应用短暂的中脑动脉闭塞小鼠模型评价甘草提取物的神经保护作用

摘要

在本研究中, 我们通过建立大脑中动脉闭塞 (mcao) 小鼠模型, 修改了现有的实验方法, 以获得更多的重现性结果。口服甘草和根状茎 (gr) 甲醇提取物 (grex), 脑卒中诱导后, 与未治疗对照组相比, 总梗死量显著降低。

摘要

脑卒中后脑血流再灌注后的缺血导致神经细胞死亡和脑组织丢失。脑卒中最常用的动物模型是大脑中动脉闭塞 (mcao) 模型。以前的研究报告了不同的梗死大小, 即使在类似的 mcao 条件下使用相同的实验动物物种。因此, 我们开发了一种改进的实验方法来解决这种差异。小鼠接受 mcao 使用长丝作为遮挡材料, 以模拟人类中风条件和灯丝厚度进行优化, 以建立更可重现的梗死体积。脑卒中诱导后用甘草提取物处理的小鼠总梗死体积明显下降, 存活细胞数量相对于未治疗的对照组有所增加。该改进的实验方案成功地和可重现地证明了 grex 对缺血性脑卒中的有益作用。

引言

脑血流缺血再灌注引起的脑损伤导致神经细胞死亡和脑组织丢失。随着肥胖、高血压和糖尿病等代谢疾病的传播, 脑血管疾病的发病率不断上升, 这种类型的脑损伤继续增加.全世界老年中风患者的绝对人数急剧增加, 这些患者的医疗费用是一个主要的社会负担, 这些患者往往患有长期残疾。因此, 应尽可能减轻继发性残疾, 以减轻经济负担^1,2。

脑梗死最常用的啮齿类动物模型是大脑中动脉闭塞 (mcao) 模型, 其中 mca 被硅涂层手术缝合长丝封闭, 以阻断血液流动, 导致缺血性中风^3,4. 使用灯丝作为闭塞材料, 可以通过控制腔内灯丝插入的持续时间来控制闭塞时间和持久性。

以往的研究表明, 即使使用相同的啮齿类动物 mcao 模型, 脑梗死的总量也因实验而异, 导致研究的重现性较低。为了提高重现性, 我们优化了实验中使用的细丝薄荷的厚度。脑缺血期和诱发梗死的初步研究结果表明, 缺血期超过 60分钟, 可以观察和量化受损脑组织的体积区域。

甘草, 又名甘草, 由甘草和葛根的干根和根状茎组成. 它已被用于中国和韩国传统医学的各种用途, 包括作为食品添加剂和药用^5,6,⁷。

在先前的一项研究⁸中, gr 甲醇提取物 (grex) 预处理显示出 mcao 小鼠的抗凋亡作用, 包括显著防止 b 细胞淋巴瘤 2 (bcl-2) 和 bcl 超大 (bcl-xl) 蛋白表达的降低。本研究通过评价传统 mcao 小鼠模型在确定 grex 在梗死后处理中的效率, 有效地降低了 mcao 所致脑损伤的梗死体积, 从而提高了该模型的重现性。

研究方案

所有涉及动物的程序都得到了釜山国立大学道德委员会的批准 (批准号码, pu-2016-1087)。图 1显示了这项研究的图形概述。

1. grex 的准备和管理

注: 本研究中使用的 gr 是从一家商业制药公司购买的。

1. 将200克 gr 放入 2, 000 毫升甲醇中, 在室温 (25°c) 下孵育5天。
2. 使用厚度为 0.26 mm、孔径为5μm 的滤纸对混合物进行过滤, 然后去除上清液。在 gr 残渣中加入1000毫升甲醇, 然后再过滤。
3. 将两种上清液混合, 通过滤纸过滤, 在真空下浓缩, 然后冷冻干燥残渣产生 grex。
4. 将 grex 溶解在二甲基亚硫酸 (dmso) 中, 用0.9% 的生理盐水稀释, 并通过0.45μm 注射器过滤器进行过滤。然后, 将 dmso 的最终浓度调整为 & lt; 5%。
5. 通过口腔灌胃再灌注 mcao 后1小时管理 grex (体重 300 mg/kg). 在生理盐水 (10 mL/kg 体重) 中分别对正常组和对照组进行 ddmso 稀释。
   注: 本实验中使用的 grex 浓度是根据我们以前的研究⁸所显示的活性浓度确定的。

2. mcao 的鼠标模型

1. 使用6周体重 22-25 g 的雄性 c57bl6 小鼠, 为所有动物提供免费的标准食物和水, 并将它们安置在温度可控 (22±1°c) 和12小时光/黑暗循环的环境中。
   1. 将小鼠分成六只小鼠, 每组由假操作的正常、对照和 grex 治疗组组成。
   2. 进行 mcao 手术 (小泉等人的方法修改).⁹) 对对照组和 grex 处理组采用立体显微镜。
2. 在 70% n_{-2 o 和}30% o2 中使用2% 异氟醚诱导小鼠吸入麻醉.当小鼠对尾巴上的机械刺激没有反应时, 麻醉就被认为是足够的。使用连接到温度计的身体保持温度的毯子, 将小鼠的体温保持在36.5°c。
3. 通过剃须, 然后使用脱毛膏, 取出老鼠胸部和脖子上的所有头发, 用 betadine 擦洗与酒精交替消毒皮肤部位两次, 然后用手术做一个长约2厘米的切口刀片在脖子的中心。从周围结缔组织中仔细分离左颈总动脉 (lcca)、颈外动脉和颈内动脉分支。
4. 将颈外动脉和颈总动脉与手术缝合线 (4-0 丝缝合线, 半挂结) 结合, 暂时阻断手术中进入颈内动脉的血液流动。
5. 通过颈内动脉插入硅涂层尼龙缝合线 (8-0 单丝, 长11毫米), 直至左侧 mca 的起源。将长丝的硅涂层部分的厚度调整到 0.10-0.12 mm 的范围内。
6. 利用激光多普勒流量计测量 mca 中相对脑血流 (rcbf) 的减少情况。当 rcbf 在整个缺血期间保持在 & lt; 20% 的静息条件值时, mcao 将得到确认。
7. 将插入的长丝固定在血管上 2小时, 而大脑动脉被阻断, 然后小心地取出长丝, 恢复血液流动22小时的再灌注。缝合皮肤缝制在5个地方 (3-0 丝绸缝合, 两个半搭丝结), 让每只老鼠从麻醉中醒来。
8. 在正常组中, 按照上述相同的过程 (直到 2.4) 执行假操作, 但以下异常。结扎颈总动脉, 缝合切割的肌肉和皮肤。

3. 脑组织受损体积的测量

1. 在对小鼠进行脑损伤测量后, 用二氧化碳吸入切除小鼠大脑, 在 mcao 发病24小时后, 用虹膜手术剪刀和角度钳切除小鼠的大脑。
   1. 用剪刀取下头部后, 在头部中线皮肤上做一个切口, 从头骨上翻转皮肤。
   2. 用角度钳打破顶骨, 同时剥落硬脑膜物质, 然后将大脑与头骨仔细隔离。
2. 使用小鼠大脑基质将切除的组织切割成部分 (1 毫米厚), 然后在 2% 2, 3, 5-三苯基四唑氯化铵 (ttc) 的溶液中染色该部分17分钟。
3. 将10% 福尔拉林中的部分固定至少 2小时, 然后用数码相机拍摄。ttc 将被观察到染色可行的组织红色, 而坏死的区域将是白色的。
4. 使用 imagej 分析和量化每个部分的脑梗死面积。

4. 组织学切片的血红素、eosin (h & amp; e) 和 cresyl 紫罗兰染色

1. 用 co2 吸入方法对小鼠进行组织学研究 , 并在心脏上用10毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 对其进行灌注, 然后对小鼠进行10% 的4% 甲醛 (pfa)。使用与上述相同的程序 (3.1) 隔离大脑, 并在一夜之间将大脑浸入30% 蔗糖的10毫升中。
2. 将脑组织嵌入最佳切割温度 (oct) 化合物中, 并使用低温恒温器将其分形切割成15μm 厚的部分。将切片安装在玻璃幻灯片上, 然后用血红素、eosin (h & amp; e) 或 cresyl 紫色染色。
3. 将玻璃滑块浸泡在80% 乙醇中 1分钟, 然后在血红素溶液中染色5分钟。
   1. 将幻灯片浸入1% 酸醇两次, 浸泡在饱和碳酸锂溶液中 30秒, 用自来水清洗 30秒, 然后在 eosin 溶液中进行30秒的反污渍。
   2. 用自来水冲洗滑梯, 浸泡 95%, 并连续浸泡绝对乙醇。
   3. 将滑块风干, 用二甲苯清除至少 10分钟, 然后使用安装介质安装盖板。
4. 将玻璃滑梯放在至少1小时的滑梯上, 然后浸泡在50% 的乙醇中, 用氯仿稀释一夜。
   1. 在40°c 的干烤箱中, 用0.1% 的环己基紫罗兰粉将滑块染色10分钟。
   2. 将95% 乙醇浸泡 30分钟, 然后在绝对乙醇中脱水2次。
   3. 在二甲苯中清除 2次 5分钟, 然后在空气干燥后安装在安装介质上。
5. 用显微镜观察 mcao 引起的脑损伤后的组织学改变。

5. 统计分析

1. 用标准偏差的单向分析 (anova) 和 tukey 的事后分析 (数据分析软件), 将实验结果表示为标准偏差, 并确定各组之间的统计意义。
2. 将统计意义设置为p值 & lt; 0.05。

结果

在假操作的正常组, 没有观察到脑梗塞, 而在对照组, 观察到相对广泛的损伤区域。在 mcao 模型组给小鼠的 300 mg/kg grex 中, 损伤面积显著减少 (图 2)。

用 h & amp; e 或 cresyl 紫染色缺血性脑切片, 研究其组织学改变。h & amp; e 染色提供有关细胞¹⁰的结构信息和特定功能信息, 而 cresyl 紫色染色用...

讨论

随着慢性高血压、糖尿病、高脂血症等代谢疾病的发病率不断上升, 脑卒中的主要危险因素, 脑卒中的预防和治疗已成为医学研究的一个重要领域^12.13. 中风后语言和运动方面的缺陷与脑组织¹⁴的损伤程度密切相关, 导致患者及其家属的生活质量差.重要的是要使用一个适当的中风动物模型, 其中涉及相同的病理变化发生?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma	Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea		Glycyrrhizae Radix et Rhizoma
Qualitative filter paper	Advantec	Filter paper No. 2	Qualitative filter paper
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418-250ML	Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Syringe filter (0.45 µm)	Sigma	CLS431220	Syringe filter (0.45 µm)
Stereo Microscope	Leica	M50	Stereo Microscope
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745	Stereo Microscope
Laser Doppler	Moor Instrument	moorVMS-LDF	Laser Doppler
Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System	Harvard Appratus	34-1352	Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System
Homeothermic Monitoring System	Harvard Appratus	55-7020	Homeothermic Monitoring System
Digital Camera	Canon	Eos-M2	Digital Camera
Cryostat	Leica	CM3050S	Cryostat
Microscope	Carl Zeiss	Zeiss Axio	Microscope
Data Analysis	Systat Software Inc.	SigmaPlot version 12	Data Analysis
Data Analysis	NIH Image	ImageJ	Data Analysis
Mouse diet	Doo Yeol Biotech	Standard rodent chow	Mouse diet
Isoflurane	JOONGWAE	A02104781	Isoflurane
Isoflurane	TROIKAA	ISOTROY 100	Isoflurane
Silk suture (4-0 Black silk)	AILEE	SK47510	Silk suture (4-0 Black silk)
Silk suture (3-0 White silk)	Baekjae	57	Silk suture (3-0 White silk)
Nylon suture (8-0 monofilament)	AILEE	NB825	Nylon suture (8-0 monofilament)
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma	T8877-25G	2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)
Formalin (Formaldehyde solution)	JUNSEI	69360-1263 20KG	Formalin (Formaldehyde solution)
Hematoxylin (Harris Hematoxylin)	YD Diagnostics	EasyStain	Hematoxylin (Harris Hematoxylin)
Eosin (1% Eosin Y Solution)	MUTO PURE CHEMICALS	3200-2	Eosin (1% Eosin Y Solution)
Cresyl violet (acetate)	Sigma	C5042-10G	Cresyl violet (acetate)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-1KG	Paraformaldehyde
Sucrose	JUNSEI	31365-0350 1KG	Sucrose
Optimum cutting temperature (OCT) compound	Scigen	4583	Optimum cutting temperature (OCT) compound
Disecting Knife	Fine Science Tools	10055-12	Disecting Knife
#4 Forcep	Fine Science Tools	11241-30	#4 Forcep
#5 Forcep	Fine Science Tools	11254-20	#5 Forcep
#6 Forcep	Fine Science Tools	11260-20	#6 Forcep
#7 Fine Forcep	Fine Science Tools	11274-20	#7 Fine Forcep
Surgical Scissors	Fine Science Tools	14001-12	Surgical Scissors
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08	Extra Fine Bonn Scissors
Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors	Fine Science Tools	15371-92	Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors
Vessel Dilating Forcep	Fine Science Tools	18153-11	Vessel Dilating Forcep