Transkranielle Gleichstrom Stimulation (tDCS) bei Mäusen

Zusammenfassung

Transkranielle Gleichstrom Stimulation (tDCS) ist eine therapeutische Technik, die zur Behandlung von psychiatrischer Erkrankungen vorgeschlagen. Einem Tiermodell ist unerlässlich für das Verständnis der spezifischen biologischen Veränderungen hervorgerufen durch tDCS. Dieses Protokoll beschreibt eine tDCS-Maus-Modell, das eine chronisch implantierte Elektrode verwendet.

Zusammenfassung

Transkranielle Gleichstrom Stimulation (tDCS) ist eine nicht-invasive Neuromodulation Technik als eine alternative oder ergänzende Behandlung für mehrere neuropsychiatrischen Erkrankungen vorgeschlagen. Die biologischen Wirkungen von tDCS sind nicht vollständig geklärt, teilweise aufgrund der Schwierigkeiten bei der Beschaffung von menschlichen Hirngewebe erklärt wird. Dieses Protokoll beschreibt eine tDCS-Maus-Modell, das eine chronisch implantierte Elektrode, so dass die Studie der lang andauernde biologische Wirkungen der tDCS verwendet. In diesem experimentellen Modell tDCS wechselt die kortikalen Genexpression und bietet einen herausragenden Beitrag zum Verständnis der Beweggründe für den therapeutischen Einsatz.

Einleitung

Transkranielle Gleichstrom Stimulation (tDCS) ist eine nicht-invasive, kostengünstige, therapeutische Technik, die auf neuronalen Modulation durch kontinuierliche Ströme geringer Intensität¹konzentriert. Derzeit gibt es zwei Setups (anodal und cathodal) für tDCS. Während die anodal Stimulation eine aktuelle elektrische Feld zu schwach übt, um Aktionspotentiale auslösen, haben Elektrophysiologie Studien gezeigt, dass diese Methode Änderungen in Synaptische Plastizität²erzeugt. Beispielsweise zeigt Beweise, dass tDCS Potenzierung (LTP) Langzeiteffekte wie erhöhte Peak Amplitude der exzitatorischen postsynaptischen Potenziale^3,4 und Modulation der kortikale Erregbarkeit⁵induziert.

Im Gegensatz dazu induziert cathodal Stimulation Hemmung, wodurch Membran Hyperpolarisation⁶. Eine Hypothese für diesen Mechanismus basiert auf den physiologischen Erkenntnissen, wo tDCS um zu modulieren, Aktionspotential-Frequenz und Dauer in den neuronalen Körper³beschrieben wird. Vor allem ist dieser Effekt nicht direkt Aktionspotentiale, evozieren, obwohl es kann die Depolarisation Schwelle zu verlagern und erleichtern oder behindern neuronale feuern⁷. Diese gegensätzlichen Wirkungen wurden bisher nachgewiesen. Zum Beispiel produziert anodal und cathodal Stimulation gegenläufige Effekte konditionierte Antworten registriert über Elektromyographie Aktivität in Kaninchen⁸. Jedoch haben Studien auch gezeigt, dass längere anodal Stimulationssitzungen Erregbarkeit verringern können, während steigende cathodal Strömungen zu Erregbarkeit, präsentieren sich gegensätzliche Effekte³führen kann.

Anodal und cathodal Reize aggregieren die Verwendung von Elektrodenpaare. Beispielsweise wird in anodal Stimulation, die "aktiv" oder "Anode" Elektrode platziert, über die Region des Gehirns moduliert werden, während die "Referenz" oder "Kathode" Elektrode über einer Region befindet sich wo die Wirkung des Stromes angenommen wird, unbedeutend⁹. In der cathodal Stimulation Elektrode Disposition invertiert. Die Intensität der Stimulation für effektive tDCS hängt von der Stromstärke und Elektrode Dimensionen, betreffen das elektrische Feld anders¹⁰. In die meisten veröffentlichten Studien, ist die durchschnittliche Stromstärke zwischen 0,10 bis 2,0 mA und 0,1 mA bis 0,8 mA für Menschen und Mäusen, bzw.^6,11. Obwohl die elektrodengröße 35 cm² in der Regel bei Menschen verwendet wird, gibt es kein richtiges Verständnis bezüglich Elektrode Dimensionen für Nagetiere und eine gründlichere Untersuchung ist benötigten⁶.

tDCS wurde in klinischen Studien mit dem Versuch des bietet einer alternativen oder ergänzenden Behandlung für verschiedene neurologische und neuropsychiatrische Erkrankungen¹¹ wie Epilepsie¹², bipolare Störung¹³, Schlaganfall^{5 vorgeschlagen} , major Depression¹⁴, Alzheimer-Krankheit¹⁵, Multiple Sklerose¹⁶ und der Parkinson-Krankheit¹⁷. Trotz der zunehmenden Interesse an tDCS und seine Verwendung in klinischen Studien, detaillierte zelluläre und molekulare evozierten Veränderungen im Hirngewebe, kurze und lang anhaltende Effekte sowie Verhaltens Ergebnisse, sind noch tiefer werden,^18, untersucht ¹⁹. da ein direkter menschlichen Ansatz gründlich studieren tDCS nicht vertretbar ist, kann die Verwendung von einem Tiermodell tDCS bieten wertvolle Einblicke in die zellulären und molekularen Ereignisse zugrunde liegen die therapeutischen Mechanismen der tDCS aufgrund der Zugänglichkeit zu den des Tieres Hirngewebe.

Verfügbaren Daten beschränkt sich bezüglich tDCS Modelle bei Mäusen. Die meisten gemeldeten Modelle verwendet verschiedene implantierenden Layouts, Elektrode Abmessungen und Materialien. Z. B. Winkler Et al. (2017) implantiert die Kopf Elektrode (Ag/AgCl, 4 mm Durchmesser) mit Kochsalzlösung gefüllt und an den Schädel mit Acryl Zement und Schrauben²⁰befestigt. Anders als bei unseren Ansatz, war ihre Brust-Elektrode implantiert (Platin, 20 x 1,5 mm). Nasehi Et al. (2017) verwendet ein Verfahren sehr ähnlich wie bei uns, obwohl die thorakale Elektrode aus einer Kochsalzlösung getränkten Schwamm (Kohlenstoff gefüllt, 9,5 cm²)²¹war. Eine weitere Studie implantiert beide Elektroden in den Kopf des Tieres, die durch die Verwendung von fester Platten und bedeckt den Kopf des Tieres mit einem Hydrogel Dirigent²²erreicht wurde. Hier beschreiben wir eine tDCS-Maus-Modell, das eine chronisch implantierte Elektrode durch einfache chirurgische Verfahren und tDCS Setup (Abbildung 1) verwendet.

Protokoll

Männlichen Erwachsenen einzeln untergebracht (8-12 Wochen) C57BL/6 Mäusen wurden in diesem Experiment verwendet. Tiere erhalten Sorgfalt vor, während und nach der experimentellen Verfahren mit Nahrung und Wasser ad libitum. Alle Verfahren wurden von der tierischen Ethikkommission vom föderalen Universität von Minas Gerais genehmigt (Protokoll Nr. 59/2014).

(1) Platzierung der Elektrode

1. Sedierende und fixieren das Tier auf der stereotaktischen Apparat
   1. Sterilisieren Sie alle notwendigen chirurgischen Instrumente.
      Hinweis. Chirurgische Instrumente wurden für 3 Minuten bei 440 ° c sterilisiert. Wattestäbchen wurden bei 20 Psi (Pfund pro Quadratzoll) bei 121 ° C für 20 min autoklaviert.
   2. Anpassen des thermischen Plattform-Controllers auf 37 ° C.
   3. Wiegen Sie das Tier und berechnen Sie die entsprechende Dosis für Anästhesie Induktion zu. Verwenden Sie eine Mischung von Ketamin und Xylazin bei einer Dosis von 100 mg/kg Ketamin und 8 mg/kg Xylazin, intraperitoneal gegeben (Nadelstärke, 31 G). Das Tier sollte innerhalb von 2 bis 3 Minuten einschlafen.
   4. Verwenden Sie einen elektrischen Rasierer oder Rasierklinge unten der Operationsstelle rasiert.
   5. Ort des Tieres auf der stereotaktischen Apparat über die vorgewärmten Heizplatte.
   6. Halten Sie den Kopf des Tieres und stecken Sie die Spitze Ohr Bars in aller Ohren des Tieres, der stereotaktischen Plattform zu befestigen.
   7. Stellen Sie sicher, gibt es keine Kopf Querverschub und kleine vertikale Bewegung nach durch Verlagerung langsam den Kopf des Tieres Positionierung.
   8. Sanft gleiten Sie die Anästhesie-Maske über die Maus Nase und durch Anziehen der Schraubenkopfes befestigen.
   9. Legen Sie die Isofluran auf 1 % mit 1,0 L/min O₂.
   10. Augen des Tieres zu verhindern Hornhaut Austrocknen während der Operation zuweisen Sie Augensalbe.
2. Befestigen das Implantat auf den Kopf des Tieres
   1. Verwenden Sie die Wattestäbchen an der Operationsstelle mit drei wechselnden Peelings von Povidon-Jod (oder 2 % Chlorhexidin) vorbereiten und 70 % Ethanol.
   2. Verwenden Sie ein paar Pinzette, um Anästhesie Tiefe zu überprüfen, indem Sie leicht zusammendrücken des Tieres Zehen und Überprüfung des Verlust des Tieres Pedal Rückzug (Zehe Prise) Reflex.
   3. Machen Sie einen Einschnitt ca. 3 mm posterior des Tieres Ohr Linie und halten Sie an das Auge. Die Schnitt-Website muss ca. 1 cm in der Länge zu groß genug, um das Implantat zu erhalten.
   4. Kratzen Sie sanft die Schädel mit einem Knochen Schaber zur Verbesserung der Leim und Einhaltung zu zementieren. Tun Sie dieses Licht im Alleingang zu schaffen Mikro-Kratzer.
   5. Positionieren Sie sorgfältig chirurgische Haken, um die lose Haut pflegen ein offene OP-Feld und frei von Hindernissen wie Haut und Fell.
   6. Verwenden Sie einem sterilen Wattestäbchen zum Trocknen des Tieres Kopfhaut.
   7. Verwenden Sie einen sezierenden Mikroskop an um der Spitze der Schädel des Tieres zu visualisieren.
   8. Legen Sie eine Nadel auf der stereotaktischen Inhaber und suchen Sie die Bregma. Positionieren Sie die Nadel direkt über den Kopf des Tieres leicht berühren die Bregma.
   9. Alle Koordinaten auf der digitalen Tracer auf NULL und dann die Nadel nach oben bringen.
   10. Befestigen Sie die tDCS Implantat auf der stereotaktischen Halter. Positionieren Sie das Implantat über den Kopf des Tieres und senken Sie es langsam auf die Region des Interesses unter Verwendung der richtigen stereotaktischen Koordinaten.
   11. Verwenden Sie eine Nadel, um 1 Tropfen (ca. 35 μL) zu verbreiten, Sekundenkleber auf das Implantat.
   12. Langsam bewegen den Halter nach unten, bis er den Schädel berührt. Achten Sie darauf, dass die implantatbasis vollständig in Kontakt mit der Oberfläche ist.
   13. Vorbereiten des chirurgischen Zements gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   14. Nach der genauen Positionierung gelten 3 dünne, gleichmäßige Schicht von Zement über den Schädel und auf den unteren Teil des Implantats. Gelten Sie Tropfen pro Tropfen mit einem Pinsel Anwendung. Schichten müssen eine Hügel-förmige Struktur für die weitere strukturelle Unterstützung des Implantats bilden.
   15. Lassen Sie das Implantat Gewinde sauber von Zement, eine glatte, freie Verbindung zuzulassen.
   16. Lassen Sie jede Schicht ca. 4 Minuten trocknen.
   17. Nach dem Trocknen entfernen Sie vorsichtig den Halter, bis es völlig losgelöst vom Implantat ist. Immer extreme Vorsicht im Umgang mit das Implantat, da es versehentlich aus der Tier-Schädel extrahiert werden kann.
3. Veredelung, Operation und postoperative Pflege
   1. Die Haut des Tieres in der Schnitt-Site mit einer Kochsalzlösung getränkten Wattestäbchen-Hydrat.
   2. Mantel der Haut über der Basis des Implantats tDCS.
   3. Verwenden der Pinzette zusammen zu bringen das Gewebe und den Schnitt mit einem Rückgang der chirurgische Gewebekleber pro 0,2 cm Gewebe in der Nähe.
   4. 1-2 % Lidocain in der Schnitt-Website zu infiltrieren und zugrunde liegenden Gewebe.
   5. Die Maus mit 500 µL Laktat-Ringer Lösung subkutan Hydrat.
   6. Platzieren Sie den Mauszeiger in eine vorgewärmte (37 ° C) sauber, Einzelzimmer untergebracht-Käfig.
   7. Legen Sie eine kleine Schale mit Nassfutter Pellets in den Käfig für den einfachen Zugriff auf Nahrung in den folgenden Stunden.
   8. Registrieren Sie das Gewicht des Tieres nach dem chirurgischen Eingriff.
   9. Geben Sie dem Tier Ketoprofen (5 mg/kg) subkutan nach der Operation und über die nächsten 2 Tage.
   10. Überwachen Sie die Wiederherstellung des Tieres eng für mindestens 1 Woche. Zeichen der Not, wie Piloerection, mangelnde Pflege, reduzierte Fortbewegung, Wunde kratzen und Entzündungen an der Operationsstelle zu beurteilen.

(2) tDCS Setup und Stimulation

1. tDCS Setup (siehe Abbildung 2)
   Hinweis. Stellen Sie sicher, dass die tDCS Stimulator vollständig geladen ist.
   1. Befestigen Sie die Anode und Kathode Kabel zu den tDCS-Stimulator und in der Nähe der Stimulation stellen Sie zur Verfügung zu. Befestigen Sie Pin-Typ-Elektrode an der stereotaktischen Halter.
   2. Legen Sie die thermische Plattform auf 37 ° C.
   3. Der Sauerstoff-Durchflussmesser auf die Inhalation Anästhesiesystem auf 1 L/min schalten.
   4. Platzieren Sie den Mauszeiger in die Anästhesie-Induktion-Kammer.
   5. Schalten Sie den Verdampfer Isoflurane auf 3 %. Lassen Sie das Tier Isofluran Effekte für 4 min zu unterziehen.
   6. Während das Tier in der Induktion Kammer ist, verwenden Sie eine sterile Spritze Körperelektrode mit 0,9 % Kochsalzlösung füllen.
   7. Entfernen Sie das Tier aus der Induktion Kammer und seine Brust über die Körperelektrode.
   8. Sanft gleiten Sie die Anästhesie-Maske über die Maus Nase und befestigen. Die Isofluran-Ausgabe auf 1,5 % zu senken.
   9. Füllen Sie das Implantat und die Pin-Typ-Elektrode mit Kochsalzlösung und befestigen Sie sie vorsichtig.
   10. Zeit der Stimulation und Stromstärke einstellen.
   11. Überprüfen Sie die Kontaktqualität auf der tDCS-Stimulator. Optimaler Kontakt reicht von 7 bis 10 auf einer Skala von 1 bis 10.
2. Stimulation
   1. Beginnen Sie die Stimulation.
   2. Beachten Sie die aktuellen Hochlauf für 30 s, um den ausgewählten Wert und Pflege selbst zu stabilisieren, zum etablierten Mal, dann am Ende der Sitzung wieder Herunterfahren.
   3. Aktivieren Sie die Schaltfläche "Schein" für Kontroll-Mäusen.
   4. Beachten Sie die aktuellen Hochlauf für 30 s auf den eingestellten Wert und dann hinunter zu 1 für den Rest der stimulationsdauer mit einer endgültigen Rampe auf den eingestellten Wert am Ende mit einer aufeinanderfolgenden Rampe nach unten.
   5. Nachdem die Stimulationssitzung abgeschlossen ist, übertragen Sie sorgfältig das Tier auf einem vorgewärmten (37 ° C) Käfig für 10 min.
      Hinweis. Tiere beginnen, nach 3 min zu wecken.
   6. Die Inhalation Anästhesiesystem ausschalten.

Ergebnisse

Das chirurgische Protokoll überreichte langfristige Implantatstabilität für mindestens einen Monat keine entzündlichen Signale bei angeregt Ortsbild noch andere unerwünschte Wirkung. Alle Tiere überlebten die chirurgischen Verfahren und tDCS Sessions (n = 8). In diesem Experiment wurden tDCS Implantate über die M1 und M2 Cortex (+1,0 mm anterior-posterioren und 0.0 mm seitlich, Bregma) positioniert. Eine Woche später, tDCS (n = 3-4) und Sham (n = 3) Mäuse wurden angeregt, für f?...

Diskussion

In den letzten Jahren haben Neurostimulation Techniken klinischen Praxis als viel versprechende Verfahren zur Behandlung von neuropsychiatrischen Störungen²³eingeben. Um die Einschränkung auferlegt durch den Mangel an Wissen über die Mechanismen der Neurostimulation zu reduzieren, haben wir hier tDCS-Maus-Modell mit einer Elektrode, die Gehirnregionen zugeordnet werden kann. Da die Elektrode chronisch implantierbare ist, ermöglicht dieses Tiermodell die Untersuchung von dauerhaften biologische...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Ultra-Fine 50U Syringe	BD	10033430026	For intraperitonially injection.
Shaver (Philips Multigroom)	Philips (Brazil)	QG3340/16	For surgical site trimming.
Surgical Equipment
Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	KOPF	940	For animal surgical restriction and positioning.
Model 922 Non-Rupture 60 Degree Tip Ear Bars	KOPF	922	For animal surgical restriction and positioning.
Cannula Holder	KOPF	1766-AP	For implant positioning.
Precision Stereo Zoom Binocular Microscope (III) on Boom Stand	WPI	PZMIII-BS	For bregma localization and implant positioning.
Temperature Control System Model	KOPF	TCAT-2LV	For animal thermal control.
Cold Light Source	WPI	WA-12633	For focal brightness
Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System with Scavenging	VetEquip	901820	For isoflurane delivery and safety.
VaporGuard Activated Charcoal Adsorption Filter	VetEquip	931401	Delivery system safety measures.
Model 923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder	KOPF	923-B	For animal restriction and O2 and isoflurane delivery.
Oxygen regulator, E-cylinder	VetEquip	901305	For O2 regulation and delivery.
Oxygen hose – green	VetEquip	931503	For O2 and isoflurane delivery.
Infrared Sterilizer 800 ºC	Marconi	MA1201	For instrument sterilization.
Surgical Instruments
Fine Scissors - ToughCut	Fine Science Tools	14058-11	For incision.
Surgical Hooks	INJEX	1636	In House Fabricated - Used to clear the surgical site from skin and fur.
Standard Tweezers or Forceps	-	-	For skin grasping.
Surgical Consumables
Vetbond	3M	SC-361931	For incision closing.
Cement and Catalyzer KIT (Duralay)	Reliance	2OZ	For implant fixation.
Sterile Cotton Swabs (Autoclaved)	JnJ	75U	For surgical site antisepsis.
24 Well Plate (Tissue Culture Plate)	SARSTEDT	831,836	For cement preparation.
Application Brush	parkell	S286	For cement mixing and application.
Pharmaceutics
Xylazin (ANASEDAN 2%)	Ceva Pharmaceutical (Brazil)	P10160	For anesthesia induction.
Ketamine (DOPALEN 10%)	Ceva Pharmaceutical (Brazil)	P30101	For anesthesia induction.
Isoflurane (100%)	Cristália (Brazil)	100ML	For anesthesia maintenance.
Lidocaine (XYLESTESIN 5%)	Cristal Pharma	-	For post-surgical care.
Ketoprofen (PROFENID 100 mg)	Sanofi Aventis	20ML	For post-surgical care.
Ringer's Lactate Solution	SANOBIOL LAB	7898153652145	For post-surgical care.
TobraDex (Dexamethasone 1 mg/g)	Alcon	631	For eye lubrification and protection.
Stimulation
Animal Transcranial Stimulator	Soterix Medical	2100	For current generation.
Pin-type electrode Holder (Cylindrical Holder Base)	Soterix Medical	2100	Electrode support (Implant).
Pin-type electrode (Ag/AgCl)	Soterix Medical	2100	For current delivery (electrode).
Pin-type electrode cap	Soterix Medical	2100	For implant protection.
Body Electrode (Ag/AgCl Coated)	Soterix Medical	2100	For current delivery (electrode).
Saline Solution (0.9%)	FarmaX	7896902206441	Conducting medium for current delivery.
Standard Tweezers or Forceps	-	-	For tDCS setup.
Real Time Polymerase Chain Reaction
BioRad CFX96 Real Time System	BioRad	C1000	For qPCR
SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix (5 X 1mL)	BioRad	1725271	For qPCR
Hard Shell PCR Plates PCT COM 50 p/ CFX96	BioRad	HSP9601	For qPCR
Microseal "B" seal pct c/ 100	BioRad	MSB1001	For qPCR