Transcraniana por corrente contínua estimulação (tDCS) em ratos

Resumo

Estimulação transcraniana de corrente contínua (tDCS) é uma técnica terapêutica proposta para tratar doenças psiquiátricas. Um modelo animal é essencial para entender as alterações biológicas específicas evocadas por tDCS. Este protocolo descreve um modelo do rato tDCS que utiliza um eletrodo implantado cronicamente.

Resumo

Estimulação transcraniana de corrente contínua (tDCS) é uma técnica de neuromodulação não-invasiva, proposta como um tratamento alternativo ou complementar para várias doenças neuropsiquiátricas. Os efeitos biológicos das tDCS não são totalmente compreendidos, que em parte é explicado devido à dificuldade na obtenção de tecido do cérebro humano. Este protocolo descreve um modelo do rato tDCS que utiliza um eletrodo implantado cronicamente permitindo o estudo dos efeitos biológicos duradouro das tDCS. Neste modelo experimental, tDCS altera a expressão do gene cortical e oferece uma contribuição proeminente para o entendimento da justificativa para seu uso terapêutico.

Introdução

Estimulação transcraniana de corrente contínua (tDCS) é uma técnica não-invasiva, de baixo custo, terapêutica, que se centra na modulação neuronal através do uso de correntes contínuas de baixa intensidade¹. Atualmente existem duas configurações (anodal e cathodal da) para tDCS. Enquanto que a estimulação anodal exerce um campo elétrico atual fraco demais para desencadear potenciais de ação, eletrofisiologia estudos têm demonstrado que este método produz alterações na plasticidade sináptica². Por exemplo, a evidência mostra que tDCS induz os efeitos a longo prazo (LTP) de potenciação como pico maior amplitude dos potenciais pós-sinápticos excitatórios^3,4 e modulação da excitabilidade cortical⁵.

Por outro lado, cathodal da estimulação induz a inibição, resultando em hiperpolarização de membrana⁶. Uma hipótese para este mecanismo é baseada nas observações fisiológicas onde tDCS é descrita para modular a frequência do potencial de ação e duração no corpo neuronal³. Notavelmente, este efeito não diretamente evocar potenciais de ação, que pode deslocar o limiar de despolarização e facilitar ou dificultar o disparo neuronal⁷. Estes efeitos de contraste tenham sido demonstradas anteriormente. Por exemplo, estimulação anodal e cathodal da produziu efeitos opostos em respostas condicionados registradas através de eletromiografia atividade em coelhos⁸. No entanto, estudos mostraram também que sessões de estimulação anodal prolongada podem diminuir a excitabilidade enquanto crescente cathodal da correntes pode levar a excitabilidade, apresentando auto contraste efeitos³.

Estímulos anodal e cathodal da agregam o uso de pares de eletrodo. Por exemplo, na estimulação anodal, "ativo" ou "ânodo" eletrodo é colocado sobre a região do cérebro a ser modulada, Considerando que o eletrodo "referência" ou "raios catódicos" situa-se sobre uma região onde o efeito da corrente é considerado insignificante⁹. Na cathodal da estimulação, disposição de eletrodo é invertida. A intensidade de estimulação para tDCS eficaz depende da intensidade de corrente e dimensões de eletrodo, que afectam o elétrico de campo diferente¹⁰. Em estudos mais publicados, a intensidade de corrente média é entre 0,10 a 2,0 mA e 0.1 mA para 0,8 mA para humanos e ratos, respectivamente de^6,11. Embora o tamanho de eletrodo de 35cm² é normalmente usado em seres humanos, não há nenhuma compreensão adequada sobre dimensões de eletrodo para roedores e uma investigação mais aprofundada é necessário⁶.

tDCS foi proposto em estudos clínicos com a tentativa de oferecer um tratamento alternativo ou complementar para vários distúrbios neurológicos e neuropsiquiátricos¹¹ como epilepsia¹², transtorno bipolar¹³, acidente vascular cerebral⁵ , major depressão¹⁴, a doença de Alzheimer¹⁵, esclerose múltipla¹⁶ e a doença de Parkinson¹⁷. Apesar da crescente interesse em tDCS e sua utilização em ensaios clínicos, detalhada celular e moleculares evocadas alterações no tecido cerebral, curto e efeitos duradouros, bem como os resultados comportamentais, estão ainda ser mais profundamente investigada^{18, 19}. como uma abordagem humana direta para estudar exaustivamente tDCS não é viável, a utilização de um modelo animal tDCS pode oferecer insights valiosos sobre os eventos celulares e moleculares subjacentes os mecanismos terapêuticos das tDCS devido a acessibilidade para os tecido de cérebro do animal.

Evidência disponível é limitada em relação a modelos tDCS em camundongos. A maioria dos modelos relatados usado diferentes layouts responsável, eletrodo de dimensões e materiais. Por exemplo, Winkler et al . (2017) implantou o cabeça do eléctrodo (Ag/AgCl, 4 mm de diâmetro) preenchido com solução salina e fixa-lo ao crânio com acrílico de cimento e parafusos²⁰. Diferente da nossa abordagem, eletrodo seu peito foi implantado (platina, 20 x 1.5 mm). Nasehi et al . (2017) usado um procedimento muito semelhante ao nosso, embora o eletrodo torácico foi feito de uma esponja embebida em solução salina (carbono preenchido, 9,5 cm²)²¹. Outro estudo implantou os dois eléctrodos na cabeça do animal, o que foi conseguido usando placas fixas e cobrindo a cabeça do animal com um hidrogel condutor²². Aqui, descrevemos um modelo do rato tDCS que utiliza um eletrodo cronicamente implantado por meio cirúrgico procedimentos e tDCS configuração simples (Figura 1).

Protocolo

Adulto masculino alojados individualmente (8-12 semanas) camundongos C57BL/6 foram utilizados neste experimento. Os animais receberam cuidados antes, durante e após procedimentos experimentais com alimentos e água ad libitum. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética animal da Universidade Federal de Minas Gerais (protocolo número 59/2014).

1. colocação do eletrodo

1. Sedativo e fixando o animal para o aparelho estereotáxica
   1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos necessários.
      Romance Instrumentos cirúrgicos foram esterilizados por 3 minutos a 440 ° C. Cotonetes de algodão foram autoclavados a 20 psi (libras por polegada quadrada) a 121 ° C por 20 min.
   2. Ajuste o controlador térmico plataforma 37 ° c.
   3. Pesar o animal e calcular a dose adequada para a indução da anestesia. Use uma mistura de ketamina e xilazina, na dose de 100 mg/kg quetamina e 8 mg/kg xilazina, dada intraperitonealmente (tamanho de agulha, 31G). O animal deve dormir dentro de 2 a 3 min.
   4. Use um barbeador elétrico ou lâmina de barbear para depilar o local cirúrgico.
   5. Lugar do animal para o aparelho estereotáxica sobre o pré-aquecido a placa de aquecimento.
   6. Segure a cabeça do animal e inserir as barras de orelha de ponta em cada uma das orelhas do animal para corrigi-lo para a plataforma estereotáxica.
   7. Verifique se não há nenhum deslocamento cabeça lateral e pouco movimento vertical depois deslocando lentamente a cabeça do animal de posicionamento.
   8. Delicadamente, deslize a máscara de anestesia sobre o nariz do rato e fixá-lo apertando o parafuso.
   9. Defina o isoflurano a 1% com 1,0 L/min de O₂.
   10. Aplica a pomada para os olhos do animal para evitar a secura da córnea durante a cirurgia.
2. Anexar o implante na cabeça do animal
   1. Use os cotonetes de algodão para preparar o local cirúrgico com três esfrega alternadas de iodo-povidona (ou clorexidina 2%) e 70% de etanol.
   2. Use um par de pinças para verificar a profundidade de anestesia levemente apertando os dedos do animal e verificar a perda do reflexo de retirada de pedal (pitada de dedo do pé) do animal.
   3. Fazer uma incisão de cerca de 3 mm posterior à linha de orelha do animal e parar na linha do olho. O local da incisão deve ter cerca de 1 cm de comprimento para ser grande o suficiente para receber o implante.
   4. Raspe suavemente o crânio com um raspador de osso para melhorar a colagem e a aderência do cimento. Fazer esta luz sozinho com a intenção de criar micro riscos.
   5. Posicione cuidadosamente cirúrgicos ganchos para manter o campo cirúrgico aberto e livre de obstruções, tais como pele e pelo, a pele frouxa.
   6. Use um cotonete estéril para secar o couro cabeludo do animal.
   7. Use um microscópio de dissecação para visualizar a parte superior do crânio do animal.
   8. Anexar uma agulha para o titular estereotáxica e localize o bregma. Posição da agulha diretamente acima da cabeça do animal, tocando ligeiramente o bregma.
   9. Zerar todas as coordenadas sobre o apalpador digital e em seguida levante a agulha.
   10. Fixe o implante tDCS sobre o titular estereotáxica. Posicionar o implante na cabeça do animal e abaixá-lo lentamente para a região de interesse usando as coordenadas estereotáxicos adequadas.
   11. Use uma agulha para espalhar 1 gota (aproximadamente 35 μL) de super cola na base do implante.
   12. Mova lentamente o titular para baixo até que toca o crânio. Certifique-se de que a base do implante está inteiramente em contato com a superfície.
   13. Prepare o cimento cirúrgico de acordo com as instruções do fabricante.
   14. Após o posicionamento preciso, aplicar 3 fina, nem camada de cimento em todo o crânio e para a parte inferior do implante. Aplique a gota por gota, usando um pincel de aplicação. Camadas devem formar uma estrutura em forma de colina para mais apoio estrutural do implante.
   15. Deixe a rosca do implante limpo de cimento para permitir uma conexão desobstruída, suave.
   16. Permitir que cada camada secar por aproximadamente 4 minutos.
   17. Quando seco, remova cuidadosamente o titular até que seja completamente separado do implante. Sempre use extremo cuidado ao manusear o implante, já que isso pode ser acidentalmente extraído do crânio do animal.
3. Terminar a cirurgia e cuidados pós-cirúrgicos
   1. Hidrate a pele do animal no local da incisão com um cotonete embebido em solução salina.
   2. Casaco de pele por cima da base do implante tDCS.
   3. Use um par de pinças para unir o tecido e fechar a incisão com uma gota de cola de tecido cirúrgico por 0,2 cm do tecido.
   4. Infiltrar-se 1-2% de lidocaína no local da incisão e subjacentes tecidos.
   5. Hidrate o mouse com 500 µ l de solução de lactato de Ringer por via subcutânea.
   6. Coloque o mouse em uma gaiola limpa, alojados em single de pré-aquecido (37 ° C).
   7. Coloque um pequeno prato com pelotas de alimentos molhados na gaiola para facilitar o acesso à comida nas horas seguintes.
   8. Registre peso pós-cirúrgica do animal.
   9. Dar o animal cetoprofeno (5 mg/kg) por via subcutânea após a cirurgia e nos próximos 2 dias.
   10. Acompanhar a recuperação do animal de perto pelo menos 1 semana. Avalie qualquer sinal de stress, tais como Piloereção, falta de higiene, locomoção reduzida, coçar ferida e inflamação do local cirúrgico.

2. tDCS Setup e estimulação

1. tDCS Setup (ver Figura 2)
   Nota. Certifique-se de que o estimulador tDCS está totalmente carregado.
   1. Conecte os cabos do ânodo e o cátodo ao estimulador tDCS e disponibilizá-los perto do local de estimulação. Anexe o eletrodo tipo pino para o titular estereotáxica.
   2. Definir a plataforma termal a 37 ° C.
   3. Ligue o medidor de fluxo de oxigênio no sistema de anestesia por inalação de 1 L/min.
   4. Posicione o mouse na câmara de indução da anestesia.
   5. Ligue o vaporizador de isoflurano para 3%. Permitir que o animal se submeter a efeitos de isoflurano durante 4 min.
   6. Enquanto o animal está na câmara de indução, use uma seringa estéril para preencher o eléctrodo de corpo com solução salina 0,9%.
   7. Remover o animal da câmara de indução e posicione seu peito sobre o eléctrodo de corpo.
   8. Delicadamente, deslize a máscara de anestesia sobre o nariz do rato e fixá-lo. Baixa a saída de isoflurano para 1,5%.
   9. Encher o implante e o eletrodo tipo pino com soro e cuidadosamente anexá-los.
   10. Ajuste o tempo de estimulação e intensidade de corrente.
   11. Verificar a qualidade de contato em tDCS estimulador. Contato ideal vai de 7 a 10, numa escala de 1 a 10.
2. Estimulação
   1. Começa a estimulação.
   2. Observar o atual de rampa por 30 s para o valor selecionado e mantendo-se firme pelo tempo estabelecido, então, no final da sessão de rampa para baixo novamente.
   3. Ative o botão de Souza para ratos controle.
   4. Observar o atual de rampa por 30 s ao valor selecionado e, em seguida, para baixo a 1 para o resto do período de estimulação com uma rampa final ao valor selecionado no final com uma rampa consecutivo para baixo.
   5. Uma vez concluída a sessão de estimulação, transferi cuidadosamente o animal a uma gaiola pré-aquecido (37 ° C) por 10 min.
      Nota. Os animais começam a despertar após 3 min.
   6. Desliga o sistema de anestesia por inalação.

Resultados

O protocolo cirúrgico apresentou estabilidade a longo prazo do implante pelo menos um mês, sem sinais inflamatórios no local estimulado, nem qualquer outro efeito indesejado. Todos os animais sobreviveram as sessões de procedimento e tDCS cirúrgicas (n = 8). Neste experimento, tDCS implantes foram posicionados sobre os córtices M1 e M2 (+1,0 mm ântero-posterior e lateral de 0.0 mm para bregma). Uma semana depois, tDCS (n = 3-4) e sham (n = 3) ratos foram estimulados por cinco dias ...

Discussão

Nos últimos anos, técnicas de neuroestimulação tem sido entrar em prática clínica como um procedimento promissor para tratar distúrbios neuropsiquiátricos²³. Para reduzir a restrição imposta pela falta de conhecimento dos mecanismos de neuroestimulação, aqui apresentamos um modelo de mouse tDCS carregando um eletrodo que pode direcionar a regiões do cérebro. Desde que o eletrodo é cronicamente implantável, este modelo animal permite a investigação de efeitos biológicos de longa ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Ultra-Fine 50U Syringe	BD	10033430026	For intraperitonially injection.
Shaver (Philips Multigroom)	Philips (Brazil)	QG3340/16	For surgical site trimming.
Surgical Equipment
Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	KOPF	940	For animal surgical restriction and positioning.
Model 922 Non-Rupture 60 Degree Tip Ear Bars	KOPF	922	For animal surgical restriction and positioning.
Cannula Holder	KOPF	1766-AP	For implant positioning.
Precision Stereo Zoom Binocular Microscope (III) on Boom Stand	WPI	PZMIII-BS	For bregma localization and implant positioning.
Temperature Control System Model	KOPF	TCAT-2LV	For animal thermal control.
Cold Light Source	WPI	WA-12633	For focal brightness
Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System with Scavenging	VetEquip	901820	For isoflurane delivery and safety.
VaporGuard Activated Charcoal Adsorption Filter	VetEquip	931401	Delivery system safety measures.
Model 923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder	KOPF	923-B	For animal restriction and O2 and isoflurane delivery.
Oxygen regulator, E-cylinder	VetEquip	901305	For O2 regulation and delivery.
Oxygen hose – green	VetEquip	931503	For O2 and isoflurane delivery.
Infrared Sterilizer 800 ºC	Marconi	MA1201	For instrument sterilization.
Surgical Instruments
Fine Scissors - ToughCut	Fine Science Tools	14058-11	For incision.
Surgical Hooks	INJEX	1636	In House Fabricated - Used to clear the surgical site from skin and fur.
Standard Tweezers or Forceps	-	-	For skin grasping.
Surgical Consumables
Vetbond	3M	SC-361931	For incision closing.
Cement and Catalyzer KIT (Duralay)	Reliance	2OZ	For implant fixation.
Sterile Cotton Swabs (Autoclaved)	JnJ	75U	For surgical site antisepsis.
24 Well Plate (Tissue Culture Plate)	SARSTEDT	831,836	For cement preparation.
Application Brush	parkell	S286	For cement mixing and application.
Pharmaceutics
Xylazin (ANASEDAN 2%)	Ceva Pharmaceutical (Brazil)	P10160	For anesthesia induction.
Ketamine (DOPALEN 10%)	Ceva Pharmaceutical (Brazil)	P30101	For anesthesia induction.
Isoflurane (100%)	Cristália (Brazil)	100ML	For anesthesia maintenance.
Lidocaine (XYLESTESIN 5%)	Cristal Pharma	-	For post-surgical care.
Ketoprofen (PROFENID 100 mg)	Sanofi Aventis	20ML	For post-surgical care.
Ringer's Lactate Solution	SANOBIOL LAB	7898153652145	For post-surgical care.
TobraDex (Dexamethasone 1 mg/g)	Alcon	631	For eye lubrification and protection.
Stimulation
Animal Transcranial Stimulator	Soterix Medical	2100	For current generation.
Pin-type electrode Holder (Cylindrical Holder Base)	Soterix Medical	2100	Electrode support (Implant).
Pin-type electrode (Ag/AgCl)	Soterix Medical	2100	For current delivery (electrode).
Pin-type electrode cap	Soterix Medical	2100	For implant protection.
Body Electrode (Ag/AgCl Coated)	Soterix Medical	2100	For current delivery (electrode).
Saline Solution (0.9%)	FarmaX	7896902206441	Conducting medium for current delivery.
Standard Tweezers or Forceps	-	-	For tDCS setup.
Real Time Polymerase Chain Reaction
BioRad CFX96 Real Time System	BioRad	C1000	For qPCR
SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix (5 X 1mL)	BioRad	1725271	For qPCR
Hard Shell PCR Plates PCT COM 50 p/ CFX96	BioRad	HSP9601	For qPCR
Microseal "B" seal pct c/ 100	BioRad	MSB1001	For qPCR