Estimulación por corriente directa transcraneal (tDCS) en ratones

Resumen

Estimulación por corriente directa transcraneal (tDCS) es una técnica terapéutica que se propone para el tratamiento de enfermedades psiquiátricas. Un modelo animal es esencial para la comprensión de las alteraciones biológicas específicas evocadas por pinza. Este protocolo describe un modelo de ratón de pinza que usa un electrodo implantado crónico.

Resumen

Estimulación por corriente directa transcraneal (tDCS) es una técnica no invasiva de la neuromodulación propuesta como un tratamiento alternativo o complementario para algunas enfermedades neuropsiquiátricas. Los efectos biológicos de tDCS no son entiende completamente, que se explica en parte debido a la dificultad de obtener tejido cerebral humano. Este protocolo describe un modelo de ratón de pinza que usa un electrodo implantado crónico permitiendo el estudio de los efectos biológicos de la larga duración de tDCS. En este modelo experimental, tDCS cambia la expresión génica cortical y ofrece una destacada contribución a la comprensión de las razones para su uso terapéutico.

Introducción

Estimulación por corriente directa transcraneal (tDCS) es una técnica no invasiva, de bajo costo y terapéutica, que se centra en la modulación neuronal mediante el uso de corriente continua de baja intensidad¹. Actualmente hay dos configuraciones (anódicas y cathodal) para tDCS. Mientras que la estimulación anódicas ejerce un campo eléctrico actual demasiado débil para desencadenar potenciales de acción, estudios de electrofisiología han demostrado que este método produce cambios en la plasticidad sináptica². Por ejemplo, hay evidencia que tDCS induce efectos a largo plazo (LTP) la potenciación como el pico de mayor amplitud de los potenciales postsinápticos excitatorios^3,4 y modulación de la excitabilidad cortical⁵.

Por el contrario, cathodal estimulación induce inhibición, dando por resultado la hiperpolarización de la membrana⁶. Una hipótesis para este mecanismo se basa en los hallazgos fisiológicos donde se describe la tDCS para modular la frecuencia del potencial de acción y duración en el cuerpo neuronal³. En particular, este efecto no directamente evocar potenciales de acción, aunque se puede cambiar el umbral de despolarización y facilitar u obstaculizar el disparo neuronal⁷. Estos efectos de contraste han demostrado previamente. Por ejemplo, anódicas y cathodal estimulación produce efectos opuestos en condicionado respuestas registradas mediante electromiografía actividad en conejos⁸. Sin embargo, los estudios también han demostrado que sesiones de estimulación anódicas prolongada pueden disminuir excitabilidad mientras aumento cathodal corrientes puede conducir a la excitabilidad, que presenta efectos auto contraste³.

Estímulos tanto anódicas como cathodal agregan el uso de pares de electrodos. Por ejemplo, en estimulación anódicas, el "activo" o "ánodo" electrodo se coloca sobre la región del cerebro a ser modulada mientras que el electrodo de "referencia" o el "cátodo" está situado en una región donde el efecto de la corriente se supone que es insignificante⁹. En la estimulación cathodal, disposición de electrodos se invierte. La intensidad de estimulación para pinza eficaz depende de la intensidad de corriente y dimensiones del electrodo, que afectan el eléctrico campo diferente de¹⁰. En estudios más publicados, la intensidad de corriente promedio es entre 0.10 a 2.0 mA y 0.1 mA a 0,8 mA de humanos y ratones, respectivamente^6,11. Aunque el tamaño de electrodo de 35 cm² se utiliza normalmente en los seres humanos, no hay adecuada comprensión en cuanto a dimensiones de electrodos para los roedores y una investigación más exhaustiva es necesario⁶.

Pinza se ha propuesto en los estudios clínicos con la tentativa de ofrecer un tratamiento alternativo o complementario para varios trastornos neurológicos y neuropsiquiátricos¹¹ como epilepsia¹², trastorno bipolar¹³, carrera⁵ , mayor depresión¹⁴, enfermedad de Alzheimer¹⁵, esclerosis múltiple¹⁶ y¹⁷de la enfermedad de Parkinson. A pesar del creciente interés en pinza y su uso en ensayos clínicos, detalle celular y alteraciones moleculares evocados en el tejido cerebral, corto y efectos de larga duración, así como medidas de resultado conductuales, son sin embargo ser más profundamente investigado^{18, 19}. desde un enfoque humano directo estudiar a fondo tDCS no es viable, el uso de un modelo animal de tDCS puede ofrecer información valiosa sobre los acontecimientos celulares y moleculares subyacentes a los mecanismos terapéuticos de la tDCS debido a la accesibilidad a la tejido fino del cerebro del animal.

Evidencia disponible es limitada con respecto a modelos de tDCS en ratones. La mayoría de los modelos reportados utiliza diferentes diseños de implantación, electrodo de dimensiones y materiales. Por ejemplo, Winkler et al. (2017) implantado el electrodo principal (Ag/AgCl, 4 mm de diámetro) llenado de solución salina y se fija al cráneo con tornillos y cemento acrílico²⁰. A diferencia de nuestro enfoque, los electrodos del pecho fue implantado (platino, 20 x 1.5 mm). Nasehi et al. (2017) utilizan un procedimiento muy similar al nuestro, aunque el electrodo torácico fue hecho de una esponja empapada en solución salina (carbón lleno, 9.5 cm²)²¹. Otro estudio implanta dos electrodos en la cabeza del animal, que fue alcanzada usando las placas fijas y cubriendo la cabeza del animal con un hidrogel conductor²². Aquí, describimos un modelo de ratón de pinza que usa un electrodo crónicamente implantado a través de la simple instalación quirúrgica procedimientos y pinza (figura 1).

Protocolo

Alojados individualmente macho adulto (8-12 semanas) los ratones C57BL/6 fueron utilizados en este experimento. Animales recibieron atención adecuada antes, durante y después de procedimientos experimentales con alimentos y agua ad libitum. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de ética animal de la Universidad Federal de Minas Gerais (protocolo número 59/2014).

1. colocación del electrodo

1. Sedación y fijación del animal sobre el aparato estereotáctica
   1. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos necesarios.
      Tenga en cuenta. Instrumentos quirúrgicos se esterilizan durante 3 minutos a 440 ° C. Hisopos de algodón fueron esterilizados en autoclave a 20 psi (libras por pulgada cuadrada) a 121 ° C por 20 min.
   2. Ajustar el controlador de la plataforma térmica a 37 ° C.
   3. Pesar el animal y calcular la dosis apropiada para la inducción de la anestesia. Utilice una mezcla de ketamina y xilacina a dosis de 100 mg/kg ketamina y 8 mg/kg xilacina, dado por vía intraperitoneal (tamaño de la aguja, 31 G). El animal debe dormirse dentro de 2 a 3 minutos.
   4. Use una máquina de afeitar eléctrica o una navaja para afeitar el sitio quirúrgico.
   5. Placa solar lugar el animal sobre el aparato estereotáxicas en el precalentado.
   6. Sostenga la cabeza del animal e introduzca las barras de oído de punta en cada una de las orejas del animal para fijar a la plataforma estereotáxicas.
   7. Verifique que haya ningún desplazamiento cabeza lateral y poco movimiento vertical después moviendo lentamente la cabeza del animal de posicionamiento.
   8. Suavemente Deslice la máscara de la anestesia sobre la nariz del ratón y colocarlo en su lugar apretando el tornillo.
   9. Colocado el isoflurano al 1% con 1.0 L/min de O₂.
   10. Aplique ungüento oftálmico para ojos del animal para evitar la desecación corneal durante la cirugía.
2. Colocar el implante a la cabeza del animal
   1. Utilizar los hisopos de algodón para preparar el sitio quirúrgico con tres peelings alternas de povidona-yodo (o clorhexidina 2%) y etanol al 70%.
   2. Utilice un par de pinzas para verificar profundidad de anestesia ligeramente apretando los dedos del animal y verificación de la pérdida del reflejo de retirada pedal (pellizco del dedo del pie) del animal.
   3. Hacer una incisión de unos 3 mm posterior a la línea de oído del animal y pare en la línea del ojo. El sitio de la incisión debe tener aproximadamente 1 cm de largo para ser lo suficientemente grande como para recibir el implante.
   4. Raspar suavemente el cráneo con un raspador de hueso para mejorar la cola y adherencia del cemento. Hacer esta luz sin ayuda con la intención de crear micro arañazos.
   5. Coloque ganchos quirúrgicos a la piel a mantener un campo quirúrgico abierto y libre de obstrucciones tales como piel.
   6. Use un hisopo de algodón estéril para secar el cuero cabelludo del animal.
   7. Usar un microscopio de disección para visualizar la parte superior del cráneo del animal.
   8. Conecte una aguja en el soporte estereotáxicas y localice el bregma. Colocar la aguja directamente sobre la cabeza del animal ligeramente tocando el bregma.
   9. Cero a todas las coordenadas en el palpador digital y luego levantar la aguja.
   10. Fijar el implante de tDCS en el titular estereotáxicas. Coloque el implante sobre la cabeza del animal y baje lentamente en la región de interés utilizando las coordenadas estereotáxicas adecuadas.
   11. Utilice una aguja para difundir 1 gota (aproximadamente 35 μL) de pegamento en la base del implante.
   12. Mueva lentamente el soporte hacia abajo hasta que toque el cráneo. Asegúrese de que la base del implante está totalmente en contacto con la superficie.
   13. Preparar el cemento según las instrucciones del fabricante.
   14. Después de un posicionamiento preciso, aplicar 3 fino, incluso capa de cemento a través del cráneo y en la parte inferior del implante. Aplicar gota por gota con un pincel de aplicación. Capas deben formar una estructura en forma de colina para mayor soporte estructural del implante.
   15. Deje la rosca de tornillo del implante de cemento para permitir una conexión suave y sin obstrucciones.
   16. Permita que cada capa se seque durante aproximadamente 4 minutos.
   17. Cuando esté seca, retire con cuidado el soporte hasta que esté completamente separado del implante. Siempre tenga mucho cuidado al manipular el implante, ya que accidentalmente puede extraerse del cráneo del animal.
3. Acabado de cirugía y atención post quirúrgica
   1. Hidratar la piel del animal en el sitio de la incisión con un hisopo de algodón remojados en solución salina.
   2. Capa de la piel sobre la base del implante tDCS.
   3. Utilice un par de pinzas para unir el tejido y cerrar la incisión con una gota de pegamento de tejido quirúrgico por 0,2 cm de tejido.
   4. Infiltrar lidocaína 1-2% en el sitio de la incisión y subyacentes de los tejidos.
   5. Hidratar el ratón con 500 μl de solución de lactato de Ringer por vía subcutánea.
   6. Coloque el ratón en una jaula limpia, solo ocupa de precalentado (37 ° C).
   7. Poner un plato pequeño con bolitas de alimento húmedo en la jaula para facilitar el acceso a los alimentos en las horas siguientes.
   8. Registro de peso post-surgical del animal.
   9. Dar el animal ketoprofeno (5 mg/kg) por vía subcutánea después de la cirugía y en los próximos 2 días.
   10. Supervisar la recuperación del animal cerca de al menos 1 semana. Evaluar cualquier signo de angustia, como piloerección, la falta de preparación, reducida locomoción, rayar la herida y la inflamación del sitio quirúrgico.

2. pinza config y estimulación

1. tDCS configuración (ver figura 2)
   Tenga en cuenta. Asegúrese de que el estimulador de tDCS está completamente cargado.
   1. Conecte los cables del ánodo y el cátodo al tDCS estimulador y hacerlos disponibles cerca del sitio de estimulación. Aplicar el electrodo tipo perno del sujetador estereotáxicas.
   2. Coloque la plataforma térmica a 37 ° C.
   3. Encienda el medidor de caudal de oxígeno en el sistema de anestesia de inhalación a 1 L/min.
   4. Coloque el ratón en la cámara de inducción de anestesia.
   5. Encienda el vaporizador de isoflurano al 3%. Permitir que el animal a isoflurano efectos durante 4 minutos.
   6. Mientras el animal está en la cámara de inducción, utilice una jeringa estéril para llenar el electrodo del cuerpo con solución salina 0.9%.
   7. Retire el animal de la cámara de inducción y coloque su pecho sobre el electrodo de cuerpo.
   8. Suavemente Deslice la máscara de la anestesia sobre la nariz del ratón y colocarlo en su lugar. Bajar la salida de isoflurano al 1,5%.
   9. Llenar el implante y el electrodo de pasadores con solución salina y sujete con cuidado.
   10. Ajustar el tiempo de estimulación y la intensidad de la corriente.
   11. Verificar la calidad del contacto en el estimulador de tDCS. Contacto óptimo va de 7 a 10 en una escala del 1 al 10.
2. Estimulación
   1. Iniciar la estimulación.
   2. Observar la actual rampa para 30 s para el valor seleccionado y mantener la misma constante durante el tiempo establecido, entonces, al final de la sesión rampa abajo otra vez.
   3. Activar el botón simulado para los ratones de control.
   4. Observar la actual rampa para 30 s hasta el valor seleccionado y luego hasta 1 para el resto del período de estimulación con una rampa final al valor seleccionado en el extremo con una rampa consecutivo de bajada.
   5. Una vez finalizada la sesión de estimulación, transferir cuidadosamente el animal a una jaula de precalentado (37 ° C) durante 10 minutos.
      Tenga en cuenta. Animales comienzan a despertar después de 3 minutos.
   6. Apague el sistema de anestesia de inhalación.

Resultados

El protocolo quirúrgico presenta estabilidad del implante a largo plazo durante al menos un mes, no las señales inflamatorias en el sitio estimulado ni cualquier otro efecto no deseado. Todos los animales sobrevivieron a las sesiones de procedimiento y pinza quirúrgicas (n = 8). En este experimento, tDCS implantes fueron colocados sobre las cortezas de M1 y M2 (mm +1,0 antero-posterior y lateral de 0.0 mm a bregma). Una semana más tarde, tDCS (n = 3-4) y simulada (n = 3) ratones fuero...

Discusión

En los últimos años, técnicas de neuroestimulación han entrando práctica clínica como un procedimiento prometedor para el tratamiento de desordenes neuropsiquiátricos²³. Para reducir la restricción impuesta por la falta de conocimiento de los mecanismos de la neuroestimulación, presentamos aquí un modelo de ratón de tDCS lleva un electrodo que puede dirigirse a las regiones del cerebro. Ya que el electrodo es crónico implantable, este modelo animal permite la investigación de efectos ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Ultra-Fine 50U Syringe	BD	10033430026	For intraperitonially injection.
Shaver (Philips Multigroom)	Philips (Brazil)	QG3340/16	For surgical site trimming.
Surgical Equipment
Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	KOPF	940	For animal surgical restriction and positioning.
Model 922 Non-Rupture 60 Degree Tip Ear Bars	KOPF	922	For animal surgical restriction and positioning.
Cannula Holder	KOPF	1766-AP	For implant positioning.
Precision Stereo Zoom Binocular Microscope (III) on Boom Stand	WPI	PZMIII-BS	For bregma localization and implant positioning.
Temperature Control System Model	KOPF	TCAT-2LV	For animal thermal control.
Cold Light Source	WPI	WA-12633	For focal brightness
Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System with Scavenging	VetEquip	901820	For isoflurane delivery and safety.
VaporGuard Activated Charcoal Adsorption Filter	VetEquip	931401	Delivery system safety measures.
Model 923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder	KOPF	923-B	For animal restriction and O2 and isoflurane delivery.
Oxygen regulator, E-cylinder	VetEquip	901305	For O2 regulation and delivery.
Oxygen hose – green	VetEquip	931503	For O2 and isoflurane delivery.
Infrared Sterilizer 800 ºC	Marconi	MA1201	For instrument sterilization.
Surgical Instruments
Fine Scissors - ToughCut	Fine Science Tools	14058-11	For incision.
Surgical Hooks	INJEX	1636	In House Fabricated - Used to clear the surgical site from skin and fur.
Standard Tweezers or Forceps	-	-	For skin grasping.
Surgical Consumables
Vetbond	3M	SC-361931	For incision closing.
Cement and Catalyzer KIT (Duralay)	Reliance	2OZ	For implant fixation.
Sterile Cotton Swabs (Autoclaved)	JnJ	75U	For surgical site antisepsis.
24 Well Plate (Tissue Culture Plate)	SARSTEDT	831,836	For cement preparation.
Application Brush	parkell	S286	For cement mixing and application.
Pharmaceutics
Xylazin (ANASEDAN 2%)	Ceva Pharmaceutical (Brazil)	P10160	For anesthesia induction.
Ketamine (DOPALEN 10%)	Ceva Pharmaceutical (Brazil)	P30101	For anesthesia induction.
Isoflurane (100%)	Cristália (Brazil)	100ML	For anesthesia maintenance.
Lidocaine (XYLESTESIN 5%)	Cristal Pharma	-	For post-surgical care.
Ketoprofen (PROFENID 100 mg)	Sanofi Aventis	20ML	For post-surgical care.
Ringer's Lactate Solution	SANOBIOL LAB	7898153652145	For post-surgical care.
TobraDex (Dexamethasone 1 mg/g)	Alcon	631	For eye lubrification and protection.
Stimulation
Animal Transcranial Stimulator	Soterix Medical	2100	For current generation.
Pin-type electrode Holder (Cylindrical Holder Base)	Soterix Medical	2100	Electrode support (Implant).
Pin-type electrode (Ag/AgCl)	Soterix Medical	2100	For current delivery (electrode).
Pin-type electrode cap	Soterix Medical	2100	For implant protection.
Body Electrode (Ag/AgCl Coated)	Soterix Medical	2100	For current delivery (electrode).
Saline Solution (0.9%)	FarmaX	7896902206441	Conducting medium for current delivery.
Standard Tweezers or Forceps	-	-	For tDCS setup.
Real Time Polymerase Chain Reaction
BioRad CFX96 Real Time System	BioRad	C1000	For qPCR
SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix (5 X 1mL)	BioRad	1725271	For qPCR
Hard Shell PCR Plates PCT COM 50 p/ CFX96	BioRad	HSP9601	For qPCR
Microseal "B" seal pct c/ 100	BioRad	MSB1001	For qPCR