Stimolazione transcranica corrente continua (tDCS) in topi

Riepilogo

La stimolazione transcranica corrente continua (tDCS) è una tecnica terapeutica proposta per il trattamento di malattie psichiatriche. Un modello animale è essenziale per comprendere le specifiche alterazioni biologiche evocate da TDC. Questo protocollo descrive un modello di topo tDCS che utilizza un elettrodo cronicamente impiantato.

Abstract

La stimolazione transcranica corrente continua (tDCS) è una tecnica non invasiva neuromodulazione proposta come un trattamento alternativo o complementare per parecchie malattie neuropsichiatriche. Gli effetti biologici di tDCS completamente non sono capiti, che in parte si spiega a causa della difficoltà nell'ottenere il tessuto cerebrale umano. Questo protocollo descrive un modello di topo tDCS che utilizza un elettrodo cronicamente impiantato permettendo lo studio degli effetti biologici di tDCS duraturo. In questo modello sperimentale, tDCS cambia l'espressione genica corticale e offre un importante contributo alla comprensione delle motivazioni per il suo uso terapeutico.

Introduzione

La stimolazione transcranica corrente continua (tDCS) è una tecnica non invasiva, a basso costo, terapeutica, che si concentra sulla modulazione neuronale attraverso l'uso di correnti continue di bassa intensità¹. Ci sono attualmente due configurazioni (anodica e cathodal) per tDCS. Mentre la stimolazione anodica esercita un campo elettrico corrente troppo debole per attivare i potenziali di azione, elettrofisiologia studi hanno dimostrato che questo metodo produce i cambiamenti nella plasticità sinaptica². Ad esempio, prova indica che quel tDCS induce effetti di potenziamento (LTP) a lungo termine come aumentato picco di ampiezza dei potenziali postsinaptici eccitatori^3,4 e la modulazione dell'eccitabilità corticale⁵.

Al contrario, cathodal stimolazione induce l'inibizione, conseguente membrana hyperpolarization⁶. Un'ipotesi per questo meccanismo si basa sui risultati fisiologici dove tDCS è descritto per modulare la frequenza del potenziale d'azione e durata in un neurone corpo³. In particolare, questo effetto non evocano direttamente i potenziali di azione, anche se può spostare la soglia di depolarizzazione e facilitare o ostacolare il firing neuronale⁷. Queste contrastanti effetti sono state dimostrate in precedenza. Per esempio, la stimolazione anodica e cathodal prodotto effetti opposti nelle risposte condizionate registrate tramite attività elettromiografica in conigli⁸. Tuttavia, gli studi hanno anche dimostrato che prolungata stimolazione anodica sessioni potrebbero diminuire eccitabilità, mentre l'aumento cathodal correnti può portare all'eccitabilità, presentando self-contrastanti effetti³.

Stimoli sia anodica e cathodal aggregano l'uso di coppie di elettrodi. Ad esempio, nella stimolazione anodica, "attivo" o "anodo" elettrodo viene posizionato sopra la regione del cervello per essere modulata considerando che l'elettrodo "riferimento" o "catodo" è situato in una regione dove l'effetto della corrente viene considerato insignificante⁹. Nella cathodal stimolazione, disposizione dell'elettrodo è invertito. L'intensità di stimolazione per tDCS efficace dipende l'intensità di corrente e dimensioni degli elettrodi, che interessano l'elettrico campo diversamente¹⁰. Negli studi pubblicati, l'intensità di corrente medio è tra 0,10 a 2.0 mA e 0,1 mA a 0,8 mA per umani e topi, rispettivamente^6,11. Anche se la dimensione degli elettrodi di 35cm² viene in genere utilizzata in esseri umani, non c'è alcuna comprensione corretta per quanto riguarda le dimensioni degli elettrodi per roditori e un'indagine più approfondita è necessaria⁶.

tDCS è stato proposto negli studi clinici con il tentativo di offrire un trattamento alternativo o complementare per parecchi disordini neurologici e neuropsichiatrici¹¹ come epilessia¹², disturbo bipolare¹³, colpo⁵ , major depressione¹⁴, morbo di Alzheimer¹⁵,¹⁶ di sclerosi multipla e morbo di Parkinson¹⁷. Nonostante la crescente interesse in tDCS e suo uso in studi clinici, cellular dettagliate e alterazioni molecolari evocate nel tessuto cerebrale, breve ed effetti di lunga durata, nonché i risultati comportamentali, sono ancora per essere più profondamente studiato^{18, 19}. Poiché un approccio umano diretto a studiare accuratamente tDCS non è praticabile, l'uso di un modello animale di tDCS può offrire preziose intuizioni gli eventi cellulari e molecolari alla base i meccanismi terapeutici di tDCS a causa della accessibilità per la tessuto cerebrale dell'animale.

Prova disponibile è limitata per quanto riguarda modelli tDCS nei topi. La maggior parte dei modelli segnalati utilizzato diversi layout impiantare, dimensioni degli elettrodi e materiali. Per esempio, Winkler et al. (2017) impiantato la testa dell'elettrodo (Ag/AgCl, 4 mm di diametro) riempito con soluzione fisiologica e fissato al cranio con viti e cemento acrilico²⁰. Diverso dal nostro approccio, loro l'elettrodo è stato impiantato (platino, 20 x 1,5 mm). Nasehi et al. (2017) ha utilizzato una procedura molto simile alla nostra, anche se l'elettrodo toracico è stata effettuata in una spugna imbevuta di soluzione fisiologica (carbonio riempito, 9,5 cm²)²¹. Un altro studio impiantati entrambi gli elettrodi nella testa dell'animale, che è stato raggiunto utilizzando piastre fisse e che coprono la testa dell'animale con un conduttore di idrogel²². Qui, descriviamo un modello murino di tDCS che utilizza un elettrodo cronicamente impiantato attraverso semplice installazione tDCS e procedure chirurgica (Figura 1).

Protocollo

Individualmente-ospitato maschio adulto (8-12 settimane) topi C57BL/6 sono stati utilizzati in questo esperimento. Gli animali hanno ricevuto cure adeguate prima, durante e dopo le procedure sperimentali con cibo e acqua ad libitum. Tutte le procedure sono state approvate dal comitato di etica animale dall'Università federale di Minas Gerais (protocollo numero 59/2014).

1. posizionamento elettrodo

1. Sedativo e fissazione dell'animale sul apparato stereotassica
   1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici necessari.
      Nota. Gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati per 3 minuti a 440 ° C. Tamponi di cotone sono stati sterilizzati nell'autoclave a 20 psi (libbre per pollice quadrato) a 121 ° C per 20 min.
   2. Regolare il controller piattaforma termale a 37 ° C.
   3. Pesare l'animale e calcolare la dose appropriata per induzione di anestesia. Utilizzare una miscela di ketamina e xilazina ad una dose di 100 mg/kg ketamina e 8 mg/kg xylazina, dato intraperitonealmente (ferri, 31 G). L'animale dovrebbe addormentarsi entro 2 o 3 min.
   4. Utilizzare un rasoio elettrico o un rasoio per la barba giù il sito chirurgico.
   5. Piastra riscaldante posto l'animale sul apparato stereotassica sopra il pre-riscaldato.
   6. Tenere la testa dell'animale e inserire le barre di orecchio punta in ciascuna delle orecchie dell'animale per risolvere il problema alla piattaforma stereotassica.
   7. Verificare che non c'è nessun spostamento laterale testa e poco movimento verticale dopo spostando lentamente la testa dell'animale di posizionamento.
   8. Delicatamente, far scorrere la maschera anestesia sul naso del mouse e fissarlo stringendo la vite.
   9. Impostare il isoflurane 1% con 1,0 L/min di O₂.
   10. Applicare unguento oculare agli occhi dell'animale per evitare l'essiccazione della cornea durante l'intervento chirurgico.
2. Associare l'impianto per la testa dell'animale
   1. Usare i tamponi di cotone per preparare il sito chirurgico con tre scrub alternati di povidone-iodio (o 2% clorexidina) ed etanolo al 70%.
   2. Utilizzare un paio di pinzette per verificare la profondità di anestesia leggera spremitura dei piedi dell'animale e verificando la perdita del riflesso di ritiro pedale (pizzico di punta) dell'animale.
   3. Fare un'incisione di circa 3 mm posteriore alla linea dell'orecchio dell'animale e arrestarsi la linea degli occhi. Nel sito di incisione deve essere circa 1 cm di lunghezza di essere abbastanza grande per ricevere l'impianto.
   4. Raschiare delicatamente il cranio con un raschietto di osso per migliorare la colla e l'adesione del cemento. Fare questa luce imparzialmente nell'intento di creare micro graffi.
   5. Posizionare con attenzione chirurgiche ganci per la pelle flaccida di mantenere un campo chirurgico aperto e senza ostacoli, quali pelle e pelliccia.
   6. Usare un tampone di cotone sterile per asciugare la cute dell'animale.
   7. Utilizzare un microscopio per dissezione per visualizzare la parte superiore del cranio dell'animale.
   8. Inserire un ago al titolare stereotassica e individuare il bregma. Posizionare l'ago direttamente sopra la testa dell'animale toccando leggermente il bregma.
   9. Azzerare tutte le coordinate sul tracer digitale e quindi sollevare l'ago.
   10. Difficoltà l'impianto tDCS sul supporto stereotassica. Posizionare l'impianto sopra la testa dell'animale e abbassarlo lentamente sulla regione di interesse utilizzando le coordinate stereotassiche appropriate.
   11. Utilizzare un ago per diffondere 1 goccia (circa 35 µ l) di super colla sulla base dell'impianto.
   12. Lentamente spostare il supporto verso il basso fino a toccare il cranio. Assicurarsi che la base dell'impianto è completamente a contatto con la superficie.
   13. Preparare il cemento chirurgico secondo le istruzioni del produttore.
   14. Dopo il posizionamento preciso, applicare 3 sottile, strato uniforme di cemento attraverso il cranio e sulla parte inferiore dell'impianto. Applicare la goccia a goccia utilizzando un pennello di applicazione. Strati devono formare una struttura a forma di collina per ulteriore sostegno strutturale dell'impianto.
   15. Lasciare la filettatura dell'impianto pulito di cemento per consentire una connessione liscia, senza ostacoli.
   16. Consentire ogni strato si asciughi per circa 4 minuti.
   17. Quando asciutto, rimuovere con cautela il titolare fino a quando non è completamente indipendente dall'impianto. Sempre usare estrema cautela quando si gestisce l'impianto, poiché esso può essere accidentalmente estratti dal cranio dell'animale.
3. Finitura di chirurgia e cura post-chirurgica
   1. Idratare la pelle dell'animale nel sito di incisione con un batuffolo di cotone imbevuta di soluzione fisiologica.
   2. Rivestire la pelle sopra la base dell'impianto tDCS.
   3. Utilizzare un paio di pinzette per riunire il tessuto e chiudere l'incisione con una goccia di colla chirurgica del tessuto per 0,2 cm di tessuto.
   4. 1-2% lidocaina nel sito di incisione di infiltrarsi e tessuti di fondo.
   5. Idratare il mouse con 500 µ l di soluzione di Ringer lattato per via sottocutanea.
   6. Posizionare il mouse in una gabbia di pulito, singolo-ospitato pre-riscaldata (37 ° C).
   7. Mettere un piccolo piatto con palline di cibo umido nella gabbia per un facile accesso al cibo nelle ore seguenti.
   8. Registro di peso post-chirurgica dell'animale.
   9. Dare il ketoprofene animale (5 mg/kg) per via sottocutanea dopo l'intervento chirurgico e nei prossimi 2 giorni.
   10. Monitorare il recupero dell'animale strettamente per almeno 1 settimana. Valutare qualsiasi segno di sofferenza, quali piloerezione, la mancanza di grooming, ridotta locomozione, ferita graffiare e infiammazione del sito chirurgico.

2. tDCS Setup e stimolazione

1. tDCS installazione (Vedi Figura 2)
   Nota. Assicurarsi che lo stimolatore tDCS è completamente carica.
   1. Collegare i cavi di anodo e catodo allo stimolatore tDCS e renderli disponibili nei pressi del sito di stimolazione. Collegare l'elettrodo di perni al titolare stereotassica.
   2. Impostare la piattaforma di termale a 37 ° C.
   3. Accendere il misuratore di portata di ossigeno sull'apparato di anestesia per inalazione a 1 L/min.
   4. Posizionare il mouse nella camera di induzione di anestesia.
   5. Accendere il vaporizzatore di isoflurane al 3%. Permettere all'animale di subire gli effetti di isoflurane per 4 min.
   6. Mentre l'animale è nella camera di induzione, è possibile utilizzare una siringa sterile per riempire l'elettrodo corpo con soluzione fisiologica 0,9%.
   7. Rimuovere l'animale dalla camera di induzione e posiziona il suo petto sul corpo dell'elettrodo.
   8. Delicatamente, far scorrere la maschera anestesia sul naso del mouse e fissarlo. Abbassare l'uscita di isoflurane all'1,5%.
   9. Riempire l'impianto e l'elettrodo di perni con soluzione fisiologica e con attenzione li attaccano.
   10. Regolare il tempo di stimolazione e intensità di corrente.
   11. Verificare la qualità del Contatta sullo stimolatore tDCS. Contatto ottimale va da 7 a 10 su una scala da 1 a 10.
2. Stimolazione
   1. Iniziare la stimolazione.
   2. Osservare l'attuale dilagare per 30 s per il valore selezionato e mantenersi costante per il tempo stabilito, poi, alla fine della sessione in rampa giù nuovamente.
   3. Attivare il pulsante di sham per topi di controllo.
   4. Osservare l'attuale dilagare per 30 s il valore selezionato e poi giù per 1 per il resto del periodo di stimolazione con una rampa finale al valore selezionato alla fine con una rampa consecutiva giù.
   5. Una volta completata la seduta di stimolazione, trasferire con cautela l'animale in una gabbia di pre-riscaldata (37 ° C) per 10 min.
      Nota. Gli animali iniziano a risvegliarsi dopo 3 min.
   6. Spegnere il sistema di anestesia per inalazione.

Risultati

Il protocollo chirurgico ha presentato la stabilità a lungo termine dell'impianto per almeno un mese, con nessun segnali infiammatori nel sito stimolato né qualsiasi altro effetto indesiderato. Tutti gli animali sono sopravvissuti le sessioni chirurgiche di procedura e tDCS (n = 8). In questo esperimento, tDCS gli impianti sono stati posizionati sopra le cortecce M1 e M2 (+1,0 mm anteriore-posteriore e laterale di 0.0 mm al bregma). Una settimana più tardi, tDCS (n = 3-4) e sham (n = 3...

Discussione

Negli ultimi anni, tecniche di neurostimolazione sono stati introdotti pratica clinica come una procedura di promessa per il trattamento di disordini neuropsichiatrici²³. Per ridurre il vincolo imposto dalla mancanza di conoscenza dei meccanismi della neurostimolazione, abbiamo presentato qui un modello di topo tDCS portando un elettrodo che può avere come bersaglio regioni del cervello. Poiché l'elettrodo è cronicamente impiantabile, questo modello animale consente l'indagine degli effetti bio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Ultra-Fine 50U Syringe	BD	10033430026	For intraperitonially injection.
Shaver (Philips Multigroom)	Philips (Brazil)	QG3340/16	For surgical site trimming.
Surgical Equipment
Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	KOPF	940	For animal surgical restriction and positioning.
Model 922 Non-Rupture 60 Degree Tip Ear Bars	KOPF	922	For animal surgical restriction and positioning.
Cannula Holder	KOPF	1766-AP	For implant positioning.
Precision Stereo Zoom Binocular Microscope (III) on Boom Stand	WPI	PZMIII-BS	For bregma localization and implant positioning.
Temperature Control System Model	KOPF	TCAT-2LV	For animal thermal control.
Cold Light Source	WPI	WA-12633	For focal brightness
Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System with Scavenging	VetEquip	901820	For isoflurane delivery and safety.
VaporGuard Activated Charcoal Adsorption Filter	VetEquip	931401	Delivery system safety measures.
Model 923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder	KOPF	923-B	For animal restriction and O2 and isoflurane delivery.
Oxygen regulator, E-cylinder	VetEquip	901305	For O2 regulation and delivery.
Oxygen hose – green	VetEquip	931503	For O2 and isoflurane delivery.
Infrared Sterilizer 800 ºC	Marconi	MA1201	For instrument sterilization.
Surgical Instruments
Fine Scissors - ToughCut	Fine Science Tools	14058-11	For incision.
Surgical Hooks	INJEX	1636	In House Fabricated - Used to clear the surgical site from skin and fur.
Standard Tweezers or Forceps	-	-	For skin grasping.
Surgical Consumables
Vetbond	3M	SC-361931	For incision closing.
Cement and Catalyzer KIT (Duralay)	Reliance	2OZ	For implant fixation.
Sterile Cotton Swabs (Autoclaved)	JnJ	75U	For surgical site antisepsis.
24 Well Plate (Tissue Culture Plate)	SARSTEDT	831,836	For cement preparation.
Application Brush	parkell	S286	For cement mixing and application.
Pharmaceutics
Xylazin (ANASEDAN 2%)	Ceva Pharmaceutical (Brazil)	P10160	For anesthesia induction.
Ketamine (DOPALEN 10%)	Ceva Pharmaceutical (Brazil)	P30101	For anesthesia induction.
Isoflurane (100%)	Cristália (Brazil)	100ML	For anesthesia maintenance.
Lidocaine (XYLESTESIN 5%)	Cristal Pharma	-	For post-surgical care.
Ketoprofen (PROFENID 100 mg)	Sanofi Aventis	20ML	For post-surgical care.
Ringer's Lactate Solution	SANOBIOL LAB	7898153652145	For post-surgical care.
TobraDex (Dexamethasone 1 mg/g)	Alcon	631	For eye lubrification and protection.
Stimulation
Animal Transcranial Stimulator	Soterix Medical	2100	For current generation.
Pin-type electrode Holder (Cylindrical Holder Base)	Soterix Medical	2100	Electrode support (Implant).
Pin-type electrode (Ag/AgCl)	Soterix Medical	2100	For current delivery (electrode).
Pin-type electrode cap	Soterix Medical	2100	For implant protection.
Body Electrode (Ag/AgCl Coated)	Soterix Medical	2100	For current delivery (electrode).
Saline Solution (0.9%)	FarmaX	7896902206441	Conducting medium for current delivery.
Standard Tweezers or Forceps	-	-	For tDCS setup.
Real Time Polymerase Chain Reaction
BioRad CFX96 Real Time System	BioRad	C1000	For qPCR
SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix (5 X 1mL)	BioRad	1725271	For qPCR
Hard Shell PCR Plates PCT COM 50 p/ CFX96	BioRad	HSP9601	For qPCR
Microseal "B" seal pct c/ 100	BioRad	MSB1001	For qPCR