Постоянного тока транскраниальной стимуляции (ЦТД) у мышей

Резюме

Постоянного тока транскраниальной стимуляции (ЦТД) является лечебный метод предложил для лечения психических заболеваний. Животную модель имеет важное значение для понимания конкретных биологические изменения, вызываемые ЦТД. Этот протокол описывает модель мыши ЦТД, использующая хронически имплантированных электродов.

Аннотация

Постоянного тока транскраниальной стимуляции (ЦТД) является методом неинвазивной neuromodulation, предложил в качестве альтернативного или дополнительного лечения для нескольких психоневрологических заболеваний. Биологические эффекты ЦТД полностью не поняты, которые отчасти объясняется из-за трудностей в получении ткани человеческого мозга. Этот протокол описывает модель мыши ЦТД, использующая хронически имплантированных электродов, позволяя изучение долгосрочных биологических эффектов ЦТД. В этой экспериментальной модели ЦТД изменения экспрессии генов корковых и предлагает выдающийся вклад в понимание обоснование для терапевтического использования.

Введение

Постоянного тока транскраниальной стимуляции (ЦТД) является неинвазивным, лоу кост, терапевтический метод, который фокусируется на нейрональных модуляция с помощью малой интенсивности непрерывное токов¹. Есть в настоящее время двух установок (одна и cathodal) для ЦТД. Хотя одна стимуляция оказывает текущее электрическое поле слишком слабы, чтобы вызвать потенциалы действия, электрофизиологии исследования показали, что этот метод производит изменения в синаптической пластичности². Например доказательств показывает, что ЦТД индуцирует долгосрочные потенцирование (LTP) эффекты, такие как увеличение пиковых амплитудно возбуждающих постсинаптических потенциалов^3,4 и модуляции корковой возбудимости⁵.

И наоборот cathodal стимуляция вызывает ингибирование, что приводит к мембране гиперполяризации⁶. Гипотеза для этого механизма на основе физиологических выводов, где описывается ЦТД для модуляции частоты потенциал действия и продолжительности в нейрональных тела³. В частности этот эффект не напрямую вызывают потенциалы действия, хотя он может перейти порог деполяризации и содействовать или препятствовать нейронов стрельбы⁷. Эти контрастных эффекты мы продемонстрировали ранее. Например одна и cathodal стимуляции противоположные последствия условных реакций зарегистрировано активности через электромиографии в кроликов⁸. Однако исследования также показали, что пролонгированной стимуляции одна сессий может привести к снижению возбудимости увеличение cathodal токи могут привести к возбудимости, представляя самостоятельно контрастных эффекты³.

Как одна, так и cathodal стимулам агрегирования использование электродных пар. Например одна стимуляции, «активный» или «анод» электрода помещается над областью мозга для модуляции, тогда как «ссылка» или «катод» электрод расположен над регионом, где эффект тока предполагается незначительное⁹. В cathodal стимуляции перевернут расположения электродов. Интенсивность стимуляции для эффективного ЦТД зависит от текущей интенсивности и электрода аспекты, которые затрагивают электрического поля по-разному¹⁰. В наиболее опубликованных исследований, средняя интенсивность тока составляет 0,10 до 2.0 мА и 0,1 мА до 0,8 мА для человека и мышей, соответственно^6,11. Хотя электродов размером 35 см² обычно используется в организме человека, отсутствует надлежащее понимание относительно размеров электродов для грызунов и более тщательное расследование является необходимой⁶.

ЦТД было предложено в клинических исследованиях с попыткой предоставления альтернативного или дополнительного лечения для нескольких неврологических и нервно-психических расстройств¹¹ таких как эпилепсия¹², биполярное расстройство¹³, ход⁵ , майор¹⁴депрессии, болезни Альцгеймера¹⁵, рассеянный склероз¹⁶ и болезнь Паркинсона¹⁷. Несмотря на растущий интерес к ЦТД и его использование в клинических испытаний, подробные сотовых и молекулярных вызвали изменения в ткани мозга, короткие и долгосрочные последствия, а также поведенческих результатов, являются еще более глубоко быть расследовано^{18, 19}. Поскольку прямой человека подход к тщательно изучить ЦТД не является жизнеспособным, использование ЦТД животной модели могут предложить ценную информацию в клеточном и молекулярном события, лежащие в основе терапевтические механизмы ЦТД благодаря доступности для ткани головного мозга животного.

Имеющиеся данные ограничены относительно ЦТД моделей мышей. Большинство сообщенных моделей используются различные разработке макетов, электрод размеры и материалы. Например, Винклер и др. (2017) имплантированных головы электрода (Ag/AgCl, 4 мм в диаметре), наполненный соленой и зафиксировал его череп с акриловой цемента и винты²⁰. Отличается от нашего подхода, их груди электрод был имплантирован (платины, 20 x 1,5 мм). Nasehi и др. (2017) используется процедура очень похож на наш, хотя грудной электрод был сделан из солевых пропитанной губкой (углерода заполнены, 9,5 см²)²¹. Другое исследование имплантированных обоих электродов в голову животного, которое было достигнуто с помощью фиксированной пластин и охватывающих голова животного с дирижером гидрогеля²². Здесь мы описываем ЦТД мыши модель, которая использует хронически имплантированных электродов через простой хирургических процедур и ЦТД установки (рис. 1).

протокол

Отдельно расположенный взрослых мужчин (8-12 недель) мышей C57BL/6 были использованы в этом эксперименте. Животные получили должного ухода до, во время и после экспериментальных процедур с пищей и водой ad libitum. Все процедуры были утверждены Комитетом животных этики из федерального университета Минас-Жерайс (протокол № 59/2014).

1. электрод размещение

1. Седативным и фиксирующий животное на стереотаксического аппарата
   1. Стерилизуйте всех хирургических инструментов.
      Роман Хирургические инструменты были стерилизуют в течение 3 минут на 440 ° C. Ватные палочки были газобетона в 20 psi (паундов на квадратный дюйм) при 121 ° C в течение 20 мин.
   2. Отрегулируйте тепловые платформа контроллер до 37 ° C.
   3. Вес животного и рассчитать соответствующие дозы для индукции анестезии. Используйте смесь кетамина и ксилазина в дозе 100 мг/кг кетамина и 8 мг/кг Ксилазина, учитывая внутрибрюшинно (размер иглы, 31 G). Животное должно заснуть в течение 2-3 мин.
   4. Используйте электрические бритвы или бритву для бритья вниз хирургической сайта.
   5. Место животных на стереотаксического аппарата над подогретым нагревательную пластину.
   6. Держите голову животного и вставьте кончик уха баров в каждой из животных уши, чтобы исправить это для стереотаксического платформы.
   7. Убедитесь, что существует не бокового ветра головы и немного вертикального движения после медленно перемещая позиционирования головки животного.
   8. Мягко скользить нос мыши анестезии маски и исправить ее на месте, завинтив винт.
   9. Установите изофлюрановая на 1% с 1,0 Л/мин O₂.
   10. Применять мазь глаз для глаза животного для предотвращения высыхания роговицы во время операции.
2. Придавая имплантат голова животного
   1. Для подготовки хирургической сайта с трех чередующихся скрабы повидон йод (или 2% хлоргексидин) использовать ватные тампоны и 70% этиловом спирте.
   2. Используйте пинцет для проверки глубины анестезии, слегка сжимая пальцами животного и проверка потери животного педали вывода (мыс пинча) рефлекс.
   3. Сделать надрез около 3 мм, задняя линия уха животного и остановки на линии глаз. Разрез сайт должен иметь примерно 1 см в длину, чтобы быть достаточно большим, чтобы получить имплантата.
   4. Аккуратно почистить черепа с кости скребок для улучшения клей и цемент присоединения. Сделать этот свет в одиночку с намерением создать микро царапин.
   5. Осторожно поместите хирургические крючки для сыпучих кожи для поддержания открытой операционного поля и свободной от препятствий такие, как кожи и меха.
   6. Используйте стерильным ватным тампоном для сухой кожи головы животного.
   7. Используйте рассечения микроскоп для визуализации в верхней части черепа животных.
   8. Придавать стереотаксического держателя иглы и найдите bregma. Положение иглы непосредственно над головой животного, слегка касаясь bregma.
   9. Обнулите все координаты на цифровой трассирующими и затем поднимите иглу.
   10. Исправьте ЦТД имплантат на держателе стереотаксического. Наведите имплантат животного голову и медленно опустите его на области интереса, с использованием надлежащего стереотаксического координат.
   11. Супер клей на имплантат базы используйте иглы для распространения 1 капля (около 35 мкл).
   12. Медленно перемещайте держатель вниз, пока он не коснется черепа. Убедитесь, что база имплантата является полностью в контакте с поверхностью.
   13. Подготовьте хирургические цемента согласно инструкциям производителя.
   14. После точного позиционирования, применяются 3 тонким, равномерным слоем цемента через черепной коробки и на нижнюю часть имплантата. Нанесите каплю на каплю с помощью приложения кисти. Слои должны образовывать Хилл образной структуры для дальнейшего структурной поддержки имплантата.
   15. Оставьте имплантат винтовой поток чистого цемента для соединения гладких, беспрепятственный.
   16. Разрешить каждый слой для просушки на примерно 4 минуты.
   17. При сухой, осторожно удалите держатель до тех пор, пока он полностью отделен от имплантата. Всегда используйте крайнюю осторожность при обработке имплантата, так как это может быть случайно извлечены из череп животного.
3. Отделочные операции и послеоперационный уход
   1. Увлажняют кожу животного на сайте разрез физиологического раствора пропитанной ватным тампоном.
   2. Слой кожи над базой ЦТД имплантата.
   3. Используйте пинцет для сближения ткани и закрыть разрез с капли клея хирургического ткани на 0,2 см ткани.
   4. Проникнуть в 1-2% лидокаин на сайте разрез и лежащие в основе тканей.
   5. Гидрат мыши с 500 мкл раствора рингера лактата подкожно.
   6. Поместите курсор мыши в клетку чистой, сингл здание подогретым (37 ° C).
   7. Положите небольшое блюдо с мокрой питания гранулы в клетке для легкого доступа к продовольствию в следующие часы.
   8. Зарегистрируйте послеоперационные веса животного.
   9. Подкожно дать животных кетопрофена (5 мг/кг), после операции и на ближайшие 2 дня.
   10. Контролировать восстановление животного тесно для по крайней мере за 1 неделю. Оцените любой знак бедствия, такие как piloerection, отсутствие ухода, снижение локомоции, царапин раны и воспаления хирургической сайта.

2. ЦТД установки и стимуляции

1. ЦТД установки (см. Рисунок 2)
   Примечание. Убедитесь, что ЦТД стимулятор полностью заряжена.
   1. Присоедините кабели анодом и катодом к стимулятор ЦТД и сделать их доступными рядом с сайта стимуляции. Прикрепите ПИН тип электрода для стереотаксического держателя.
   2. Установите платформу тепловой до 37 ° C.
   3. Включите расходомера кислорода на системе ингаляционной анестезии до 1 Л/мин.
   4. Поместите указатель мыши в камеру индукции анестезии.
   5. Включите изофлюрановая испарителя до 3%. Позвольте животным пройти изофлюрановая эффекты на 4 мин.
   6. В то время как животное находится в зале индукции, используйте стерильный шприц для заполнения тело электрод с 0,9% физиологического раствора.
   7. Удаление животное из камеры для индукции и расположите ее груди над тело электрод.
   8. Мягко скользить нос мыши анестезии маски и исправить ее на месте. Нижняя изофлюрановая вывода до 1,5%.
   9. Заполнить имплантат и pin типа электрода с солевой раствор и тщательно прикрепить их.
   10. Отрегулируйте время стимуляции и интенсивность тока.
   11. Проверьте качество контакта на ЦТД стимулятор. Оптимальный контакт идет от 7 до 10 по шкале 1-10.
2. Стимуляция
   1. Запустите стимуляции.
   2. Наблюдать за текущей ramping вверх для 30 s выбранное значение и поддержания себя устойчивый на установленный срок, а затем, в конце сессии, наращивает вниз снова.
   3. Активируйте кнопку Шам для управления мышей.
   4. Наблюдать за текущей ramping вверх для 30 s в выбранное значение, а затем вплоть до 1 для остальной части периода стимуляции с окончательной пандус к значению, выбранному в конце с подряд пандус вниз.
   5. После завершения сеанса стимуляции тщательно передачи животное в клетке подогретым (37 ° C) 10 мин.
      Роман Животные начинают пробудить через 3 мин.
   6. Выключите систему ингаляционной анестезии.

Результаты

Хирургический протокол представлен долгосрочной стабильности имплантата для по крайней мере один месяц, без воспалительных сигналы на объекте стимулируется, ни любой другой нежелательный эффект. Все животные выжили хирургические процедуры и ЦТД сессий (n = 8). В этом э...

Обсуждение

В последние годы нейростимуляция методы ввода клинической практике как перспективный процедура для лечения нервно-психиатрическими расстройствами²³. Чтобы уменьшить ограничения, налагаемые отсутствие знаний о механизмах нейростимуляция, мы представили здесь модель мыш...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Ultra-Fine 50U Syringe	BD	10033430026	For intraperitonially injection.
Shaver (Philips Multigroom)	Philips (Brazil)	QG3340/16	For surgical site trimming.
Surgical Equipment
Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	KOPF	940	For animal surgical restriction and positioning.
Model 922 Non-Rupture 60 Degree Tip Ear Bars	KOPF	922	For animal surgical restriction and positioning.
Cannula Holder	KOPF	1766-AP	For implant positioning.
Precision Stereo Zoom Binocular Microscope (III) on Boom Stand	WPI	PZMIII-BS	For bregma localization and implant positioning.
Temperature Control System Model	KOPF	TCAT-2LV	For animal thermal control.
Cold Light Source	WPI	WA-12633	For focal brightness
Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System with Scavenging	VetEquip	901820	For isoflurane delivery and safety.
VaporGuard Activated Charcoal Adsorption Filter	VetEquip	931401	Delivery system safety measures.
Model 923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder	KOPF	923-B	For animal restriction and O2 and isoflurane delivery.
Oxygen regulator, E-cylinder	VetEquip	901305	For O2 regulation and delivery.
Oxygen hose – green	VetEquip	931503	For O2 and isoflurane delivery.
Infrared Sterilizer 800 ºC	Marconi	MA1201	For instrument sterilization.
Surgical Instruments
Fine Scissors - ToughCut	Fine Science Tools	14058-11	For incision.
Surgical Hooks	INJEX	1636	In House Fabricated - Used to clear the surgical site from skin and fur.
Standard Tweezers or Forceps	-	-	For skin grasping.
Surgical Consumables
Vetbond	3M	SC-361931	For incision closing.
Cement and Catalyzer KIT (Duralay)	Reliance	2OZ	For implant fixation.
Sterile Cotton Swabs (Autoclaved)	JnJ	75U	For surgical site antisepsis.
24 Well Plate (Tissue Culture Plate)	SARSTEDT	831,836	For cement preparation.
Application Brush	parkell	S286	For cement mixing and application.
Pharmaceutics
Xylazin (ANASEDAN 2%)	Ceva Pharmaceutical (Brazil)	P10160	For anesthesia induction.
Ketamine (DOPALEN 10%)	Ceva Pharmaceutical (Brazil)	P30101	For anesthesia induction.
Isoflurane (100%)	Cristália (Brazil)	100ML	For anesthesia maintenance.
Lidocaine (XYLESTESIN 5%)	Cristal Pharma	-	For post-surgical care.
Ketoprofen (PROFENID 100 mg)	Sanofi Aventis	20ML	For post-surgical care.
Ringer's Lactate Solution	SANOBIOL LAB	7898153652145	For post-surgical care.
TobraDex (Dexamethasone 1 mg/g)	Alcon	631	For eye lubrification and protection.
Stimulation
Animal Transcranial Stimulator	Soterix Medical	2100	For current generation.
Pin-type electrode Holder (Cylindrical Holder Base)	Soterix Medical	2100	Electrode support (Implant).
Pin-type electrode (Ag/AgCl)	Soterix Medical	2100	For current delivery (electrode).
Pin-type electrode cap	Soterix Medical	2100	For implant protection.
Body Electrode (Ag/AgCl Coated)	Soterix Medical	2100	For current delivery (electrode).
Saline Solution (0.9%)	FarmaX	7896902206441	Conducting medium for current delivery.
Standard Tweezers or Forceps	-	-	For tDCS setup.
Real Time Polymerase Chain Reaction
BioRad CFX96 Real Time System	BioRad	C1000	For qPCR
SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix (5 X 1mL)	BioRad	1725271	For qPCR
Hard Shell PCR Plates PCT COM 50 p/ CFX96	BioRad	HSP9601	For qPCR
Microseal "B" seal pct c/ 100	BioRad	MSB1001	For qPCR