Evaluación de efectos neuroprotectores de Glycyrrhizae Radix et Rhizoma extraer mediante un modelo de ratón de oclusión transitoria de la arteria Cerebral Media

Resumen

En este estudio, modificamos un método experimental existente para obtener resultados reproducibles más, mediante el establecimiento de un modelo de ratón de arteria cerebral media oclusión (MCAO). La administración oral de Glycyrrhizae Radix et Extracto de metanol de rizoma (GR) (GRex), tras la inducción de la carrera, redujo significativamente el volumen de infarto total en relación con el grupo control no tratado.

Resumen

Isquemia seguida de reperfusión del flujo sanguíneo cerebral después de un derrame cerebral conduce a la muerte de las células nerviosas y la pérdida de tejido cerebral. El modelo animal más utilizado para el estudio de tiempos es el modelo de oclusión (MCAO) de la arteria cerebral media. Estudios anteriores han reportado tamaños diferentes infarto incluso cuando la misma especie animal experimental se utilizó en condiciones similares de MCAO. Por lo tanto, hemos desarrollado un método experimental mejorado para hacer frente a esta discrepancia. Ratones fueron sometidos a MCAO usando un filamento como el material de la obstrucción para imitar las condiciones de movimiento humano y grueso filamento fue optimizado para crear más volumen de infarto reproducible. Extracción de ratones tratados con un metanol de Glycyrrhizae Radix et rizoma (GRex) tras inducción de movimiento mostró un volumen de infarto total significativamente disminuida y aumento en el número de supervivientes de las células en relación con el grupo control no tratado. Esto modificó el protocolo experimental con éxito y reproducible había demostrado el efecto beneficioso de GRex en accidente cerebrovascular isquémico.

Introducción

Daño cerebral causado por isquemia y reperfusión del flujo sanguíneo cerebral conduce a la muerte de las células nerviosas y la pérdida de tejido cerebral. Este tipo de daño cerebral continúa aumentando con la creciente prevalencia de enfermedades cerebrovasculares debido a la propagación de enfermedades metabólicas como obesidad, hipertensión y diabetes mellitus^1,2. El número absoluto de pacientes mayores con ictus ha aumentado en todo el mundo, y el costo de la atención médica de estos pacientes, que a menudo se quedan con discapacidades a largo plazo, es una carga social importante. Por lo tanto, discapacidad secundaria debe mitigarse lo más posible para reducir la carga económica^1,2.

El modelo más utilizado de roedor del infarto cerebral es el modelo de oclusión (MCAO) de arteria cerebral media (MCA), en el que el MCA se ocluye con un filamento de sutura quirúrgico silicio para bloquear el flujo sanguíneo, causando accidente cerebrovascular isquémico^{3, 4}. usando un filamento como el material de la obstrucción permite el control del tiempo de oclusión y permanencia mediante la manipulación de la duración de la inserción del filamento intra-luminales.

Estudios anteriores han demostrado que incluso cuando se utiliza el mismo modelo MCAO roedor, el volumen total del infarto cerebral varía entre experimentos, causando baja reproducibilidad de los estudios. Para mejorar la reproducibilidad, hemos optimizado el grueso de la menta de filamentos utilizado en el experimento. Los resultados de un estudio preliminar del período isquémico cerebral y el infarto inducido demostrada que un período isquémico de más de 60 min permitió la región volumétrica del dañan tejido cerebral para ser observados y cuantificados.

Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (GR), también conocido como regaliz, consiste en el secado raíces y rizomas de Glycyrrhiza uralensis y g. glabra. Se ha utilizado en la medicina tradicional China y coreana para los varios propósitos incluyendo como un aditivo alimenticio y medicinal^5,6,7.

En un anterior estudio⁸, pre-tratamiento con el extracto de metanol GR (GRex) demostrado un efecto anti-apoptotic en ratones MCAO, incluyendo prevención significativa de la disminución en la expresión de la proteína de linfoma de células B 2 (Bcl-2) y Bcl extra grande (Bcl-xL). Este estudio se llevó a cabo para mejorar la reproducibilidad del modelo de ratón MCAO convencional evaluando su eficiencia en la determinación de si el tratamiento postinfarto con GRex efectivamente reduce el volumen de infarto en daño cerebral inducido por MCAO.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad Nacional de Pusan (número de aprobación, PNU-2016-1087). Una visión gráfica de este estudio se muestra en la figura 1.

1. preparación y administración de GRex

Nota: El GR utilizado en este estudio fue adquirido a una compañía farmacéutica comercial.

1. 200 g de GR en 2.000 mL de metanol e incubar a temperatura ambiente (25 ° C) durante 5 días.
2. La mezcla con papel de filtro con 0,26 mm de espesor y 5 μm tamaño de poro del filtro y retire el sobrenadante. Agregar 1000 mL de metanol al residuo GR y filtro nuevo.
3. Combinar los dos sobrenadantes, filtrar con papel de filtro, concentrado bajo vacío y luego el residuo para producir GRex por congelación.
4. Disolver el GRex en dimetil sulfóxido (DMSO), diluir con solución salina fisiológica 0,9% y filtrar con un filtro de jeringa de 0.45 μm. A continuación, ajuste la concentración final de DMSO a < 5%.
5. Administrar GRex (300 mg/kg de peso corporal) 1 h después de la reperfusión de MCAO vía oral por sonda nasogástrica. Administrar el DMSO diluido en suero fisiológico (10 mL/kg de peso corporal) sólo a los grupos normales y grupos de control, respectivamente.
   Nota: La concentración de GRex utilizado en este experimento se determinó según la concentración que se activa a través de nuestro anterior estudio⁸.

2. ratón modelo de MCAO

1. Ratones C57BL/6 machos de uso de 6 semanas de edad y 22-25 g. de peso todos los animales con libre acceso a chow estándar y agua y la casa en un ambiente con temperatura controlada (22 ± 1 ° C) y un ciclo de 12 h luz/oscuridad.
   1. Dividir los ratones en grupos de seis ratones cada uno, que deben consistir en simulada funciona normal, el control y grupos de tratamiento de GRex.
   2. Realizar cirugía MCAO (modificación del método de Koizumi et al. ⁹) sobre el control y los grupos de tratamiento GRex utilizando un microscopio estéreo.
2. Inducir la anestesia inhalatoria en los ratones con 2% de isoflurano en 70% N₂O y 30% O₂. Anestesia se considera suficiente cuando el ratón se convierte en insensible a la estimulación mecánica aplicada a su cola. Mantener la temperatura corporal de los ratones a 36,5 ± 0.5 ° C usando un cuerpo temperatura-tenencia manta conectada a un termómetro.
3. Quitar todo el pelo en el pecho y cuello de los ratones por el afeitado seguido por el uso de crema depilatoria, desinfecta el sitio quirúrgico de la piel con betadine scrub alternando con alcohol por dos veces y luego realizar una incisión de aproximadamente 2 cm largo con quirúrgico hoja en el centro del cuello. Aislar cuidadosamente la arteria carótida común izquierda (LCCA), arteria carótida externa y la rama de la arteria carótida interna de los tejidos conectivos circundantes.
4. Ligar la arteria carótida externa y la arteria carótida común con una sutura quirúrgica (sutura de seda 4-0, medio enganche nudo) para bloquear temporalmente el flujo sanguíneo en la arteria carótida interna durante la operación.
5. Insertar una sutura de nylon de silicio (monofilamento de 8-0, 11 mm de largo) a través de la arteria carótida interna en el origen de la MCA izquierdo. Ajustar el espesor de la pieza de silicio del filamento a una gama de 0.10-0.12 mm.
6. Medir la disminución del flujo sanguíneo cerebral relativo (rCBF) en el MCA usando un flujómetro Doppler láser. MCAO se confirmará cuando se mantiene el rCBF en < 20% de los valores de condición descanso durante todo el período isquémico.
7. Fijar el filamento insertado a los vasos sanguíneos para 2 h mientras se ocluye la arteria cerebral y luego retirar cuidadosamente el filamento para restaurar el flujo de sangre de 22 h de la reperfusión. La sutura de la piel por costura en los 5 lugares (nudo de dos medios nudos, sutura de seda 3-0) y permita que cada ratón para despertar de la anestesia.
8. En el grupo normal, realizar una operación simulada siguiendo el mismo procedimiento anteriormente (hasta 2.4), con las siguientes excepciones. Ligar la arteria carótida común y la sutura del músculo Incisa y piel.

3. medición del volumen de tejido cerebral dañado

1. Después de la eutanasia de los ratones para la medición de daño cerebral con la inhalación de CO₂ , impuesto el ratón cerebros 24 h después del inicio de MCAO usando tijeras quirúrgicas de iris y ángulo de pinzas.
   1. Después de quitar la cabeza con unas tijeras, hacer una incisión en la piel de la línea media de la cabeza a voltear la piel del cráneo.
   2. Romper los huesos parietales con pinzas angulares, pelar apagado dura materia al mismo tiempo y luego aislar el cerebro cuidadosamente desde el cráneo.
2. Corte el tejido suprimido en secciones (1 mm de espesor) utilizando una matriz de cerebro de ratón y entonces la mancha las secciones de 17 min en una solución de 2% de cloruro de 2,3,5-Trifeniltetrazolio (TTC).
3. Fijar las secciones en formalina al 10% durante al menos 2 h y luego fotografiar con una cámara digital. TTC se observará a teñir el tejido viable rojo mientras que las áreas necróticas será blanco.
4. Analizar y cuantificar el área de infarto cerebral de cada sección con ImageJ.

4. hematoxilina y eosina (H & E) y cresil violeta tinción de cortes histológicos

1. Eutanasia a los ratones para el estudio histológico por la inhalación de CO₂ y perfusión les transcardially con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), seguido de 10 mL de paraformaldehído al 4% (PFA). Aislar el cerebro usando el mismo procedimiento de arriba (3.1) y sumergir el cerebro en 10 mL de sacarosa al 30% durante la noche.
2. Incrustar el tejido cerebral en la temperatura de corte óptima (OCT) compuesto y corte coronal en secciones de 15 μm de espesor con un criostato. Monte las secciones sobre portaobjetos de vidrio, seguidos por la coloración con hematoxilina y eosina (H & E) o violeta de cresilo.
3. Sumerja el portaobjetos en etanol al 80% durante 1 min seguido por la coloración de hematoxilina en solución durante 5 minutos.
   1. Sumerja los portaobjetos en alcohol ácido al 1% dos veces, sumergir en una solución saturada de carbonato de litio durante 30 s, lavar con agua del grifo por 30 s y entonces contratinción en solución de eosina para 30 s.
   2. Enjuague los portaobjetos en agua del grifo, remojo en 95% y etanol absoluto consecutivamente.
   3. Deje secar al aire los portaobjetos, claro en el xileno durante al menos 10 minutos y luego Monte el cubreobjetos con medio de montaje.
4. Coloque el portaobjetos sobre un portaobjetos calentador durante al menos 1 h, seguido por inmersión en etanol al 50% diluido con cloroformo durante la noche.
   1. Los portaobjetos con violeta de cresilo 0.1% durante 10 min en un horno seco de 40 º C de la mancha.
   2. Sumerja en etanol al 95% por 30 min y luego deshidratar en etanol absoluto por 2 veces.
   3. Claro 2 veces en xileno durante 5 minutos, y luego montar con medio de montaje después de secado al aire.
5. Utilizando un microscopio, observar los cambios histológicos ocurridos después de lesión del cerebro inducida por MCAO.

5. estadístico análisis

1. Expresan los resultados experimentales como medio ± desviación estándar y determinar la significación estadística entre los grupos usando un unidireccional análisis de varianza (ANOVA) seguido de análisis post hoc de Tukey usando un software de análisis de datos.
2. Establecer la significación estadística a un p-valor < 0.05.

Resultados

En el grupo normal operado simulado, infarto cerebral no se observa mientras que en el grupo control, se observó una gama relativamente amplia de áreas dañadas. En los ratones administrado GRex 300 mg/kg en el grupo de modelos MCAO, una reducción estadísticamente significativa en el área dañada se observa (figura 2).

Los cambios histológicos son investigados por tinción de secciones del cer...

Discusión

Con la creciente prevalencia de enfermedades metabólicas como la hipertensión crónica, diabetes e hiperlipidemia, que son factores de riesgo para el accidente cerebrovascular, el tratamiento y prevención de accidentes cerebrovasculares han convertido en una importante área de investigación médica^{12, 13}. los déficits en el lenguaje y el movimiento después de un accidente cerebrovascular se correlacionan fuertemente con el grado de daño cerebral de tejido...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma	Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea		Glycyrrhizae Radix et Rhizoma
Qualitative filter paper	Advantec	Filter paper No. 2	Qualitative filter paper
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418-250ML	Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Syringe filter (0.45 µm)	Sigma	CLS431220	Syringe filter (0.45 µm)
Stereo Microscope	Leica	M50	Stereo Microscope
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745	Stereo Microscope
Laser Doppler	Moor Instrument	moorVMS-LDF	Laser Doppler
Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System	Harvard Appratus	34-1352	Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System
Homeothermic Monitoring System	Harvard Appratus	55-7020	Homeothermic Monitoring System
Digital Camera	Canon	Eos-M2	Digital Camera
Cryostat	Leica	CM3050S	Cryostat
Microscope	Carl Zeiss	Zeiss Axio	Microscope
Data Analysis	Systat Software Inc.	SigmaPlot version 12	Data Analysis
Data Analysis	NIH Image	ImageJ	Data Analysis
Mouse diet	Doo Yeol Biotech	Standard rodent chow	Mouse diet
Isoflurane	JOONGWAE	A02104781	Isoflurane
Isoflurane	TROIKAA	ISOTROY 100	Isoflurane
Silk suture (4-0 Black silk)	AILEE	SK47510	Silk suture (4-0 Black silk)
Silk suture (3-0 White silk)	Baekjae	57	Silk suture (3-0 White silk)
Nylon suture (8-0 monofilament)	AILEE	NB825	Nylon suture (8-0 monofilament)
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma	T8877-25G	2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)
Formalin (Formaldehyde solution)	JUNSEI	69360-1263 20KG	Formalin (Formaldehyde solution)
Hematoxylin (Harris Hematoxylin)	YD Diagnostics	EasyStain	Hematoxylin (Harris Hematoxylin)
Eosin (1% Eosin Y Solution)	MUTO PURE CHEMICALS	3200-2	Eosin (1% Eosin Y Solution)
Cresyl violet (acetate)	Sigma	C5042-10G	Cresyl violet (acetate)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-1KG	Paraformaldehyde
Sucrose	JUNSEI	31365-0350 1KG	Sucrose
Optimum cutting temperature (OCT) compound	Scigen	4583	Optimum cutting temperature (OCT) compound
Disecting Knife	Fine Science Tools	10055-12	Disecting Knife
#4 Forcep	Fine Science Tools	11241-30	#4 Forcep
#5 Forcep	Fine Science Tools	11254-20	#5 Forcep
#6 Forcep	Fine Science Tools	11260-20	#6 Forcep
#7 Fine Forcep	Fine Science Tools	11274-20	#7 Fine Forcep
Surgical Scissors	Fine Science Tools	14001-12	Surgical Scissors
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08	Extra Fine Bonn Scissors
Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors	Fine Science Tools	15371-92	Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors
Vessel Dilating Forcep	Fine Science Tools	18153-11	Vessel Dilating Forcep