טראנס זרם ישיר גירוי (tDCS) בעכברים

Summary

טראנס זרם ישיר גירוי (tDCS) היא טכניקה טיפולית הציע לטפל במחלות פסיכיאטריות. במודל חיה חיונית להבנת שינויים ביולוגיים ספציפיים עורר באמצעות tDCS. פרוטוקול זה מתאר מודל העכבר tDCS המשתמשת אלקטרודה מושתל באופן כרוני.

Abstract

טראנס זרם ישיר גירוי (tDCS) היא טכניקה neuromodulation פולשני המוצע כטיפול אלטרנטיבית או משלימה למחלות מנוטלי מספר. השפעות ביולוגיות של tDCS הם לא מובן במלואו, כפי שמוסבר בחלקו בשל הקושי בהשגת רקמת המוח האנושי. פרוטוקול זה מתאר מודל העכבר tDCS המשתמשת אלקטרודה מושתל באופן כרוני המאפשר הלימוד לטווח ארוך השפעות ביולוגיות tDCS. במודל זה ניסיוני, tDCS שינויים בביטוי הגן קורטיקלית ומציע תרומה בולטת ההבנה של הרציונל לשימוש טיפולית שלה.

Introduction

טראנס זרם ישיר גירוי (tDCS) היא שיטה לא פולשנית, בעלות נמוכה, טיפולית, אשר מתמקדת אפנון עצביים באמצעות זרמי רציף בעוצמה נמוכה¹. כיום יש שני הייעודיות (anodal ו- cathodal) tDCS. בזמן הגירוי anodal מפעילה שדה חשמלי הנוכחי חלש מדי כדי לעורר פוטנציאל פעולה, אלקטרופיזיולוגיה מחקרים הראו כי שיטה זו מייצרת שינויים הפלסטיות הסינפטית². לדוגמה, ראיות מראה ש-tdcs הזה גורם השפעות ארוכות טווח potentiation (LTP) משרעת השיא מוגברת של^3,פוטנציאל postsynaptic סינאפסות⁴ ו אפנון דעתנית קורטיקלית⁵.

לעומת זאת, גירוי cathodal גורם עיכוב, וכתוצאה מכך ממברנה hyperpolarization⁶. השערה על מנגנון זה מבוסס על ממצאים פיזיולוגיים שבה מתואר tDCS כדי לווסת את פוטנציאל הפעולה התדירות והמשך של הגוף עצביים³. ראוי לציין, אפקט זה לא ישירות לעורר פוטנציאל פעולה, למרות שניתן משמרת את הסף דפולריזציה, להקל או ה"בלתי ירי עצביים⁷. אלה מנוגדים אפקטים בעבר הוכחו. לדוגמה, גירוי anodal, cathodal מיוצר תופעות מנוגדות תגובות מותנה רשום דרך פעילות אלקטרומיוגרפיה ארנבים⁸. עם זאת, מחקרים הראו גם כי גירוי ממושך anodal הפעלות עשויה להקטין דעתנית בעוד הגדלת זרמים cathodal עלול להוביל דעתנית, הצגת אפקטים מנוגדים עצמית³.

הן anodal והן cathodal גירויים צבירה השימוש של זוגות אלקטרודות. לדוגמה, גירוי anodal, "פעיל" או "אנודת" האלקטרודה ממוקמת מעל האזור במוח כדי להיות מאופנן ואילו האלקטרודה "הפניה" או "קטודית" ממוקם מעל האזור שבו השפעת זרם ההנחה תהיה חשיבות⁹. בגירוי cathodal, אלקטרודה פריסה הוא הפוך. עוצמת גירוי עבור tDCS יעיל תלוי עוצמת הנוכחי, אלקטרודה ממדים, אשר משפיעים על החשמל שדה אחרת¹⁰. במחקרים שפורסמו ביותר, עוצמת הנוכחי הממוצע הוא בין 0.10 ל 2.0 mA ו- 0.1 מ- 0.8 אמא לבן אדם ועכברים, בהתאמה^6,11. למרות גודל האלקטרודה 35 ס מ² משמש בדרך כלל אצל בני אדם, יש אין הבנה נכונה לגבי אלקטרודה הממדים עבור מכרסמים, חקירה יסודית יותר הוא נדרש⁶.

tDCS הוצע במחקרים קליניים עם הניסיון של המציע טיפול אלטרנטיבית או משלימה עבור והפרעות נוירולוגיות מנוטלי מספר¹¹ כגון אפילפסיה¹², הפרעה דו קוטבית¹³, קו⁵ , רס ן דיכאון¹⁴, מחלת אלצהיימר¹⁵, טרשת נפוצה¹⁶ ו מחלת פרקינסון¹⁷. למרות גוברת ההתעניינות tDCS והשימוש בו ניסויים קליניים, הסלולר מפורט מולקולרית עורר שינויים ברקמת המוח, קצר, תופעות לטווח ארוך, וכן תוצאות התנהגותיות, הן עדיין להיות עמוק יותר נחקר^{18, 19}. מאז בגישה אנושית ישירה ללמוד ביסודיות tDCS אינה ברת קיימא, השימוש במודל חיה tDCS עשויים להציע תובנות לתוך האירועים תאית ומולקולרית בבסיס המנגנון הטיפולי של tDCS עקב הנגישות רקמת המוח של בעל החיים.

הראיות הזמינות מוגבל לגבי דגמים tDCS בעכברים. רוב הדגמים שדווחה להשתמש בפריסות שונות implanting, אלקטרודה מידות וחומרים. לדוגמה, וינקלר. et al. (2017) מושתל האלקטרודה ראש (Ag/AgCl, 4 מ מ קוטר) מלא עם תמיסת מלח ותיקנו אותה בגולוגולת עם מלט וברגים אקריליק²⁰. שונה מן הגישה שלנו, אלקטרודה החזה שלהם היה מושתל (פלטינה, 20 x 1.5 מ מ). . Nasehi et al. (2017) היה תהליך מאוד דומה לשלנו, למרות האלקטרודה בית החזה עשוי ספוג ספוג תמיסת מלח (פחמן מלא, 9.5 ס מ²)²¹. מחקר אחר מושתלים שתי אלקטרודות לראש של החיה, אשר הושגה על ידי שימוש קבוע צלחות וכיסוי הראש של החיה עם מנצח הידרוג²². כאן נתאר מודל העכבר tDCS המשתמשת אלקטרודה מושתל באופן כרוני דרך הגדרת פשוטה עם כירורגית הליכים ו tDCS (איור 1).

Protocol

המלון שוכן באופן אינדיבידואלי מבוגר זכר (8-12 שבועות) עכברים C57BL/6 שימשו בניסוי זה. בעלי חיים קיבל טיפול נאות לפני, במהלך ואחרי הטיפול. הניסיוני עם מים ואוכל ad libitum. כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה בעלי חיים מן האוניברסיטה הפדרלית של מינאס ז'ראיס (פרוטוקול מספר 59/2014).

1. אלקטרודה השמה

1. לסמם, קיבעון החיה על המנגנון stereotaxic
   1. לעקר את כל מכשירי הניתוח הדרוש.
      שימו לב. כלים כירורגים חיטוי במשך 3 דקות ב 440 º C. ספוגיות כותנה היו בלוק בבית 20 psi (פאונד לאינץ מרובע) ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   2. להתאים את הבקר תרמי פלטפורמה ל- 37 מעלות צלזיוס.
   3. שוקל החיה ולחשב את המינון המתאים עבור אינדוקציה הרדמה. השתמש תערובת של קטמין חריגות השירותים הווטרינריים במינון של 100 מ ג/ק ג קטמין ו- 8 מ ג/ק ג חריגות השירותים הווטרינריים, ניתנה intraperitoneally (גודל מחט, 31 G). החיה צריך להירדם בתוך 2-3 דקות.
   4. להשתמש גילוח או גילוח לגלח למטה באתר כירורגית.
   5. המקום החיה על המנגנון stereotaxic מעל ומחוממת טרום חימום צלחת.
   6. תחזיק את הראש של החיה והכנס בפסי באוזן עצה לתוך כל אחד האוזניים של החיה לתקן אותה פלטפורמת stereotaxic.
   7. לאמת יש לא הסטת הראש לרוחב, תנועה אנכית קטנה לאחר על ידי הסטה לאט ראשה מיצוב.
   8. בעדינות להחליק את מסיכת ההרדמה על האף של העכבר ולתקן את זה במקום על ידי הידוק הבורג.
   9. הגדר את איזופלוריין 1% עם 1.0 L/דקה של O₂.
   10. להחיל משחה עיניים לעיניים של החיה כדי למנוע ייבוש הקרנית במהלך הניתוח.
2. הצמדת השתל לראש של החיה
   1. להשתמש את ספוגיות כותנה להכנת באתר כירורגית שהמדים לסירוגין שלושה povidone יוד (או 2% chlorhexidine) ו-70% אתנול.
   2. השתמש זוג מספריים כדי לוודא הרדמה עומק על ידי סחיטה בהונות של החיה ואימות האובדן של רפלקס הנסיגה פדלים (הבוהן צביטה) של בעל החיים בקלילות.
   3. אעשה חתך כ 3 מ מ האחורי לקו האוזן של החיה, עוצרות קו העין. מקום החתך חייבים להיות כ 1 ס מ אורך להיות מספיק גדולה כדי לקבל את השתל.
   4. לגרד בעדינות את הגולגולת עם המגרד עצם לשפר את הדבק של מלט הדבקות. האור הנערץ מתוך כוונה יצירת שריטות מיקרו.
   5. מקם בזהירות כירורגית ווים על העור רפוי כדי לשמור על שדה כירורגי פתוח וללא מכשולים כגון עור ופרווה.
   6. השתמש ספוגית כותנה סטרילי לייבוש הקרקפת של החיה.
   7. השתמש במיקרוסקופ ויבתר להמחיש העליון של הגולגולת של החיה.
   8. לצרף מחט המחזיק stereotaxic ואתר את bregma. מקם את המחט ישירות מעל ראשה נוגע מעט את bregma.
   9. אפס את כל נקודות הציון מעקב דיגיטלית ולאחר מכן הרם את המחט.
   10. לתקן את השתל tDCS על בעל stereotaxic. מקם את השתל מעל ראשה, להוריד אותו באיטיות על גבי האזור עניין בעזרת הקואורדינטות stereotaxic נכונה.
   11. שימוש במחט להפיץ טיפה 1 (כ 35 μL) של דבק סופר על הבסיס של השתל.
   12. לאט הניעו את המחזיק כלפי מטה עד שייגע הגולגולת. ודא כי הבסיס השתל הוא לגמרי במגע עם המשטח.
   13. הכינו את הבטון כירורגי בהתאם להוראות היצרן.
   14. לאחר מיקום מדויק, להחיל 3 דק, אפילו שכבת צמנט על פני הגולגולת ועל החלק התחתון של השתל. חלה ירידה לכל טיפה באמצעות מברשת של היישום. שכבות בטח יוצרים מבנה בצורת גבעה לקבלת תמיכה מבנית של השתל.
   15. השאר חריטה של השתל נקי של מלט כדי לאפשר חיבור חלקה בלא הפרעה.
   16. אפשר כל שכבה להתייבש במשך כ-4 דקות.
   17. כאשר יבש, הסר בזהירות את המחזיק עד שזה מנותק לחלוטין מן השתל. תמיד לנקוט בזהירות בעת טיפול השתל, מאז זה עשוי להיות בטעות מופק הגולגולת של החיה.
3. גימור ניתוח וטיפול לאחר ניתוח
   1. מימה העור של החיה באזור הניתוח באמצעות מקלון צמר גפן ספוג תמיסת מלח.
   2. . מעיל העור על הבסיס של השתל tDCS
   3. השתמש זוג מספריים כדי להפגיש את הרקמה ולסגור את החתך עם טיפה של דבק כירורגי רקמות לכל 0.2 ס מ של רקמות.
   4. לחדור לידוקאין 1-2% של החתך, שבבסיס הרקמות.
   5. מימה subcutaneously את העכבר עם 500 µL של תמיסת רינגר לקטט.
   6. הנח את העכבר לתוך כלוב נקי, שוכנו יחיד ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס).
   7. לשים קערת קטן עם כדורי מזון רטוב בכלוב לגישה נוחה לאוכל במשך השעות הבאות.
   8. הירשם במשקל לאחר ניתוח של החיה.
   9. לתת את ketoprofen בעלי חיים (5 מ"ג/ק"ג) subcutaneously אחרי הניתוח ועל הימים 2.
   10. נטר את ההתאוששות של החיה מקרוב במשך לפחות שבוע אחד. להעריך סימני מצוקה, כגון piloerection, חוסר טיפוח, גפיים מופחתת, הפצע מגרד דלקת של האתר כירורגית.

2. tDCS גירוי וההתקנה

1. tDCS ההתקנה (ראה איור 2)
   שימו לב. ודא כי ממריץ tDCS טעונה במלואה.
   1. לצרף את אנודת וכבל קטודית ממריץ tDCS ולהפוך אותם זמינים בקרבת האתר גירוי. לצרף האלקטרודה pin-סוג בעל stereotaxic.
   2. הגדר את הפלטפורמה תרמי 37 מעלות צלזיוס.
   3. הפעל את זרימה חמצן במערכת הרדמה אינהלציה כדי 1 ליטר/דקה.
   4. הנח את העכבר אל החדר אינדוקציה הרדמה.
   5. הפעל את מכשיר אידוי איזופלוריין ל-3%. לאפשר את החיה לעבור אפקטים איזופלוריין במשך 4 דקות.
   6. בעוד החיה בבית הבליעה אינדוקציה, השתמש מזרק סטרילי למילוי האלקטרודה הגוף עם תמיסת 0.9%.
   7. הסר את החיה מן החדר אינדוקציה ומקם את החזה שלה מעל האלקטרודה הגוף.
   8. בעדינות להחליק את מסיכת ההרדמה על האף של העכבר ולתקן את זה במקום. . תוריד את פלט איזופלוריין ל- 1.5%.
   9. למלא את השתל, האלקטרודה pin-סוג עם תמיסת מלח ולצרף בקפידה.
   10. התאם גירוי זמן ועוצמה הנוכחי.
   11. בדוק את איכות הקשר על ממריץ tDCS. קשר אופטימלית נוסע מ 7 עד 10 בסולם 1 עד 10.
2. גירוי
   1. התחל את הגירוי.
   2. לצפות את הנוכחי ramping 30 s הערך הנבחר, שמירה על עצמו יציב בפעם הוקמה, ואז, בסוף הפגישה ramping למטה שוב.
   3. הפעילו את כפתור דמה עבור בקרת עכברים.
   4. לצפות את הנוכחי ramping 30 s הערך הנבחר ולאחר מכן עד 1 למשך שארית תקופת גירוי עם רמפה סופית את הערך שנבחר בסופו של דבר עם רמפה רצופים למטה.
   5. לאחר הפעלת גירוי תושלם, בזהירות העברת החיה לכלוב ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) למשך 10 דקות.
      שימו לב. חיות התחילו להתעורר לאחר 3 דקות.
   6. . כבה את מערכת הרדמה אינהלציה.

תוצאות

פרוטוקול כירורגי הציגו יציבות שתל לטווח ארוך עבור חודש אחד לפחות, אין אותות דלקתיים באתר מגורה ולא כל השפעה רצויה אחרת. כל החיות שרדו ההפעלות הליך ו tDCS כירורגי (n = 8). בניסוי זה, שתלים tDCS היו מוצבים מעל cortices M1 ו- M2 (+1.0 מ מ קדמי-את ישבנה ואת 0.0 מ מ לרוחב כדי bregma). שבוע לאחר מכן, tDCS (n...

Discussion

בשנים האחרונות, טכניקות בגירוי יש כבר נכנס הקלינית כמו שגרה מבטיח לטפל מנוטלי הפרעות²³. כדי להפחית את האילוץ המוטלים על-ידי חוסר הידע על מנגנוני בגירוי, הצגנו כאן מודל העכבר tDCS נושאת אלקטרודה שיכולות היעד אזורים במוח. מאחר האלקטרודה מושתלת באופן כרוני, מודל זה בעל חיים מאפשר הח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Ultra-Fine 50U Syringe	BD	10033430026	For intraperitonially injection.
Shaver (Philips Multigroom)	Philips (Brazil)	QG3340/16	For surgical site trimming.
Surgical Equipment
Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	KOPF	940	For animal surgical restriction and positioning.
Model 922 Non-Rupture 60 Degree Tip Ear Bars	KOPF	922	For animal surgical restriction and positioning.
Cannula Holder	KOPF	1766-AP	For implant positioning.
Precision Stereo Zoom Binocular Microscope (III) on Boom Stand	WPI	PZMIII-BS	For bregma localization and implant positioning.
Temperature Control System Model	KOPF	TCAT-2LV	For animal thermal control.
Cold Light Source	WPI	WA-12633	For focal brightness
Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System with Scavenging	VetEquip	901820	For isoflurane delivery and safety.
VaporGuard Activated Charcoal Adsorption Filter	VetEquip	931401	Delivery system safety measures.
Model 923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder	KOPF	923-B	For animal restriction and O2 and isoflurane delivery.
Oxygen regulator, E-cylinder	VetEquip	901305	For O2 regulation and delivery.
Oxygen hose – green	VetEquip	931503	For O2 and isoflurane delivery.
Infrared Sterilizer 800 ºC	Marconi	MA1201	For instrument sterilization.
Surgical Instruments
Fine Scissors - ToughCut	Fine Science Tools	14058-11	For incision.
Surgical Hooks	INJEX	1636	In House Fabricated - Used to clear the surgical site from skin and fur.
Standard Tweezers or Forceps	-	-	For skin grasping.
Surgical Consumables
Vetbond	3M	SC-361931	For incision closing.
Cement and Catalyzer KIT (Duralay)	Reliance	2OZ	For implant fixation.
Sterile Cotton Swabs (Autoclaved)	JnJ	75U	For surgical site antisepsis.
24 Well Plate (Tissue Culture Plate)	SARSTEDT	831,836	For cement preparation.
Application Brush	parkell	S286	For cement mixing and application.
Pharmaceutics
Xylazin (ANASEDAN 2%)	Ceva Pharmaceutical (Brazil)	P10160	For anesthesia induction.
Ketamine (DOPALEN 10%)	Ceva Pharmaceutical (Brazil)	P30101	For anesthesia induction.
Isoflurane (100%)	Cristália (Brazil)	100ML	For anesthesia maintenance.
Lidocaine (XYLESTESIN 5%)	Cristal Pharma	-	For post-surgical care.
Ketoprofen (PROFENID 100 mg)	Sanofi Aventis	20ML	For post-surgical care.
Ringer's Lactate Solution	SANOBIOL LAB	7898153652145	For post-surgical care.
TobraDex (Dexamethasone 1 mg/g)	Alcon	631	For eye lubrification and protection.
Stimulation
Animal Transcranial Stimulator	Soterix Medical	2100	For current generation.
Pin-type electrode Holder (Cylindrical Holder Base)	Soterix Medical	2100	Electrode support (Implant).
Pin-type electrode (Ag/AgCl)	Soterix Medical	2100	For current delivery (electrode).
Pin-type electrode cap	Soterix Medical	2100	For implant protection.
Body Electrode (Ag/AgCl Coated)	Soterix Medical	2100	For current delivery (electrode).
Saline Solution (0.9%)	FarmaX	7896902206441	Conducting medium for current delivery.
Standard Tweezers or Forceps	-	-	For tDCS setup.
Real Time Polymerase Chain Reaction
BioRad CFX96 Real Time System	BioRad	C1000	For qPCR
SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix (5 X 1mL)	BioRad	1725271	For qPCR
Hard Shell PCR Plates PCT COM 50 p/ CFX96	BioRad	HSP9601	For qPCR
Microseal "B" seal pct c/ 100	BioRad	MSB1001	For qPCR