Transcranial التحفيز التيار المباشر (تدكس) في الفئران

Summary

Transcranial التحفيز التيار المباشر (تدكس) أسلوب علاجية المقترحة لعلاج الأمراض النفسية. نموذج حيوان ضروري لفهم التغيرات البيولوجية محددة أثارت من قبل تدكس. ويصف هذا البروتوكول طراز ماوس تدكس يستخدم قطب كهربائي مزروع مزمن.

Abstract

Transcranial التحفيز التيار المباشر (تدكس) أسلوب غير الغازية نيورومودوليشن اقترحت كعلاج بديلة أو تكميلية للعديد من الأمراض العصبية. الآثار البيولوجية تدكس هي لا يفهم تماما، مما يفسر جزئيا بسبب صعوبة الحصول على أنسجة المخ البشري. ويصف هذا البروتوكول طراز ماوس تدكس يستخدم قطب مزمن مزروع السماح لدراسة الآثار البيولوجية طويلة الأمد من تدكس. في هذا النموذج التجريبي، تدكس يتغير التعبير الجيني القشرية، ويقدم مساهمة بارزة في الفهم الأساس المنطقي للاستخدام العلاجي.

Introduction

Transcranial التحفيز التيار المباشر (تدكس) هو أسلوب غير الغازية، منخفضة التكلفة، والعلاجي، الذي يركز على تعديل الخلايا العصبية من خلال استخدام التيارات المنخفضة الحدة المستمر¹. وهناك حاليا اثنين من الأجهزة (أنودال وكاثودال) تدكس. بينما تمارس التحفيز أنودال ضعيفة جداً لتحريك إمكانات العمل الحالي في حقل الكهربائي، وقد أظهرت الدراسات الكهربية أن ينتج هذا الأسلوب التغييرات في اللدونة متشابك². على سبيل المثال، تبين الأدلة أن تدكس يستحث الآثار التقوية (الكمونية) الطويلة الأجل مثل ذروة زيادة السعة من^3،إمكانات بوستسينابتيك ضادات⁴ والتحوير لاستثارة القشرية⁵.

على العكس من ذلك، يدفع التحفيز كاثودال تثبيط، أسفر عن غشاء فرط الاستقطاب⁶. فرضية لهذه الآلية يستند إلى النتائج الفسيولوجية حيث يتم وصف تدكس تعدل التردد إمكانات العمل والمدة في الجسم العصبية³. جدير بالذكر أن هذا التأثير لا مباشرة استحضار إمكانات العمل، على الرغم من أنه يمكن إزاحة عتبة depolarization وتيسير أو تعرقل إطلاق العصبية⁷. وقد تجلى هذه الآثار المتناقضة سابقا. على سبيل المثال، أنتجت التحفيز أنودال وكاثودال آثار معارضة في الردود مشروط المسجلة عن طريق النشاط الكهربائي في الأرانب⁸. ومع ذلك، أظهرت الدراسات أيضا أن دورات التحفيز أنودال المطول قد إنقاص استثارة بينما تزايد التيارات كاثودال قد تؤدي إلى استثارة، عرض الآثار الذاتية المتناقضة³.

تجميع المحفزات أنودال وكاثودال على السواء استخدام أزواج قطب كهربائي. على سبيل المثال، يوضع القطب في التحفيز أنودال، "نشطة" أو "اﻷنود" على منطقة الدماغ يكون التضمين حين مسرى "مرجع" أو "كاثود" يقع على منطقة فيها أثر التيار يفترض أن تكون تافهة⁹. في تحفيز كاثودال، والتصرف في القطب هو المقلوب. كثافة التحفيز تدكس الفعال يعتمد على كثافة الحالية وأبعاد القطب، الذي يؤثر على الكهرباء الميدانية بطريقة مختلفة¹⁰. في دراسات نشرت آخر، متوسط كثافة الحالية بين 0.10 إلى 2.0 mA و 0.1 mA mA للإنسان والفئران، على التوالي^6،110.8. على الرغم من أن حجم القطب 35 سم² يستخدم عادة في البشر، هناك لا الفهم الصحيح فيما يتعلق بإبعاد القطب للقوارض وإجراء تحقيق أكثر دقة هو المطلوب⁶.

وقد اقترح تدكس في الدراسات السريرية بمحاولة تقديم معاملة بديلة أو تكميلية لعدة اضطرابات عصبية والعصبية¹¹ مثل الصرع¹²¹³من اضطراب ثنائي القطب، السكتة الدماغية⁵ ، الاكتئاب¹⁴، مرض الزهايمر¹⁵،¹⁶ من التصلب المتعدد ومرض باركنسون¹⁷الرئيسية. وعلى الرغم من تزايد الاهتمام في تدكس واستخدامها في التجارب السريرية، والخلوية مفصلة والتعديلات مقولة الجزيئية في أنسجة المخ والقصير والآثار طويلة الأمد، فضلا عن النتائج السلوكية، هي حتى الآن إلى أن تكون أكثر شدة التحقيق^{18، 19}-نهج البشري مباشر لدراسة مستفيضة تدكس ليست قابلة للتطبيق، استخدام نموذج الحيوان تدكس قد تقدم أفكاراً قيمة في الأحداث الخلوية والجزيئية الكامنة وراء الآليات العلاجية من تدكس نظراً لإمكانية الوصول إلى أنسجة المخ في الحيوانات.

ويقتصر الأدلة المتوفرة بشأن النماذج تدكس في الفئران. تستخدم معظم النماذج التي تم الإبلاغ عنها تخطيطات ترسيخ مختلفة وأبعاد القطب والمواد. على سبيل المثال، وينكلر et al. (2017) مزروع الكهربائي الرئيسي (Ag/AgCl، قطرها 4 ملم) مملوءة بالمياه المالحة، وأنها ثابتة للجمجمة مع الأسمنت ومسامير اﻷكريليك²⁰. يختلف عن النهج الذي نتبعه، كان على قطب الصدر مزروع (البلاتين، 20 x 1.5 مم). نزهي et al. (2017) يستخدم إجراء مشابه جداً لبلدنا، على الرغم من أن الصدر الكهربائي كانت مصنوعة من الأسفنج غارقة في المياه المالحة (الكربون شغلها، 9.5 سم²)²¹. دراسة أخرى زرعها كل أقطاب في رأس هذا الحيوان، الذي تم التوصل إليه عن طريق استخدام لوحات ثابتة ويغطي رأسه الحيوان الموصلات المائية²². وهنا يصف لنا طراز ماوس تدكس يستخدم قطب مزروع المزمن عن طريق بسيطة إعداد الإجراءات وتدكس الجراحية (الشكل 1).

Protocol

واستخدمت مساكن منفردة الذكور البالغين (8-12 أسبوعا) الفئران C57BL/6 في هذه التجربة. الحيوانات تلقي الرعاية المناسبة قبل وأثناء وبعد الإجراءات التجريبية بالطعام والماء متواصلة ad- وافق جميع الإجراءات لجنة الأخلاقيات الحيوان من "الجامعة الاتحادية في ميناس" جيرايس (البروتوكول رقم 59/2014)-

1. وضع قطب كهربائي

1. المسكنة وفيكساتينج الحيوان على جهاز ستيريوتاكسيك
   1. تعقيم كل الأدوات الجراحية اللازمة.
      ملاحظة. تم تعقيم الأدوات الجراحية لمدة 3 دقائق في 440 درجة مئوية. وكانت مسحات القطن يعقم في 20 رطل/بوصة مربعة (جنيه لكل بوصة مربعة) في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
   2. ضبط وحدة تحكم منصة الحرارية إلى 37 درجة مئوية.
   3. وزن الحيوان وحساب الجرعة المناسبة لتحريض التخدير. استخدام خليط من الكيتامين وإكسيلازيني بجرعة 100 مغ/كغ الكيتامين و 8 ملغ/كغ xylazine، نظراً إينترابيريتونيلي (حجم الإبرة، ز 31). وينبغي أن تغفو الحيوان داخل 2 إلى 3 دقيقة.
   4. استخدام ماكينة حلاقة كهربائية أو أسلاك شائكة ليحلق أسفل موقع الجراحية.
   5. مكان الحيوان على جهاز ستيريوتاكسيك أكثر حرارة قبل التدفئة لوحة.
   6. عقد رئيس الحيوان وإدراج أشرطة الإذن نصيحة إلى كل من الأذنين للحيوان لإصلاحه إلى منصة ستيريوتاكسيك.
   7. التحقق من وجود لا تحول الرأس الوحشي والحركة الرأسية قليلاً بعد ببطء التحول رأس الحيوان لتحديد المواقع.
   8. بلطف الشريحة قناع التخدير فوق الآنف للماوس وإصلاحه في مكان بتشديد المسمار.
   9. تعيين إيسوفلوراني إلى % 1 مع 1.0 لتر في الدقيقة س₂.
   10. تطبيق مرهم العين لعيون الحيوان لمنع جفاف القرنية أثناء الجراحة.
2. إرفاق عملية الزرع لرأس الحيوان
   1. استخدام مسحات القطن لإعداد الموقع الجراحي مع دعك التناوب ثلاثة بوفيدون (أو الكلورهيكسيدين 2 ٪) وايثانول 70%.
   2. استخدام زوج من ملاقط للتحقق من عمق التخدير باستخفاف عصر أصابع الحيوان والتحقق من فقدان منعكس الحيوان سحب دواسة (قرصه تو).
   3. جعل شق حوالي 3 مم الخلفي لخط الإذن للحيوان وتتوقف عند خط العين. يجب أن يكون الموقع شق حوالي 1 سم في الطول لتكون كبيرة بما يكفي الحصول على عملية الزرع.
   4. بلطف كشط في الجمجمة مع مكشطة العظام لتحسين الغراء والأسمنت التقيد. هذا الضوء توازن بنية أحداث الخدوش الصغيرة.
   5. ضع بعناية هوكس الجراحية للجلد فضفاضة للحفاظ على حقل جراحة مفتوحة وخالية من العوائق مثل الجلد والفراء.
   6. استخدم مسحه القطن عقيمة إلى جفاف فروة الرأس للحيوان.
   7. استخدام مجهر تشريح لتصور الجزء العلوي من الجمجمة للحيوان.
   8. إرفاق إبرة لصاحب ستيريوتاكسيك وتحديد موقع بريجما. ضع الإبرة مباشرة فوق رأسه الحيوان لمس قليلاً في بريجما.
   9. صفر خارج جميع الإحداثيات في التتبع الرقمي وثم رفع الإبرة.
   10. إصلاح الزرع تدكس على حامل ستيريوتاكسيك. ضع الزرع رأس الحيوان وخفضه ببطء إلى المنطقة للاهتمام باستخدام إحداثيات ستيريوتاكسيك السليم.
   11. استخدام إبرة لنشر قطره 1 (حوالي 35 ميكروليتر) الغراء سوبر على قاعدة لعملية الزرع.
   12. تتحرك ببطء على حامل نزولا حتى أنها تمس الجمجمة. تأكد من أن قاعدة زرع تماما على اتصال مع السطح.
   13. إعداد الأسمنت الجراحية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
   14. وبعد تحديد المواقع بدقة، تطبيق 3 رقيقة، حتى طبقة من الأسمنت عبر في الجمجمة وعلى الجزء السفلي من عملية الزرع. تطبيق إسقاط كل قطره ماء باستخدام فرشاة تطبيق. يجب أن تشكل طبقات هيكل على شكل هيل لمزيد من الدعم الهيكلي للزرع.
   15. اترك المسمار الخيط للزرع نظيفة من الأسمنت للسماح باتصال سلس ودون عائق.
   16. السماح لكل طبقة لتجف لمدة حوالي 4 دقائق.
   17. عندما تجف، بعناية إزالة الحامل حتى أنها بعيدة تماما عن عملية الزرع. دائماً توخي الحذر عند التعامل مع عملية الزرع، نظراً لأنه يمكن استخلاصها عن طريق الخطأ من جمجمة الحيوان.
3. الانتهاء من الجراحة والرعاية ما بعد العمليات الجراحية
   1. هيدرات الجلد الحيوان في موقع شق مع مسحه القطن غارقة في المياه المالحة.
   2. معطف الجلد على القاعدة زرع تدكس.
   3. استخدام زوج من ملاقط لتجمع الأنسجة وإغلاق الشق مع قطره من الغراء الأنسجة الجراحية الواحدة 0.2 سم أنسجة.
   4. التسلل ليدوكائين 1-2% في موقع شق والأساسية للأنسجة.
   5. هيدرات الماوس مع 500 ميليلتر من حل لاكتات المسابقة تحت الجلد.
   6. ضع الماوس في قفص نظيفة، واحد يضم المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية).
   7. وضع طبق صغير مع حبيبات الغذاء الرطب في قفص للوصول بسهولة إلى الغذاء في الساعات التالية.
   8. تسجيل وزن الحيوان بعد الجراحة.
   9. إعطاء كيتوبروفين الحيوانية (5 مغ/كغ) تحت الجلد بعد الجراحة، وفي غضون الأيام القادمة 2.
   10. رصد انتعاش الحيوان عن كثب لمدة أسبوع واحد على الأقل. تقييم أي علامة الشدة، مثل بيلوريكشن، والافتقار إلى الاستمالة وانخفاض الحركة والخدش الجرح والتهاب في موقع الجراحية.

2-تدكس الإعداد والتحفيز

1. تدكس الإعداد (انظر الشكل 2)
   ملاحظة. تأكد من أن مشجعا تدكس مشحونة بالكامل.
   1. إرفاق الكابلات اﻷنود والكاثود مشجعا تدكس وجعلها متوفرة قرب موقع التحفيز. إرفاق مسرى نوع pin لصاحب ستيريوتاكسيك.
   2. تعيين المنهاج الحرارية إلى 37 درجة مئوية.
   3. بدوره على مقياس الأكسجين في التدفق على نظام التخدير استنشاق 1 لتر في الدقيقة.
   4. ضع الماوس في قاعة تحريض التخدير.
   5. قم بتشغيل المرذاذ isoflurane إلى 3%. السماح لهذا الحيوان على الخضوع لتأثيرات إيسوفلوراني لمدة 4 دقائق.
   6. أن الحيوان في قاعة التوجيهي، فاستخدام المحاقن معقمة لتعبئة مسرى الجسم بالمحلول الملحي 0.9 في المائة.
   7. إزالة الحيوان من قاعة توجيهي وضع مسرى الجسم في الصدر.
   8. بلطف الشريحة قناع التخدير فوق الآنف للماوس وإصلاحه في المكان. أقل الإخراج isoflurane إلى 1.5 في المائة.
   9. ملء الزرع ومسرى دبوس من نوع مع المالحة وإرفاقها بعناية.
   10. قم بضبط الوقت التحفيز والكثافة الحالية.
   11. التحقق من جودة الاتصال على مشجعا تدكس. الاتصال الأمثل يذهب من 7 إلى 10 على مقياس 1 إلى 10.
2. التحفيز
   1. ابدأ التحفيز.
   2. مراقبة التعلية الحالي التسجيل 30 s القيمة المحددة، والحفاظ على نفسها ثابتة لفترة ثابتة، ثم، في نهاية الدورة التعلية إلى أسفل مرة أخرى.
   3. قم بتنشيط الزر الصورية لمكافحة الفئران.
   4. مراقبة التعلية الحالية للحصول على 30 ثانية إلى القيمة المحددة، ومن ثم وصولاً إلى 1 لبقية فترة التحفيز مع منحدر نهائي إلى القيمة المحددة في النهاية مع منحدر على التوالي إلى أسفل.
   5. بمجرد اكتمال الدورة التحفيز، بعناية نقل الحيوان إلى قفص المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة. بدء الحيوانات توقظ بعد 3 دقائق.
   6. إيقاف تشغيل النظام التخدير بالاستنشاق.

النتائج

عرض البروتوكول الجراحية زرع الاستقرار طويل الأجل لمدة شهر واحد على الأقل، مع لا إشارات تحريضية في الموقع تحفز ولا أي تأثير غير مرغوب فيه. نجا جميع الحيوانات الإجراءات الجراحية الدورتين تدكس (n = 8). في هذه التجربة، تم وضع يزرع تدكس عبر كورتيسيس M1 و M2 (مم +1.0 الأمامي الخلفي وال...

Discussion

في السنوات الأخيرة، إدخال تقنيات نيوروستيموليشن الممارسة السريرية كإجراء واعدة لعلاج الاضطرابات النفسية العصبية²³. للحد من القيود المفروضة بسبب عدم معرفة آليات نيوروستيموليشن، قدمنا هنا نموذجا ماوس تدكس تحمل قطب التي يمكن استهداف مناطق الدماغ. منذ مسرى مزمن القابلة للغرس، ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Ultra-Fine 50U Syringe	BD	10033430026	For intraperitonially injection.
Shaver (Philips Multigroom)	Philips (Brazil)	QG3340/16	For surgical site trimming.
Surgical Equipment
Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	KOPF	940	For animal surgical restriction and positioning.
Model 922 Non-Rupture 60 Degree Tip Ear Bars	KOPF	922	For animal surgical restriction and positioning.
Cannula Holder	KOPF	1766-AP	For implant positioning.
Precision Stereo Zoom Binocular Microscope (III) on Boom Stand	WPI	PZMIII-BS	For bregma localization and implant positioning.
Temperature Control System Model	KOPF	TCAT-2LV	For animal thermal control.
Cold Light Source	WPI	WA-12633	For focal brightness
Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System with Scavenging	VetEquip	901820	For isoflurane delivery and safety.
VaporGuard Activated Charcoal Adsorption Filter	VetEquip	931401	Delivery system safety measures.
Model 923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder	KOPF	923-B	For animal restriction and O2 and isoflurane delivery.
Oxygen regulator, E-cylinder	VetEquip	901305	For O2 regulation and delivery.
Oxygen hose – green	VetEquip	931503	For O2 and isoflurane delivery.
Infrared Sterilizer 800 ºC	Marconi	MA1201	For instrument sterilization.
Surgical Instruments
Fine Scissors - ToughCut	Fine Science Tools	14058-11	For incision.
Surgical Hooks	INJEX	1636	In House Fabricated - Used to clear the surgical site from skin and fur.
Standard Tweezers or Forceps	-	-	For skin grasping.
Surgical Consumables
Vetbond	3M	SC-361931	For incision closing.
Cement and Catalyzer KIT (Duralay)	Reliance	2OZ	For implant fixation.
Sterile Cotton Swabs (Autoclaved)	JnJ	75U	For surgical site antisepsis.
24 Well Plate (Tissue Culture Plate)	SARSTEDT	831,836	For cement preparation.
Application Brush	parkell	S286	For cement mixing and application.
Pharmaceutics
Xylazin (ANASEDAN 2%)	Ceva Pharmaceutical (Brazil)	P10160	For anesthesia induction.
Ketamine (DOPALEN 10%)	Ceva Pharmaceutical (Brazil)	P30101	For anesthesia induction.
Isoflurane (100%)	Cristália (Brazil)	100ML	For anesthesia maintenance.
Lidocaine (XYLESTESIN 5%)	Cristal Pharma	-	For post-surgical care.
Ketoprofen (PROFENID 100 mg)	Sanofi Aventis	20ML	For post-surgical care.
Ringer's Lactate Solution	SANOBIOL LAB	7898153652145	For post-surgical care.
TobraDex (Dexamethasone 1 mg/g)	Alcon	631	For eye lubrification and protection.
Stimulation
Animal Transcranial Stimulator	Soterix Medical	2100	For current generation.
Pin-type electrode Holder (Cylindrical Holder Base)	Soterix Medical	2100	Electrode support (Implant).
Pin-type electrode (Ag/AgCl)	Soterix Medical	2100	For current delivery (electrode).
Pin-type electrode cap	Soterix Medical	2100	For implant protection.
Body Electrode (Ag/AgCl Coated)	Soterix Medical	2100	For current delivery (electrode).
Saline Solution (0.9%)	FarmaX	7896902206441	Conducting medium for current delivery.
Standard Tweezers or Forceps	-	-	For tDCS setup.
Real Time Polymerase Chain Reaction
BioRad CFX96 Real Time System	BioRad	C1000	For qPCR
SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix (5 X 1mL)	BioRad	1725271	For qPCR
Hard Shell PCR Plates PCT COM 50 p/ CFX96	BioRad	HSP9601	For qPCR
Microseal "B" seal pct c/ 100	BioRad	MSB1001	For qPCR