيم الفئران لقياس تلف المخ مع استنشاق أول أكسيد الكربون2 ، العقول المكوس الماوس 24 ساعة بعد البداية ماكاو باستخدام مقص جراحي آيريس والملقط الزاوية.
    1. بعد إزالة الرأس باستخدام مقص، جعل شق في الجلد خط الوسط من الرأس إلى الوجه عبر الجلد من الجمجمة.
    2. كسر عظام الجداري مع الملقط الزاوية، تقشير قبالة بلده دوراً مهما في الوقت نفسه، وثم عزل الدماغ بعناية من الجمجمة.
  2. قطع الأنسجة قصت إلى أقسام (1 مم) باستخدام مصفوفة الدماغ ماوس، وثم وصمة عار المقاطع ل 17 دقيقة في محلول من كلوريد 2,3,5-تريفينيلتيترازوليوم 2% (عقاري).
  3. إصلاح المقاطع في الفورمالين 10% على الأقل من 2 ح وثم التقاط صور لهم باستخدام كاميرا رقمية. وسيتبع عقاري وصمة عار أحمر الأنسجة قابلة للحياة بينما ستكون مناطق نخرية بيضاء.
  4. تحليل وتحديد منطقة احتشاء دماغي من كل قسم باستخدام إيماجيج.

4-توضع وويوزين (H & E) وكريسيل تلطيخ البنفسجي من أقسام نسيجية

  1. Euthanize الفئران لدراسة نسيجية باستنشاق أول أكسيد الكربون2 ونتخلل لهم ترانسكارديالي مع 10 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS)، تليها 10 مل من 4% بارافورمالدهيد (منهاج عمل بيجين). عزل الدماغ باستخدام نفس الإجراءات أعلاه (3.1) وتزج في الدماغ في 10 مل من محلول السكروز 30% بين عشية وضحاها.
  2. تضمين أنسجة المخ في قطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) مركب وشريحة التاج إلى أقسام 15-ميكرومتر-سميكة من كريوستات باستخدام. تحميل المقاطع على الشرائح الزجاجية، متبوعاً بتلوين الهيماتوكسيلين وويوزين (H & E) أو البنفسجي كريسيل.
  3. تزج الشرائح الزجاجية في الإيثانول 80% لمدة 1 دقيقة تليها تلطيخ في الحل توضع لمدة 5 دقائق.
    1. تراجع الشرائح في الكحول حمض 1% مرتين، وتزج في محلول كربونات الليثيوم مشبعة لمدة 30 s، أغسل بماء الصنبور عن 30 ثانية، ثم كونتيرستين في الحل ثم لمدة 30 ثانية.
    2. شطف الشرائح في ماء الصنبور، نقع في 95% والإيثانول المطلقة تباعا.
    3. أيردري الشرائح، واضحة لهم في زيلين نفط لمدة 10 دقيقة على الأقل، ومن ثم تحميل كوفيرسليبس استخدام المتوسط المتصاعدة.
  4. ضع الشرائح الزجاجية على شريحة الأكثر دفئا على الأقل 1 ح، متبوعاً بالانغماس في الإيثانول 50% المخفف مع كلوروفورم بين عشية وضحاها.
    1. وصمة عار الشرائح مع 0.1% كريسيل البنفسجي لمدة 10 دقيقة في فرن جافة 40 درجة مئوية.
    2. تزج في الإيثانول 95% لمدة 30 دقيقة، ثم يذوي في الإيثانول المطلقة لمرات 2.
    3. قم بمسح 2 مرات في زيلين نفط لمدة 5 دقائق، ثم جبل مع تصاعد المتوسطة بعد تجفيف الهواء.
  5. استخدام مجهر، لاحظ النسيجي التغييرات التي حدثت بعد إصابة في الدماغ الناجم عن ماكاو.

5-إحصائية تحليل

  1. التعبير عن النتائج التجريبية كوسائل ± الانحراف المعياري وتحديد الدلالة الإحصائية بين المجموعات اتجاه واحد تحليل تباين (ANOVA) تليها تحليل توكي الوظائف المخصصة باستخدام برنامج تحليل بيانات باستخدام.
  2. تعيين الدلالة الإحصائية في فقيمه < 0.05.

النتائج

من الملاحظ لا احتشاء دماغي في المجموعة العادية تعمل بالشام، بينما يلاحظ في مجموعة مراقبة، مجموعة واسعة نسبيا من المناطق المتضررة. ويلاحظ تدار 300 ملغ/كغ جر في ماكاو نموذج المجموعة، انخفاض يعتد به إحصائيا في المنطقة المتضررة في الفئران (الشكل 2).

Discussion

مع تزايد انتشار أمراض التمثيل الغذائي مثل ارتفاع ضغط الدم المزمن، ومرض السكري، والدهون، وعوامل الخطر الرئيسية للسكتة الدماغية، منع السكتة الدماغية والعلاج قد أصبحت مجالاً هاما للبحوث الطبية12، 13-العجز في اللغة والحركة بعد السكتة دماغية ترتبط بقوة مع درجة ...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

غير قابل للتطبيق.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Glycyrrhizae Radix et RhizomaGwangmyoung Pharmaceuticals Co., KoreaGlycyrrhizae Radix et Rhizoma
Qualitative filter paperAdvantecFilter paper No. 2Qualitative filter paper
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD8418-250MLDimethyl sulfoxide (DMSO)
Syringe filter (0.45 µm)SigmaCLS431220Syringe filter (0.45 µm)
Stereo MicroscopeLeicaM50Stereo Microscope
Stereo MicroscopeNikonSMZ745Stereo Microscope
Laser DopplerMoor InstrumentmoorVMS-LDFLaser Doppler
Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter SystemHarvard Appratus34-1352Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System
Homeothermic Monitoring SystemHarvard Appratus55-7020Homeothermic Monitoring System
Digital CameraCanonEos-M2Digital Camera
CryostatLeicaCM3050SCryostat
MicroscopeCarl ZeissZeiss AxioMicroscope
Data AnalysisSystat Software Inc.SigmaPlot version 12Data Analysis
Data AnalysisNIH ImageImageJData Analysis
Mouse dietDoo Yeol BiotechStandard rodent chowMouse diet
IsofluraneJOONGWAEA02104781Isoflurane
IsofluraneTROIKAAISOTROY 100Isoflurane
Silk suture (4-0 Black silk) AILEESK47510Silk suture (4-0 Black silk) 
Silk suture (3-0 White silk) Baekjae57Silk suture (3-0 White silk) 
Nylon suture (8-0 monofilament) AILEENB825Nylon suture (8-0 monofilament) 
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)SigmaT8877-25G2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)
Formalin (Formaldehyde solution)JUNSEI69360-1263 20KGFormalin (Formaldehyde solution)
Hematoxylin (Harris Hematoxylin)YD DiagnosticsEasyStainHematoxylin (Harris Hematoxylin)
Eosin (1% Eosin Y Solution)MUTO PURE CHEMICALS3200-2Eosin (1% Eosin Y Solution)
Cresyl violet (acetate)SigmaC5042-10GCresyl violet (acetate)
Paraformaldehyde Sigma-AldrichP6148-1KGParaformaldehyde 
SucroseJUNSEI31365-0350 1KGSucrose
Optimum cutting temperature (OCT) compoundScigen4583Optimum cutting temperature (OCT) compound
Disecting KnifeFine Science Tools10055-12Disecting Knife
#4 ForcepFine Science Tools11241-30#4 Forcep
#5 ForcepFine Science Tools11254-20#5 Forcep
#6 ForcepFine Science Tools11260-20#6 Forcep
#7 Fine ForcepFine Science Tools11274-20#7 Fine Forcep
Surgical ScissorsFine Science Tools14001-12Surgical Scissors
Extra Fine Bonn ScissorsFine Science Tools14084-08Extra Fine Bonn Scissors
Moria Pascheff-Wolff Spring ScissorsFine Science Tools15371-92Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors
Vessel Dilating ForcepFine Science Tools18153-11Vessel Dilating Forcep

References

  1. Bejot, Y., Delpont, B., Giroud, M. Rising stroke incidence in young adults: more epidemiological evidence, more questions to be answered. Journal of the American Heart Association. 11 (5), (2016).
  2. Hadadha, M., Vakili, A., Bandegi, A. R. Effect of the inhibition of hydrogen sulfide synthesis on ischemic injury and oxidative stress biomarkers in a transient model of focal cerebral ischemia in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 24 (12), 2676-2684 (2015).
  3. Durukan, A., Tatlisumak, T. Animal models of ischemic stroke. Article in Handbook of Clinical Neurology. 92, 43-66 (2009).
  4. Kim, D. Animal Models of Stroke. Brain and Neurorehabilitation. 4 (1), 1-11 (2011).
  5. Rizzato, G., Scalabrin, E., Radaelli, M., Capodaglio, G., Piccolo, O. A new exploration of licorice metabolome. Food Chemistry. 221, 959-968 (2017).
  6. Zhu, Z., et al. Rapid determination of flavonoids in licorice and comparison of three licorice species. Journal of Separation Science. 39 (3), 473-482 (2016).
  7. Ota, M., Mikage, M., Cai, S. Q. Herbological study on the medicinal effects of roasted licorice and honey-roasted licorice. Yakushigaku Zasshi. 50 (1), 38-45 (2015).
  8. Lim, C., et al. Licorice pretreatment protects against brain damage induced by middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Medicinal Food. 21 (5), 474-480 (2018).
  9. Koizumi, J. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. Nosotchu. 8 (1), 1-8 (1986).
  10. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  11. Zhu, Y., Liu, F., Zou, X., Torbey, M. Comparison of unbiased estimation of neuronal number in the rat hippocampus with different staining methods. Journal of Neuroscience Methods. 254, 73-79 (2005).
  12. Alberts, M. J., Ovbiagele, B. Current strategies for ischemic stroke prevention: role of multimodal combination therapies. Journal of Neurology. 254 (10), 1414-1426 (2007).
  13. Pinto, A., Tuttolomondo, A., Di Raimondo, D., Fernandez, P., Licata, G. Cerebrovascular risk factors and clinical classification of strokes. Seminars in Vascular Medicine. 4 (3), 287-303 (2004).
  14. Barlow, S. J. Identifying the brain regions associated with acute spasticity in patients diagnosed with an ischemic stroke. Somatosensory and Motor Research. 33 (2), 1-8 (2016).
  15. Roth, S., Liesz, A. Stroke research at the crossroads - where are we heading. Swiss Medical Weekly. 146, 14329 (2016).
  16. Feuerstein, G. Z., Wang, X. Animal models of stroke. Molecular Medicine Today. 6 (3), 133-135 (2000).
  17. Herson, P. S., Traystman, R. J. Animal models of stroke: translational potential at present and in 2050. Future Neurology. 9 (5), 541-551 (2014).
  18. Kumar, A., Gupta Aakriti, V. A review on animal models of stroke: an update. Brain Research Bulletin. 122, 35-44 (2016).
  19. O'Collins, V. E., Donnan, G. A., Howells, D. W. History of animal models of stroke. International Journal of Stroke. 6 (1), 77-78 (2011).
  20. Ji, S., et al. Bioactive constituents of Glycyrrhiza uralensis (licorice): discovery of the effective components of a traditional herbal medicine. Journal of Natural Products. 79 (2), 281-292 (2016).
  21. Yang, R., Wang, L. Q., Yuan, B. C., Liu, Y. The pharmacological activities of licorice. Planta Medica. 81 (18), 1654-1669 (2015).
  22. Yang, R., Yuan, B. C., Ma, Y. S., Zhou, S., Liu, Y. The anti-inflammatory activity of licorice, a widely used Chinese herb. Pharmaceutical Biology. 55 (1), 5-18 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

142 Radix et

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved