Bewertung neuroprotektive Wirkung Glycyrrhizae Radix et Rhizoma extrahieren mit einer vorübergehenden mittlere zerebrale Arterie Okklusion Maus-Modell

Zusammenfassung

In dieser Studie modifizieren wir eine vorhandene experimentellen Methode um mehr reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, durch die Schaffung einer mittleren zerebralen Arterie Okklusion (MCAO) Maus-Modell. Orale Verabreichung von Glycyrrhizae Radix et Rhizom (GR)-Methanol-Extrakt (GRex) nach Schlaganfall Induktion deutlich zurückgegangen insgesamt Infarkt Volumen im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollgruppe.

Zusammenfassung

Ischämie Reperfusion des zerebralen Blutflusses nach einem Schlaganfall gefolgt führt zu den Tod von Nervenzellen und Verlust von Gehirngewebe. Die am häufigsten verwendete Tiermodell zur Erforschung von Schlaganfall ist das mittlere zerebrale Arterie Okklusion (MCAO) Modell. Frühere Studien haben verschiedene Infarkt Größen berichtet, auch wenn die gleichen experimentellen Tierarten unter ähnlichen Bedingungen der MCAO verwendet wurde. Daher entwickelten wir eine verbesserte experimentelle Methode um diese Diskrepanz zu beheben. Mäuse wurden MCAO mit einem Filament als Okklusion Material imitieren menschlichen Schlaganfall Bedingungen unterworfen und Filament Dicke wurde optimiert, um mehr reproduzierbare Infarkt Volumen zu schaffen. Mäuse mit einem Methanol behandelten Auszug aus Glycyrrhizae Radix et Rhizom (GRex) nach Schlaganfall Induktion zeigte eine deutlich verminderte totale Infarkt Volumen und erhöhte Anzahl der Überlebenden Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollgruppe. Das experimentelles Protokoll erfolgreich geändert und reproduzierbar demonstriert die wohltuende Wirkung von GRex auf ischämischen Schlaganfall.

Einleitung

Schädigung des Gehirns verursacht durch Ischämie und Reperfusion des zerebralen Blutflusses führt zu den Tod von Nervenzellen und Verlust von Gehirngewebe. Diese Art der Schädigung des Gehirns steigt mit der zunehmenden Verbreitung von zerebrovaskulären Erkrankungen, die durch die Verbreitung von Stoffwechselerkrankungen wie Adipositas, Bluthochdruck und Diabetes Mellitus^1,2. Die absolute Zahl der älteren Patienten mit Schlaganfall weltweit sprunghaft angestiegen, und die Kosten der medizinischen Versorgung für diese Patienten, die oft mit langfristigen Behinderungen zurückbleiben, ist eine große gesellschaftliche Belastung. Daher sollten sekundäre Behinderungen so weit wie möglich reduzieren die wirtschaftliche Belastung^1,2gemildert werden.

Das am häufigsten verwendete Nagetiere Modell der Hirninfarkt ist das mittlere zerebrale Arterie (MCA) Okklusion (MCAO) Modell, in dem die MCA mit einem Silikon-beschichtete chirurgische Box-Filament, Durchblutung, blockieren verschlossen ist verursacht ischämischen Schlaganfall^{3, 4}. mit einem Faden wie Okklusion Material die Kontrolle der Okklusion Zeit und Beständigkeit ermöglicht durch Manipulation der Dauer der Intra-luminalen Filament Einfügung.

Frühere Studien haben gezeigt, dass selbst wenn das gleiche Modell für Nager MCAO benutzt wird, das Gesamtvolumen der Hirninfarkt zwischen Experimente variiert, verursacht geringe Reproduzierbarkeit der Studien. Um die Reproduzierbarkeit zu verbessern, haben wir die Dicke der Glühfaden Minze verwendet im Experiment optimiert. Die Ergebnisse einer Vorstudie zerebralen ischämischen und induzierte Infarkt hat gezeigt, dass eine ischämische länger als 60 min die volumetrische Region erlaubt beschädigt Hirngewebe beobachtet und quantifiziert werden.

Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (GR), auch bekannt als Lakritze, bestehend aus den getrockneten Wurzeln und Wurzelstöcke von Glycyrrhiza Uralensis und G. Glabra. Es wird für verschiedene Zwecke, u.a. als Lebensmittelzusatzstoff und medizinisch^5,6,7in der chinesischen und koreanischen traditionellen Medizin eingesetzt.

In einer früheren Studie⁸, Vorbehandlung mit GR-Methanol-Extrakt (GRex) zeigte eine Anti-apoptotische Wirkung bei MCAO Mäusen einschließlich bedeutende Prävention aus dem Rückgang der Proteinexpression von B-Zell-Lymphom 2 (Bcl-2) und Bcl extragroßen (Bcl-xL). Diese Studie wurde durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit der herkömmlichen MCAO-Maus-Modell wird gesteigert, Bewertung ihrer Effizienz zu ermitteln, ob Post-Infarkt-Behandlung mit GRex effektiv das Infarkt-Volumen in MCAO-induzierten zerebralen Schäden reduziert.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tiere wurden von der Ethikkommission der Pusan National University (Zulassungsnummer, PNU-2016-1087) genehmigt. Eine grafische Übersicht über diese Studie ist in Abbildung 1dargestellt.

1. Erstellung und Verwaltung von GRex

Hinweis: Die in dieser Studie verwendeten GR wurde aus einem kommerziellen Pharmaunternehmen gekauft.

1. 200 g GR in 2.000 mL Methanol und 5 Tage bei Raumtemperatur (25 ° C) inkubieren.
2. Filtern Sie das Gemisch mit Filterpapier mit 0,26 mm Dicke und 5 µm Porengröße, und entfernen Sie dann den überstand. Der GR-Rückstand 1.000 mL Methanol hinzufügen und erneut filtern.
3. Kombinieren der zwei Überstände, durch Filterpapier Filtern unter Vakuum zu konzentrieren und dann Installationsprogrammen des Rückstands um GRex zu produzieren.
4. Lösen Sie der GRex in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), mit physiologischer Kochsalzlösung 0,9 % verdünnen auf und durch einen 0,45 µm-Spritze-Filter filtern. Passen Sie dann die Endkonzentration von DMSO auf < 5 %.
5. Verwalten Sie GRex (300 mg/kg Körpergewicht) 1 h nach der Reperfusion des MCAO über orale Magensonde. DMSO verdünnt in physiologischer Kochsalzlösung (10 mL/kg Körpergewicht) nur für die normale Gruppe und Kontrollgruppen, bzw. zu verwalten.
   Hinweis: Die Konzentration von GRex verwendet in diesem Experiment wurde entsprechend der Konzentration bestimmt, die durch unsere vorherigen Studie⁸aktiv war.

(2) Maus-Modell der MCAO

1. Verwendung männliche C57BL/6 Mäusen im Alter von 6 Wochen und mit einem Gewicht von 22-25 g. alle Tiere mit freiem Zugang zu standard Chow, Wasser und Haus bieten, sie in einer Umgebung mit kontrollierter Temperatur (22 ± 1 ° C) und ein 12 h hell/dunkel-Zyklus.
   1. Teilen Sie die Mäuse in Gruppen von jeweils sechs Mäuse, die Schein-betrieben Normal, Kontrolle und GRex Behandlungsgruppen bestehen soll.
   2. Operieren Sie MCAO (Modifikation der Methode von Koizumi Et al. ⁹) über die Kontrolle und GRex Behandlungsgruppen mit einem Stereo-Mikroskop.
2. Inhalation Anästhesie in den Mäusen mit 2 % Isofluran 70 % N₂O und 30 % O₂zu induzieren. Anästhesie ist als ausreichend angesehen, wenn die Maus reagiert nicht auf mechanischen Reiz auf seinen Schweif angewendet wird. Pflegen Sie die Körpertemperatur der Mäuse auf 36,5 ± 0,5 ° C mit einem Körper Temperatur-Holding Decke mit einem Thermometer verbunden.
3. Entfernen Sie die Haare auf der Brust und Hals der Mäuse durch das Rasieren gefolgt von Verwendung von Haarentfernungs-Creme, desinfizieren der Operationsstelle Haut mit Betadine Scrub abwechselnd mit Alkohol für zwei Mal und dann machen Sie einen Schnitt von ca. 2 cm lang mit chirurgischen Klinge in der Mitte des Halses. Isolieren Sie sorgfältig die linke gemeinsame Halsschlagader (LCCA), äußere Halsschlagader und der Zweig der inneren Halsschlagader aus den umliegenden Bindegewebe.
4. Verbinden Sie die äußere Halsschlagader und die gemeinsame Halsschlagader mit einer chirurgischen Naht (4: 0 Seide Naht, Hälfte Haken Knoten), um die Durchblutung vorübergehend zu blockieren in der inneren Halsschlagader, während des Betriebs.
5. Legen Sie eine Silikon beschichteten Nylon-Naht (8: 0 Monofile, 11 mm lang) durch der inneren Halsschlagader auf den Ursprung des linken MCA. Die Zähflüssigkeit des Silikon-beschichteten Teils des Fadens auf einen Bereich von 0,10-0,12 mm.
6. Messen Sie den Rückgang der relative zerebralen Blutflusses (rCBF) in der MCA mit einem Laser-Doppler-Durchflussmesser. MCAO wird bestätigt, wenn der rCBF auf < 20 % der ruhenden Zustand Werte während des gesamten ischämischen gehalten wird.
7. Die eingefügte Filament, das Blutgefäß für 2 h zu beheben, während die zerebrale Arterie verschlossen ist, und dann vorsichtig zurückziehen des Fadens um die Durchblutung für 22 h der Reperfusion wiederherzustellen. Naht der Haut durch Nähen an 5 Orten (3: 0 Seide Naht, zwei halbe Anhängevorrichtungen Knoten) und lassen jede Maus aus der Narkose erwachen.
8. Führen Sie im Bereich "normal" einen Schein-Vorgang nach dem gleichen Verfahren über (bis 2,4), mit folgender Ausnahme. Verbinden Sie die gemeinsame Halsschlagader und Naht die eingeschnittenen Muskel und Haut.

3. Messung des Volumens von beschädigten Hirngewebe

1. Nach der Euthanasie der Mäuse für Hirnschäden Messung mit CO₂ Einatmen Gehirne Verbrauchsteuern die Maus 24 h nach Beginn der MCAO mit Iris chirurgische Schere und abgewinkelte Zange.
   1. Nach dem Entfernen der Kopf mit einer Schere, machen Sie einen Einschnitt in der Mittellinie Haut des Kopfes, über die Haut aus dem Schädel zu kippen.
   2. Brechen Sie das Scheitelbein mit abgewinkelten Pinzette, Dura abziehen egal, zur gleichen Zeit, und dann das Gehirn vorsichtig aus dem Schädel zu isolieren.
2. Schnitt die ausgeschnittenen Gewebe in Abschnitte (1 mm dick) mit einer Maus Gehirn Matrix und dann färben die Abschnitten 17 min in einer Lösung von 2 % 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chlorid (TTC).
3. In den Abschnitten 10 % Formalin für mindestens 2 h zu beheben und dann sie mit einer Digitalkamera fotografieren. TTC werden beobachtet, um tragfähige Gewebe rot zu färben, während die nekrotischen Bereiche weiß werden.
4. Analyse und Quantifizierung der Hirninfarkt Bereich jedes Abschnitts mit ImageJ.

4. Hämatoxylin und Eosin (H & E) und Cresyl violette Färbung der histologischen Abschnitte

1. Einschläfern Sie die Mäuse für die histologische Untersuchung von CO₂ Inhalation und Durchspülen sie Transcardially mit 10 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), gefolgt von 10 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA). Das Gehirn mit dem gleichen Verfahren wie oben (3.1) zu isolieren und das Gehirn in 10 mL 30 % Saccharose über Nacht Tauchen.
2. Das Hirngewebe in optimale Arbeitstemperatur (OCT) zusammengesetzte einbetten und koronal in 15 µm dicke Abschnitte mit einem Kryostat schneiden. Montieren Sie die Abschnitte auf Objektträgern, gefolgt von Färbung mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) oder Cresyl violett.
3. Tauchen Sie den Objektträger in 80 % Ethanol für 1 min, gefolgt von Färbung Hämatoxylin Lösung für 5 min.
   1. Folien in 1 % Säure Alkohol zweimal tauchen, Tauchen in gesättigten Lithiumcarbonat Lösung für 30 s, waschen mit Wasser aus dem Wasserhahn für 30 s, und dann Gegenfärbung in Eosin-Lösung für 30 s.
   2. Die Folien in Leitungswasser abspülen, Einweichen in 95 % und absoluten Ethanol nacheinander.
   3. An der Luft trocknen der Folien, in Xylol mindestens 10 min lang klar und befestigen Sie dann die Eindeckmittel mit Deckgläsern.
4. Legen Sie den Objektträger auf einer Folie wärmer für mindestens 1 h, gefolgt von Eintauchen in 50 % igem Ethanol über Nacht mit Chloroform verdünnt.
   1. Färben Sie die Folien mit 0,1 % Cresyl violett für 10 min im Ofen 40 ° C trocken.
   2. Tauchen in 95 % igem Ethanol für 30 min, dann entwässern in absoluten Ethanol für 2 Mal.
   3. Deaktivieren Sie 2 Mal in Xylol für 5 min, dann montieren Sie mit Eindeckmedium nach Lufttrocknung.
5. Beobachten Sie unter Verwendung eines Mikroskops, die histologischen Veränderungen, die nach MCAO-induzierten Hirnverletzung.

5. statistische Analyse

1. Die experimentellen Ergebnisse als Mittel ± Standardabweichung Express und bestimmen die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen mit einem One-Way Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von Tukey post Hoc Analyse anhand einer Datenanalyse-Software.
2. Legen Sie die statistische Signifikanz bei einem p-Wert < 0,05.

Ergebnisse

Im Bereich Schein betrieben "normal" ist kein Hirninfarkt beobachtet, während in der Kontrollgruppe eine relativ breite Palette von Schadstellen beobachtet wird. Bei den Mäusen wird verabreicht 300 mg/kg GRex in der MCAO-Model-Gruppe, eine statistisch signifikante Reduktion im beschädigten Bereich (Abbildung 2) beobachtet.

Die histologischen Veränderungen sind durch ischämische Gehirn Abschnitt...

Diskussion

Mit der zunehmenden Verbreitung von Stoffwechselerkrankungen wie chronischem Bluthochdruck, Diabetes und Hyperlipidämie, die wichtigsten Risikofaktoren für einen Schlaganfall sind geworden Schlaganfall-Prävention und Behandlung ein wichtiger Bereich der medizinischen Forschung^{12, 13}. Defizite in Sprache und Bewegung nach einem Schlaganfall sind stark korreliert mit dem Grad der Beschädigung des Gehirns Gewebe¹⁴ und führen zu einer sch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma	Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea		Glycyrrhizae Radix et Rhizoma
Qualitative filter paper	Advantec	Filter paper No. 2	Qualitative filter paper
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418-250ML	Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Syringe filter (0.45 µm)	Sigma	CLS431220	Syringe filter (0.45 µm)
Stereo Microscope	Leica	M50	Stereo Microscope
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745	Stereo Microscope
Laser Doppler	Moor Instrument	moorVMS-LDF	Laser Doppler
Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System	Harvard Appratus	34-1352	Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System
Homeothermic Monitoring System	Harvard Appratus	55-7020	Homeothermic Monitoring System
Digital Camera	Canon	Eos-M2	Digital Camera
Cryostat	Leica	CM3050S	Cryostat
Microscope	Carl Zeiss	Zeiss Axio	Microscope
Data Analysis	Systat Software Inc.	SigmaPlot version 12	Data Analysis
Data Analysis	NIH Image	ImageJ	Data Analysis
Mouse diet	Doo Yeol Biotech	Standard rodent chow	Mouse diet
Isoflurane	JOONGWAE	A02104781	Isoflurane
Isoflurane	TROIKAA	ISOTROY 100	Isoflurane
Silk suture (4-0 Black silk)	AILEE	SK47510	Silk suture (4-0 Black silk)
Silk suture (3-0 White silk)	Baekjae	57	Silk suture (3-0 White silk)
Nylon suture (8-0 monofilament)	AILEE	NB825	Nylon suture (8-0 monofilament)
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma	T8877-25G	2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)
Formalin (Formaldehyde solution)	JUNSEI	69360-1263 20KG	Formalin (Formaldehyde solution)
Hematoxylin (Harris Hematoxylin)	YD Diagnostics	EasyStain	Hematoxylin (Harris Hematoxylin)
Eosin (1% Eosin Y Solution)	MUTO PURE CHEMICALS	3200-2	Eosin (1% Eosin Y Solution)
Cresyl violet (acetate)	Sigma	C5042-10G	Cresyl violet (acetate)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-1KG	Paraformaldehyde
Sucrose	JUNSEI	31365-0350 1KG	Sucrose
Optimum cutting temperature (OCT) compound	Scigen	4583	Optimum cutting temperature (OCT) compound
Disecting Knife	Fine Science Tools	10055-12	Disecting Knife
#4 Forcep	Fine Science Tools	11241-30	#4 Forcep
#5 Forcep	Fine Science Tools	11254-20	#5 Forcep
#6 Forcep	Fine Science Tools	11260-20	#6 Forcep
#7 Fine Forcep	Fine Science Tools	11274-20	#7 Fine Forcep
Surgical Scissors	Fine Science Tools	14001-12	Surgical Scissors
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08	Extra Fine Bonn Scissors
Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors	Fine Science Tools	15371-92	Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors
Vessel Dilating Forcep	Fine Science Tools	18153-11	Vessel Dilating Forcep