Valutare gli effetti Neuroprotective di Glycyrrhizae Radix et Rhizoma estrarre utilizzando un modello murino di occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media

Riepilogo

In questo studio, modifichiamo un metodo sperimentale esistente per ottenere più risultati riproducibili, stabilendo un modello murino di occlusione (MCAO) dell'arteria cerebrale media. La somministrazione orale di Glycyrrhizae Radix et Estratto del metanolo di Rizoma (GR) (GRex), dopo induzione di colpo, diminuito significativamente il volume di infarto totale rispetto al gruppo di controllo non trattato.

Abstract

Ischemia seguita da riperfusione di flusso sanguigno cerebrale dopo un ictus conduce alla morte delle cellule nervose e perdita di tessuto cerebrale. Il modello animale più comunemente usato per lo studio di colpo è il modello di occlusione (MCAO) dell'arteria cerebrale media. Precedenti studi di ricerca sono riportati dimensioni differenti infarto anche quando la stessa specie animale sperimentale è stato usato in condizioni simili di MCAO. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un metodo sperimentale migliore per affrontare questa discrepanza. Topi sono stati sottoposti a MCAO utilizzando un filamento di come il materiale di occlusione per simulare condizioni di colpo umano e lo spessore del filamento è stato ottimizzato per stabilire più volume di infarto riproducibile. Topi trattati con un metanolo Estratto di Glycyrrhizae Radix et Rizoma (GRex) dopo induzione di colpo ha mostrato un volume di infarto totale significativamente in diminuzione e aumento del numero di sopravvivere cellule riguardante il gruppo di controllo non trattato. Questo modificato protocollo sperimentale con successo e riproducibile ha dimostrato l'effetto benefico di GRex il colpo ischemico.

Introduzione

Danni al cervello causati da ischemia e riperfusione di flusso sanguigno cerebrale conduce alla morte delle cellule nervose e perdita di tessuto cerebrale. Questo tipo di danno cerebrale continua ad aumentare con la crescente prevalenza di malattie cerebrovascolari a causa della diffusione di malattie metaboliche come l'obesità, ipertensione e diabete mellito^1,2. Il numero assoluto di pazienti anziani con ictus è aumentato drammaticamente in tutto il mondo, e il costo delle cure mediche per questi pazienti, che spesso sono lasciati con disabilità a lungo termine, è un grave onere della società. Di conseguenza, disabilità secondaria dovrebbe essere attenuato per quanto possibile per ridurre l'onere economico^1,2.

Il modello di roditore più comunemente usato di infarto cerebrale è il modello di occlusione (MCAO) arteria cerebrale media (MCA), in cui il MCA è occluso con un filamento di sutura chirurgico silicio per bloccare il flusso sanguigno, causando ictus ischemico^{3, 4}. utilizzando un filamento di come il materiale di occlusione permette il controllo del tempo di occlusione e permanenza manipolando la durata dell'inserzione del filamento intra-luminale.

Gli studi precedenti hanno mostrato che anche quando viene utilizzato lo stesso modello MCAO roditore, il volume totale di infarto cerebrale varia tra esperimenti, causando scarsa riproducibilità degli studi. Per migliorare la riproducibilità, abbiamo ottimizzato lo spessore della zecca filamento usato nell'esperimento. I risultati di uno studio preliminare del periodo ischemico cerebrale e infarto indotto ha mostrato che un periodo ischemico più di 60 min ammessi regione volumetrica del danneggiato tessuto cerebrale per essere osservato e misurato.

Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (GR), noto anche come liquirizia, è costituito da radici secche e rizomi di Glycyrrhiza uralensis e g. glabra. È stato utilizzato nella medicina tradizionale cinese e coreana per vari scopi incluso come un additivo alimentare e medicinale^5,6,7.

In un precedente studio⁸, pre-trattamento con l'Estratto del metanolo GR (GRex) ha mostrato un effetto anti-apoptotico in topi MCAO, tra cui la prevenzione significativa della diminuzione nell'espressione della proteina di linfoma della B-cellula 2 (Bcl-2) e Bcl extra-large (Bcl-xL). Questo studio è stato condotto per migliorare la riproducibilità del modello del topo MCAO convenzionale valutando la sua efficienza nel determinare se il trattamento post-infartuale con GRex efficacemente ridotto il volume di infarto nel danno cerebrale indotto da MCAO.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal comitato etico dell'Università nazionale di Pusan (numero di omologazione, PNU-2016-1087). Una panoramica grafica di questo studio è illustrata nella Figura 1.

1. preparazione e somministrazione di GRex

Nota: Il GR utilizzato in questo studio è stato acquistato da una società farmaceutica commerciale.

1. Mettere 200 g di GR in 2.000 mL di metanolo e incubare a temperatura ambiente (25 ° C) per 5 giorni.
2. Filtrare la miscela utilizzando carta da filtro con spessore di 0,26 mm e porosità di 5 µm e quindi rimuovere il surnatante. Aggiungere 1.000 mL di metanolo al residuo GR e filtrare nuovamente.
3. Combinare i due surnatanti, filtrare attraverso carta da filtro, concentrato sotto vuoto e quindi liofilizzare il residuo per produrre GRex.
4. Sciogliere il GRex in dimetilsolfossido (DMSO), diluire con soluzione fisiologica 0,9% e filtrare attraverso un filtro per siringa da 0,45 µm. Quindi, regolare la concentrazione finale di DMSO per < 5%.
5. Amministrare GRex (300 mg/kg di peso corporeo) 1 h dopo la riperfusione di MCAO via orale mediante sonda gastrica. Amministrare il DMSO diluito in soluzione fisiologica (10 mL/kg di peso corporeo) solo al gruppo normale e gruppi di controllo, rispettivamente.
   Nota: La concentrazione di GRex utilizzati in questo esperimento è stata determinata secondo la concentrazione che è stata attiva attraverso il nostro precedente studio⁸.

2. Mouse modello di MCAO

1. Uso di topi C57BL/6 maschi di età compresa tra 6 settimane e pesatura g. 22-25 fornire tutti gli animali con libero accesso al cibo standard, acqua e casa loro in un ambiente con temperatura controllata (22 ± 1 ° C) e un ciclo luce/buio di 12 h.
   1. Dividere i topi in gruppi di sei topi ciascuno, che dovrebbero consistere di falsità-azionati normale, controllo e gruppi di trattamento GRex.
   2. Eseguire un intervento chirurgico MCAO (modifica del metodo di Koizumi et al. ⁹) sul controllo e gruppi di trattamento GRex stereo-microscopio.
2. Indurre l'anestesia per inalazione nei topi utilizzando 2% isoflurane in 70% N₂O e 30% O₂. L'anestesia è considerata sufficiente quando il mouse non risponde allo stimolo meccanico applicato alla sua coda. Mantenere la temperatura corporea dei topi a 36,5 ± 0,5 ° C, usando un corpo temperatura-tenuta coperta collegata ad un termometro.
3. Rimuovere tutti i peli sul petto e collo dei topi da rasatura, seguita da uso di crema depilatoria, disinfezione il sito chirurgico della pelle con betadine scrub alternati con alcool per due volte e poi fare un'incisione di circa 2 cm lungo con chirurgica lama al centro del collo. Isolare accuratamente l'arteria carotide comune sinistra (LCCA), arteria carotide esterna e il ramo dell'arteria carotica interna dai tessuti connettivi circostanti.
4. Legare l'arteria carotide esterna e l'arteria carotica comune con una sutura chirurgica (sutura seta 4-0, nodo mezzo collo) per bloccare temporaneamente il flusso sanguigno nell'arteria carotica interna durante il funzionamento.
5. Inserire un suturare di nylon di silicio (8-0 monofilamento, 11 mm di lunghezza) attraverso l'arteria carotica interna all'origine del MCA di sinistra. Regolare lo spessore della parte di silicio del filamento ad una gamma di 0,10-0,12 mm.
6. Misurare la riduzione del flusso sanguigno cerebrale relativo (rCBF) nel MCA usando un flussometro Doppler laser. MCAO verrà confermato quando il rCBF è mantenuto a < 20% dei valori di condizione di riposo durante l'intero periodo ischemico.
7. Difficoltà il filamento inserito per il vaso sanguigno per 2 h, mentre l'arteria cerebrale è occlusa e quindi estrarre delicatamente il filamento per ripristinare il flusso di sangue per 22 h di riperfusione. Suturare la pelle con una cucitura a 5 posti (sutura seta 3-0, due metà intoppi nodo) e consentire ogni mouse a risvegliarsi dall'anestesia.
8. Nel gruppo normale, eseguire un'operazione finta seguendo la stessa procedura sopra (fino a 2.4), con la seguente eccezione. Legare l'arteria carotica comune e suturare il muscolo incisa e la pelle.

3. misurazione del Volume del tessuto cerebrale danneggiato

1. Dopo l'eutanasia dei topi per la misura del danno cerebrale con inalazione di CO₂ , accise il mouse cervelli 24 h dopo l'inizio di MCAO utilizzando forbici chirurgiche iris e forcipe angolato.
   1. Dopo aver rimosso la testa utilizzando le forbici, fare un'incisione nella pelle della linea mediana della testa per capovolgere la pelle dal cranio.
   2. Rompere le ossa parietali con forcipe angolato, staccava dura materia allo stesso tempo e quindi isolare il cervello con attenzione dal cranio.
2. Taglia il tessuto asportato in sezioni (spessore 1 mm) utilizzando una matrice di cervello del mouse e quindi macchiare le sezioni per 17 min in una soluzione di 2% 2, 3,5-triphenyltetrazolium cloruro (TTC).
3. Fissare le sezioni in formalina al 10% per almeno 2 h e poi fotografarli utilizzando una fotocamera digitale. TTC sarà osservato a macchiare il tessuto vitale rosso mentre le zone necrotiche sarà bianche.
4. Analizzare e quantificare l'area di infarto cerebrale di ogni sezione using ImageJ.

4. ematossilina ed eosina (H & E) e Cresyl Violet macchiatura delle sezioni istologiche

1. Eutanasia i topi per esame istologico per inalazione di CO₂ e irrorare loro via con 10 mL di tampone fosfato salino (PBS), seguita da 10 mL di paraformaldeide al 4% (PFA). Isolare il cervello utilizzando la stessa procedura come sopra (3.1) e immergete il cervello in 10 mL di saccarosio 30% durante la notte.
2. Incorporare il tessuto cerebrale in temperatura di taglio ottimale (OCT) composto e affettarlo coronalmente in sezioni di 15-µm di spessore utilizzando un criostato. Montare i profili sulle lastre di vetro, seguite da colorazione con ematossilina ed eosina (H & E) o viola di cresyl.
3. Immergere i vetrini in etanolo di 80% per 1 min seguita dalla macchiatura in soluzione di ematossilina per 5 min.
   1. Immergere i vetrini in alcool acido 1% due volte, immergere in soluzione satura di carbonato del litio per 30 s, lavare con acqua corrente per 30 s e poi il colorante di contrasto in soluzione di eosina per 30 s.
   2. Sciacquare i vetrini in acqua di rubinetto, ammollo in 95% ed etanolo assoluto consecutivamente.
   3. Asciugare i vetrini, eliminarle in xilene per almeno 10 min e poi montare i vetrini coprioggetti utilizzando il mezzo di montaggio.
4. Posizionare i vetrini in una diapositiva più caldo per almeno 1 h, seguito da immersione in 50% etanolo diluito con cloroformio durante la notte.
   1. Colorare i vetrini con la viola di cresyl 0,1% per 10 min in forno secco a 40 ° C.
   2. Immergere in etanolo al 95% per 30 minuti, quindi disidratare in etanolo assoluto per 2 volte.
   3. Chiara 2 volte in xilene per 5 min, quindi montare con mezzo di montaggio dopo essiccazione all'aria.
5. Utilizzando un microscopio, osservare i cambiamenti istologici che si sono verificati dopo il trauma cranico indotto da MCAO.

5. elaborazione statistica

1. Esprimere i risultati sperimentali come mezzi ± deviazione standard e determinare la significatività statistica fra i gruppi utilizzando un unidirezionale analisi della varianza (ANOVA), seguita dall'analisi di post hoc di Tukey utilizzando un software di analisi dati.
2. Impostare la significatività statistica a un p-value < 0.05.

Risultati

Nel gruppo normale di falsità-azionati, nessun infarto cerebrale si osserva mentre nel gruppo di controllo, si osserva una gamma piuttosto ampia di aree danneggiate. Nei topi GRex amministrato 300 mg/kg nel gruppo modello MCAO, una riduzione statisticamente significativa nella zona danneggiata è osservato (Figura 2).

I cambiamenti istologici sono studiati dalla macchiatura sezioni di cervello isch...

Discussione

Con la crescente prevalenza di malattie metaboliche come l'ipertensione cronica, diabete ed iperlipidemia, che sono i principali fattori di rischio per l'ictus, il trattamento e la prevenzione del colpo sono diventati un'importante area di ricerca medica^{12, 13}. i deficit nel linguaggio e movimento dopo un ictus sono fortemente correlati con il grado di danneggiamento del tessuto¹⁴ del cervello e provocare una scarsa qualità di vita per i ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma	Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea		Glycyrrhizae Radix et Rhizoma
Qualitative filter paper	Advantec	Filter paper No. 2	Qualitative filter paper
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418-250ML	Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Syringe filter (0.45 µm)	Sigma	CLS431220	Syringe filter (0.45 µm)
Stereo Microscope	Leica	M50	Stereo Microscope
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745	Stereo Microscope
Laser Doppler	Moor Instrument	moorVMS-LDF	Laser Doppler
Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System	Harvard Appratus	34-1352	Anesthesia Tabletop Bracket with N2O&O2 Flowmeter System
Homeothermic Monitoring System	Harvard Appratus	55-7020	Homeothermic Monitoring System
Digital Camera	Canon	Eos-M2	Digital Camera
Cryostat	Leica	CM3050S	Cryostat
Microscope	Carl Zeiss	Zeiss Axio	Microscope
Data Analysis	Systat Software Inc.	SigmaPlot version 12	Data Analysis
Data Analysis	NIH Image	ImageJ	Data Analysis
Mouse diet	Doo Yeol Biotech	Standard rodent chow	Mouse diet
Isoflurane	JOONGWAE	A02104781	Isoflurane
Isoflurane	TROIKAA	ISOTROY 100	Isoflurane
Silk suture (4-0 Black silk)	AILEE	SK47510	Silk suture (4-0 Black silk)
Silk suture (3-0 White silk)	Baekjae	57	Silk suture (3-0 White silk)
Nylon suture (8-0 monofilament)	AILEE	NB825	Nylon suture (8-0 monofilament)
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma	T8877-25G	2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)
Formalin (Formaldehyde solution)	JUNSEI	69360-1263 20KG	Formalin (Formaldehyde solution)
Hematoxylin (Harris Hematoxylin)	YD Diagnostics	EasyStain	Hematoxylin (Harris Hematoxylin)
Eosin (1% Eosin Y Solution)	MUTO PURE CHEMICALS	3200-2	Eosin (1% Eosin Y Solution)
Cresyl violet (acetate)	Sigma	C5042-10G	Cresyl violet (acetate)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-1KG	Paraformaldehyde
Sucrose	JUNSEI	31365-0350 1KG	Sucrose
Optimum cutting temperature (OCT) compound	Scigen	4583	Optimum cutting temperature (OCT) compound
Disecting Knife	Fine Science Tools	10055-12	Disecting Knife
#4 Forcep	Fine Science Tools	11241-30	#4 Forcep
#5 Forcep	Fine Science Tools	11254-20	#5 Forcep
#6 Forcep	Fine Science Tools	11260-20	#6 Forcep
#7 Fine Forcep	Fine Science Tools	11274-20	#7 Fine Forcep
Surgical Scissors	Fine Science Tools	14001-12	Surgical Scissors
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08	Extra Fine Bonn Scissors
Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors	Fine Science Tools	15371-92	Moria Pascheff-Wolff Spring Scissors
Vessel Dilating Forcep	Fine Science Tools	18153-11	Vessel Dilating Forcep