Glycyrrhizae 기 수의 신경 보호 효과 평가 외 Rhizoma 과도 중간 대뇌 동맥 폐색 마우스 모델을 사용 하 여 추출

요약

이 연구에서 우리는 결과 얻기 위해 더 많은 재현, 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 마우스 모델을 구축 하 여 기존 실험 방법 수정. Glycyrrhizae 기 수의 구강 관리 외 뿌리 줄기 (GR) 메탄올 추출 물 (GRex), 선 유도 따라 크게 감소 치료 제어 그룹을 기준으로 총 경색 볼륨.

초록

허 혈 뇌졸중 후 뇌 혈 류의 reperfusion 뒤 신경 세포의 죽음 및 뇌 조직의 손실을 이끌어 낸다. 선 공부에 대 한 가장 일반적으로 사용 되 동물 모델은 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 모델. 이전 연구는 동일한 실험 동물 종 비슷한 MCAO 조건 하에서 사용 하는 경우에 다른 경색 크기를 보고 있다. 따라서, 우리는이 불일치를 해결 하는 향상 된 실험 방법 개발. 마우스 MCAO 폐색 소재로 인간의 선 조건을 모방 하는 필 라 멘 트를 사용 하 여 대상이 됐다 고 필 라 멘 트 두께 더 재현 경색 볼륨 설정 최적화 되었다. Glycyrrhizae 기 수의 마우스는 메탄올으로 치료 추출 외 뿌리 줄기 (GRex) 선 유도 따라 크게 감소 총 경색 볼륨 및 치료 제어 그룹을 기준으로 세포가 살아 나 기의 증가 수. 이 성공적으로 실험 프로토콜을 수정 하 고 reproducibly 뇌경색에 GRex의 유익한 효과 설명 했다.

서문

허 혈과 reperfusion 대뇌 혈 류로 인 한 뇌 손상 신경 세포의 죽음 및 뇌 조직의 손실을 이끌어 낸다. 뇌 손상의이 유형은 비만, 고혈압, 당뇨병 mellitus^1,2등 대사 질환의 확산으로 인해 뇌혈관 질환의 증가 보급 증가 하 고 있습니다. 절대 뇌졸중 노인 환자는 극적으로 증가 세계적으로, 그리고 수시로 남겨진다 장기 장애, 이러한 환자에 대 한 의료 서비스의 비용 주요 사회적 부담. 따라서, 2 차 장애 경제 부담^1,2를 줄이기 위해 가능한 만큼 많이 완화 한다.

뇌의 가장 일반적으로 사용 되는 설치류 모델은 있는 MCA는 가려진는 실리콘 코팅 수술 suturing 필 라 멘 트 혈액 흐름을 차단 하와 허 혈 성 뇌졸중^3, 를 일으키는 중간 대뇌 동맥 (MCA) 폐색 (MCAO) 모델 ⁴. 폐색 소재 내부 luminal 필 라 멘 트 삽입 기간을 조작 하 여 폐색 시간과 영원의 컨트롤 수를 필 라 멘 트를 사용 하 여.

이전 연구는 같은 설치류 MCAO 모델을 사용 하는 경우에 뇌의 총 볼륨 차이가 실험, 연구의 낮은 재현성을 일으키는 나타났습니다. 재현성을 높이기 위해 우리는 실험에 사용 된 필 라 멘 트 민트의 두께 최적화. 대뇌 허 혈 성 기간 및 허 혈 성 기간 60 분 보다 긴의 체적 영역 허용 했다 유도 경색의 예비 연구의 결과 관찰 하 여 측정할 뇌 조직 손상.

Glycyrrhizae 기 수 외 Rhizoma (GR), 일컬어 감 초, 말린된 뿌리와 뿌리 줄기 Glycyrrhiza uralensis 의 구성 및 G. 나무. 그것은 중국 하 고 한국 전통 의학에서 식품 첨가제와 약^5,6,7등 다양 한 용도로 사용 되었습니다.

이전 연구⁸, GR 메탄올 추출 물 (GRex) MCAO 마우스에서 안티-apoptotic 효과 보여주었다 사전 치료 (Bcl-2) B-세포 림프 종 2의 단백질 표정에 있는 감소의 중요 한 예방 및 Bcl 초대형 (Bcl-xL)를 포함 하 여. 이 연구는 GRex 후 경색 치료 효과적으로 MCAO-대뇌 손상에서 경색 볼륨을 감소 하는 경우 결정의 효율성을 평가 하 여 기존의 MCAO 마우스 모델의 재현성을 향상 시키기 위해 실시 되었다.

프로토콜

동물 관련 된 모든 절차는 부산 대학교 (승인 번호, 부산대-2016-1087)의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 이 연구에 대 한 그래픽 개요는 그림 1에 표시 됩니다.

1. 준비 및 GRex의 관리

참고:이 연구에 사용 된 GR 상업적인 제약 회사에서 구입 했다.

1. 메탄올의 2000 mL에 GR의 200g를 배치 하 고 5 일 동안 실 온 (25 ° C)에서 품 어.
2. 0.26 m m 두께와 5 µ m 기 공 크기, 필터 종이 사용 하 여 혼합물을 필터링 하 고는 상쾌한 제거. GR 잔류물에 메탄올 1000 mL를 추가 하 고 다시 필터링.
3. 두 개의 supernatants 결합, 필터 종이 통해 필터링, 진공, 아래 집중 하 고 생산 GRex 잔류물을 freeze-dry.
4. 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), 0.9% 생리 식 염 수로 희석에 GRex 녹이 고는 0.45 μ m 주사기 필터를 통해 필터링. 그런 다음 < 5 %DMSO 최종 농도 조정 합니다.
5. 구강을 통해 MCAO reperfusion 후 GRex (300 밀리 그램/kg 체중) 1 시간을 관리 합니다. 생리 식 염 수 (10 mL/kg 체중) 정상적인 그룹 및 제어 그룹에만에 각각 희석 DMSO를 관리 합니다.
   참고:이 실험에 사용 된 GRex 농도 있었던 우리의 이전 연구⁸농도 따라 결정 되었다.

2. 마우스 모델 MCAO의

1. 사용 남성 C57BL/6 쥐 세 6 주 하 고 22-25 g. 무게 제공 표준 차 우와 물, 그리고 집에 무료로 액세스할 모든 동물 제어 온도 (22 ± 1 ° C)는 환경에서 그들 12 h 명암 주기.
   1. 보통 가짜 운영, 제어, 및 GRex 치료 그룹의 구성 한다 6 마우스 각각의 그룹으로 마우스를 나눕니다.
   2. MCAO 수술 (고이즈미 외 의 방법의 수정 ⁹) 제어 및 스테레오-현미경을 사용 하 여 GRex 치료 그룹에.
2. 70% N₂O 2% isoflurane 30% O₂를 사용 하 여 마우스에 흡입 마 취를 유도. 마 취 때 마우스 꼬리에 적용 하는 기계적인 자극에 반응이 충분 한으로 간주 됩니다. 36.5 ± 0.5 ° C 온도 지주 담요 온도계에 연결 하는 몸을 사용 하 여에서 쥐의 체온을 유지 한다.
3. 가슴에 머리를 제거 하 고 면도 하 여 쥐의 목 제 모 크림의 사용 하 여 다음 2 번 술과 함께 번갈아 betadine 스크럽으로 피부 수술 부위의 소독 이며 약 2cm의 절 개 수술로 긴 목의 센터에 블레이드입니다. 조심 스럽게 왼쪽된 일반적인 경 동맥 (LCCA), 외부 경 동맥, 및 주위 결합 조직에서 내부 경 동맥의 분기를 격리 합니다.
4. 외부 경 동맥과 (4-0 비단 봉합, 반 히 치 매듭) 일시적으로 혈액 흐름을 차단 하는 수술 봉합으로 일반적인 경 동맥 내부 경 동맥으로 작업 중 선.
5. 실리콘 코팅 나일론 봉합 (8-0 monofilament, 11 m m 긴) 왼쪽된 MCA의 기원에 내부 경 동맥을 통해 삽입 합니다. 0.10-0.12 범위에 필 라 멘 트의 실리콘 코팅 부분의 두께 조정 m m.
6. 레이저 도플러 유량 계를 사용 하 여 MCA에 상대적인 대뇌 혈 류 (rCBF)에 있는 감소를 측정 합니다. MCAO는 rCBF은 전체 허 혈 성 기간 동안 휴식 조건 값의 < 20%에서 유지 될 때 확인 될 것입니다.
7. 대뇌 동맥을 차단 하는 동안 2 시간에 대 한 혈관에 삽입 된 필 라 멘 트를 수정 하 고 신중 하 게 철회 reperfusion의 22 h에 대 한 혈액 흐름을 복원 하는 필 라 멘 트. 5 장소 (3-0 비단 봉합, 두 절반 보내고 매듭)에서 봉 제 하 여 피부를 봉합 하 고 마 취에서 각 성 각 마우스 허용.
8. 일반 그룹에서 다음과 같은 예외 (2.4)까지 위의 동일한 절차에 따라 가짜 작업을 수행. 일반적인 경 동맥 선 고 베인된 근육과 피부를 봉합.

3. 손상 된 뇌 조직의 볼륨의 측정

1. CO₂ 흡입 뇌 손상 측정에 대 한 생쥐의 안락사, 후 소비 마우스 MCAO 아이리스 수술가 위를 사용 하 여 직각된 포 셉의 발병 후 24 시간 두뇌.
   1. 가 위를 사용 하 여 머리를 제거한 후 두개골에서 피부를 뒤집어 머리의 중간 피부에 절 개를 확인 합니다.
   2. 정수 리 뼈 각도 겸 휴식, 경질 벗는 동시에 중요 하 고 신중 하 게 두개골에서에서 뇌를 분리.
2. 컷 섹션 (두께 1 m m)으로 삭제 조직 마우스 뇌 매트릭스를 사용 하 고 2 %2,3,5 triphenyltetrazolium 염화 (TTC)의 솔루션에 17 분에 대 한 섹션을 얼룩.
3. 적어도 2 시간에 대 한 10% 포 르 말린에 섹션을 수정 하 고 디지털 카메라를 사용 하 여 사진을. TTC 괴 지역 흰색 될 것입니다 하는 동안 가능한 조직 붉은 얼룩 관찰 됩니다.
4. 분석 하 고 계량 ImageJ를 사용 하 여 각 섹션의 대뇌 경색 영역.

4. hematoxylin과 오신 (H & E) Cresyl 조직학 섹션의 보라색 얼룩

1. CO₂ 흡입에 의해 조직학 연구에 대 한 마우스를 안락사 그리고 그들 transcardially 인산 버퍼 (PBS), 염 분의 10 mL와 10 mL 4 %paraformaldehyde (PFA)의 뒤에 perfuse. (3.1) 위의 동일한 절차를 사용 하 여 뇌를 분리 하 고 30% 자당의 10 mL에 뇌를 하룻밤 담가.
2. 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물에 뇌 조직을 포함 하 고 coronally는 cryostat를 사용 하 여 15 µ m 두께 섹션으로 그것을 슬라이스. 되며 고 오신 (H & E) 또는 cresyl 보라색 얼룩이 다음 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다.
3. 1 분 뒤에 5 분 동안 되며 솔루션에서 얼룩에 대 한 80% 에탄올에 유리 슬라이드에 젖어.
   1. 1% 산 알코올에 슬라이드를 두 번 찍어, 30에 대 한 포화 리튬 탄산염 해결책에서 담가 30 s, 그리고 counterstain 30 오신 솔루션에 대 한 수돗물으로 세척 s s.
   2. 린스 수돗물에 슬라이드, 연속적으로 95%와 절대 에탄올에 담근 다.
   3. 슬라이드를 건조, 적어도 10 분 동안 크 실 렌에서 그들을 취소 하 고 설치 매체를 사용 하 여 coverslips를 탑재.
4. 적어도 1 시간, 클로 프롬 하룻밤 희석 50% 에탄올에 침수에 의해 다음에 대 한 따뜻한 슬라이드 유리 슬라이드를 놓습니다.
   1. 40 ° C의 건조 오븐에서 10 분 0.1 %cresyl 바이올렛과 슬라이드 얼룩.
   2. 30 분 동안 95% 에탄올에 immerse 다음 2 시간 동안 절대 에탄올에서 탈수.
   3. 5 분, 크 실 렌에 2 번 후 공기 건조 후 장착 매체 마운트하기.
5. 현미경을 사용 하 여, MCAO 유도 뇌 손상 후 발생 한 조직학 변화 관찰.

5. 통계 분석

1. 실험 결과 수단 ± 표준 편차로 표현 하 고는 단방향 분산 분석 (ANOVA) Tukey의 임시 게시물 분석 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 다음을 사용 하 여 그룹 간의 통계적 의미를 결정 합니다.
2. P에 통계적 의미를 설정-< 0.05 값.

결과

가짜 운영 하는 일반 그룹에 아무 대뇌 경색 반면 상대적으로 광범위 한 손상된 영역 관찰 제어 그룹에서 관찰 된다. 쥐에 관리 300 mg/kg GRex MCAO 모델 그룹, 손상 된 영역에서 통계적으로 유의 한 감소에에서는 (그림 2) 관찰 됩니다.

조직학 변화는 조사에 의해 허 혈 성 뇌 섹션 H & E 또는 cresyl 보라색 얼룩. H...

토론

뇌졸중 주요 위험 요소는 만성 고혈압, 당뇨병, 고 지 혈 증, 등 대사 질환의 증가 보급, 뇌졸중 예방 및 치료는 되었다 의료 연구^12, 의 중요 한 지역 ¹³. 언어 및 뇌졸중 후 운동에 적자는 강하게 뇌 조직¹⁴ 환자 및 그들의 가족¹⁵가난한 삶의 질에서 발생 하는 손상의 정도 연관. 그것은 약물 치료의 효능 연구를 인간의 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma	Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea		Glycyrrhizae Radix et Rhizoma
Qualitative filter paper	Advantec	Filter paper No. 2	Qualitative filter paper
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418-250ML	Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Syringe filter (0.45 µm)	Sigma	CLS431220	Syringe filter (0.45 µm)
Stereo Microscope	Leica	M50	Stereo Microscope
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745	Stereo Microscope
Laser Doppler	Moor Instrument	moorVMS-LDF	Laser Doppler
Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System	Harvard Appratus	34-1352	Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System
Homeothermic Monitoring System	Harvard Appratus	55-7020	Homeothermic Monitoring System
Digital Camera	Canon	Eos-M2	Digital Camera
Cryostat	Leica	CM3050S	Cryostat
Microscope	Carl Zeiss	Zeiss Axio	Microscope
Data Analysis	Systat Software Inc.	SigmaPlot version 12	Data Analysis
Data Analysis	NIH Image	ImageJ	Data Analysis
Mouse diet	Doo Yeol Biotech	Standard rodent chow	Mouse diet
Isoflurane	JOONGWAE	A02104781	Isoflurane
Isoflurane	TROIKAA	ISOTROY 100	Isoflurane
Silk suture (4-0 Black silk)	AILEE	SK47510	Silk suture (4-0 Black silk)
Silk suture (3-0 White silk)	Baekjae	57	Silk suture (3-0 White silk)
Nylon suture (8-0 monofilament)	AILEE	NB825	Nylon suture (8-0 monofilament)
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma	T8877-25G	2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)
Formalin (Formaldehyde solution)	JUNSEI	69360-1263 20KG	Formalin (Formaldehyde solution)
Hematoxylin (Harris Hematoxylin)	YD Diagnostics	EasyStain	Hematoxylin (Harris Hematoxylin)
Eosin (1% Eosin Y Solution)	MUTO PURE CHEMICALS	3200-2	Eosin (1% Eosin Y Solution)
Cresyl violet (acetate)	Sigma	C5042-10G	Cresyl violet (acetate)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-1KG	Paraformaldehyde
Sucrose	JUNSEI	31365-0350 1KG	Sucrose
Optimum cutting temperature (OCT) compound	Scigen	4583	Optimum cutting temperature (OCT) compound
Disecting Knife	Fine Science Tools	10055-12	Disecting Knife
#4 Forcep	Fine Science Tools	11241-30	#4 Forcep
#5 Forcep	Fine Science Tools	11254-20	#5 Forcep
#6 Forcep	Fine Science Tools	11260-20	#6 Forcep
#7 Fine Forcep	Fine Science Tools	11274-20	#7 Fine Forcep
Surgical Scissors	Fine Science Tools	14001-12	Surgical Scissors
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08	Extra Fine Bonn Scissors
Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors	Fine Science Tools	15371-92	Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors
Vessel Dilating Forcep	Fine Science Tools	18153-11	Vessel Dilating Forcep