マウスにおける経頭蓋直流電流刺激 (tDCS)

要約

経頭蓋直流電流刺激 (tDCS) は、精神疾患を治療するために提案された治療法です。動物モデルは、tDCS による特定の生物学的変化を理解するために不可欠です。このプロトコルでは、慢性埋込電極を使用する Tdc マウス モデルについて説明します。

要約

経頭蓋直流電流刺激 (tDCS) は、いくつかの脳神経疾患のための代替または補完的な治療として提案した非侵襲的なニューロモデュレーション手法です。Tdc の生物学的効果完全に理解されない、人間の脳組織を取得の難しさのために一部説明されています。このプロトコルでは、Tdc の長期的な生物学的効果の検討できるように慢性埋込電極を使用する Tdc マウス モデルについて説明します。この実験モデルで tDCS は皮質の遺伝子発現が変化し、その治療上の使用のための理論的根拠の理解への顕著な貢献を提供しています。

概要

経頭蓋直流電流刺激 (tDCS) は、低強度の連続電流¹を使用して神経の変調に焦点を当てて非侵襲、低コスト、治療テクニックです。現在、Tdc の 2 つの設定 (anodal、,) があります。Anodal 刺激を及ぼす現在電場電位をトリガーには弱すぎる中、電気生理学研究はこのメソッドがシナプス可塑性²の変化を生成することを示しています。たとえば、その tDCS は、興奮性シナプス後電位の^3,4の振幅増大と皮質興奮性⁵の変調などの長期増強 (LTP) 効果を誘導する証拠を示しています。

逆に、, 刺激は抑制、膜の過分極⁶の結果を誘導します。このメカニズムの仮説は、活動電位の頻度と神経体³の期間を調節する Tdc はで記述されている生理学的な所見に基づいています。特に、この効果呼び起こすはない直接、活動電位が脱分極閾値をシフトし容易またはニューロン⁷を妨げることができます。効果を対照的なこれらは既に実証されています。たとえば、anodal とし, 刺激はウサギ⁸の筋電図活動を介して登録条件反応の反対の効果を作り出した。しかし、研究は興奮性、自己対照的な効果³を提示する可能性があります, 電流を増加している間 anodal 序でセッション興奮性が低下することをまた示されています。

Anodal とし, 刺激電極対の使用を集計します。たとえば、anodal 刺激、「アクティブ」または「陽極」の電極は「リファレンス」または「カソード」電極電流影響取るに足りない⁹するとされる地域であるのに対し、変調されると脳の領域上に配置。, 刺激電極配置が反転されます。現在の強度に依存する効果的な tDCS の刺激強度と電気に影響を与える電極寸法フィールド¹⁰の異なる。平均電流は 0.10 から 2.0 の間、最も公表された研究は、mA、0.1 0.8 mA 人間、マウス、それぞれ^6,11mA。35 cm²の電極のサイズは、通常人間で使用されますが、齧歯動物の電極寸法に関する適切な理解がないより徹底的な調査が必要な⁶。

tDCS はてんかん¹², 双極性障害¹³、ストローク^{5 などのいくつかの神経疾患、精神神経疾患11の代替または補完的な治療を提供しての試みに関する臨床研究で提案されています。}、うつ病¹⁴、¹⁵アルツハイマー病、多発性硬化症¹⁶パーキンソン病¹⁷の主要な。TDCS の関心とその行動の結果と同様、臨床試験、詳細な携帯と脳組織、短い分子誘発変異と長期的な効果、成長している、にもかかわらず、まだより深く調査^18,19. tDCS をじっくり研究して直接人間のアプローチは実行可能なため、tDCS 動物モデルの使用 Tdc へのアクセシビリティのための治療上のメカニズムを基になる細胞と分子のイベントへの貴重な洞察力を提供するかもしれない、動物の脳組織。

入手可能な証拠は、マウスの tDCS モデルに関する制限されています。報告されたモデルのほとんどは、材料、電極寸法、打ち込むことのさまざまなレイアウトを使用しました。たとえば、ウィンクラーら(2017) 生理食塩水で満たされた頭部電極 (銀/塩化銀、直径 4 mm) を注入し、アクリル セメントやネジ²⁰で頭蓋骨に固定します。我々 のアプローチとは異なり、その胸部電極は、注入 (プラチナ、20 × 1.5 mm) だった。Nasehiら(2017) 非常に、よく似た手順を使用は、胸部電極を生理食塩水に浸したスポンジ (カーボン充填、9.5 cm²)²¹から作られたが。別の研究は、固定プレートを使用し、ハイドロゲル指揮者²²動物の頭をカバーによって達成された動物の頭の中に両方の電極を植え付け。ここでは、簡単な外科プロシージャおよび Tdc セットアップ (図 1) 慢性埋込電極を使用する Tdc マウス モデルをについて説明します。

プロトコル

それぞれ収容された男性大人 (8-12 週) c57bl/6 マウスは、この実験で使用されました。動物は食べ物と水で実験手順の前後中に適切なケアを受信したアドリブ。すべてのプロシージャは、連邦大学のミナスジェ ライス州から動物の倫理委員会で承認された(プロトコル番号 59/2014).

1. 電極配置

1. 鎮静と脳定位固定装置に動物を注視して
   1. すべての必要な手術器具を滅菌します。
      注意してください。440 ° C で 3 分間加熱滅菌処理は手術器具綿棒は、オートクレーブで 121 ° C、20 分で 20 の psi (1 平方インチあたりポンド) だった。
   2. 37 ° c. に温度プラットフォーム コント ローラーを調整します。
   3. 動物の重量を量るし、麻酔導入の適切な投与量を計算します。100 mg/kg 8 mg/kg とケタミン キシラジン、腹腔内に与えられた (31 G 針サイズ) の用量でケタミン ・ キシラジンの混合物を使用します。動物を 2 〜 3 分で眠りに落ちる必要があります。
   4. 手術部位を剃る電気シェーバーやかみそりを使用します。
   5. 場所を予め温めておいた脳定位固定装置に動物は加熱プレートです。
   6. 動物の頭を押し、各脳定位固定装置のプラットフォームにそれを修正する動物の耳のヒント耳バーに挿入します。
   7. ゆっくりと動物の頭位置をシフトすることによってない外側頭シフトと後少し上下運動があることを確認します。
   8. マウスの鼻をゆっくり麻酔マスクとネジを締めて場所でそれを修正します。
   9. O₂の 1.0 L/min と 1% に、イソフルランを設定します。
   10. 手術中に角膜の乾燥を防ぐために動物の目に眼軟膏を適用します。
2. 動物の頭にインプラントをアタッチします。
   1. ポビドン ヨード (または 2% クロルヘキシジン) の 3 つの交互になるスクラブと手術部位を準備する綿の綿棒を使用し、70% エタノール。
   2. ピンセットのペアを使用して、軽く動物のペダル撤退 (つま先ピンチ) 反射の消失を確認する動物の足の指を圧迫し麻酔の深さを確認します。
   3. 動物の耳ラインの後方約 3 mm 切開を行うし、目の行で停止します。切開部位にインプラントを受け取るのに十分な大きさで長さ 1 cm 程度が必要です。
   4. 軽く接着剤を改善し、遵守をセメント骨スクレーパーと頭蓋をこすり。独力のマイクロ傷を作成するつもりでこの光を行います。
   5. オープン手術フィールドを維持し、皮膚、毛皮などの障害物の無料たるんだ皮膚を手術のフックを慎重に移動します。
   6. 滅菌綿棒を使用して、動物の頭皮を乾燥します。
   7. 解剖顕微鏡を使用して、動物の頭蓋骨の上部を視覚化します。
   8. 針を付ける脳定位固定ホルダー、前を探します。少し前に触れる動物の頭の上に直接針を配置します。
   9. デジタル トレースのすべての座標をゼロにし、針を上げます。
   10. 脳定位固定装置のホルダーに Tdc インプラントを修正します。動物の頭の上、インプラントの位置し、適切な定位座標を使用して興味の地域の上にゆっくりと下ろします。
   11. インプラントのベースにスーパー接着剤を 1 滴 (約 35 μ L) を広げるため針を使用します。
   12. それが頭蓋骨に触れるまでホルダーに下方へゆっくりと移動します。インプラント基本が表面に接触して完全にあることを確認します。
   13. 製造元の指示に従って手術セメントを準備します。
   14. 精密位置決め後適用 3 薄い、頭蓋とインプラントの下の部分にセメントも層。1 アプリケーション ブラシを使用してドロップのドロップを適用します。レイヤーは、インプラントのさらに構造サポートにヒル状の構造を形成しなければなりません。
   15. 滑らかな、遮るもののない接続を許可するようにセメントのきれいなインプラントのねじを残します。
   16. 各レイヤーに約 4 分間乾燥を許可します。
   17. インプラントから完全に切り離されてまで乾いたら、慎重にホルダーを取り外します。常に動物の頭蓋骨から誤って抽出可能性がありますので、インプラントを処理するときは、細心の注意を使用します。
3. 仕上げの手術と手術後のケア
   1. 生理食塩水に浸した綿棒で切開部位に動物の皮を水和物します。
   2. Tdc インプラントの土台を越えて皮のコート。
   3. ピンセットのペアを使用して、組織を一緒に持参し、組織の 0.2 cm あたり手術組織接着剤のドロップで切開を閉じる。
   4. 切開部位の 1-2% リドカインに潜入し、組織の基礎となります。
   5. 皮下の乳酸リンゲル液 500 μ L でマウスをメタンハイド レートします。
   6. 予め温めておいた (37 ° C) きれいで、シングル収容ケージにマウスを配置します。
   7. 次の時間で簡単にアクセスできるケージに食品にウェット フード ペレット、小さな皿を入れてください。
   8. 動物の外科手術後の重量を登録します。
   9. 次の 2 日間、手術後皮下動物ケトプロフェン (5 mg/kg) を与えます。
   10. 動物の回復は、少なくとも 1 週間に密接に監視します。立毛、グルーミング、減らされた歩行、傷傷、手術部位の炎症の欠如などの苦痛の兆候を評価します。

2. tDCS セットアップおよび刺激

1. tDCS セットアップ (図 2参照)
   注意してください。TDCS 刺激は完全に充電されていることを確認します。
   1. TDCS 刺激にアノードとカソード ケーブルを取り付けます、刺激部位の近くに利用できるようにします。ピン型電極を脳定位固定装置のホルダーに取り付けます。
   2. 熱のプラットフォームを 37 ° C に設定します。
   3. 1 L/分吸入麻酔装置の酸素流量計を入れます。
   4. 麻酔誘導チャンバーにマウスを配置します。
   5. 3% にイソフルラン気化器をオンにします。4 分のイソフルレンの影響を受ける動物を許可します。
   6. 動物は、誘導商工会議所では、0.9% 食塩水で体電極を埋めるため滅菌注射器を使用します。
   7. 誘導室から動物を外し、体電極上にその胸を置きます。
   8. マウスの鼻をゆっくり麻酔マスクと場所でそれを修正します。1.5% にイソフルラン出力を下げます。
   9. インプラントとピン型電極を生理食塩水で埋める、慎重に取り付けます。
   10. 刺激時間と電流の強さを調整します。
   11. TDCS 刺激の接触の品質を確認します。最適な接触は 1-10 のスケールで 7 から 10 に行きます。
2. 刺激
   1. 刺激を開始します。
   2. 30 のために現在のランプを確認 s 選択した値とそれ自体の維持を着実に確立された時間のため、再びランプの下のセッションの終わりに。
   3. コントロール マウスの偽ボタンをアクティブにします。
   4. 30 のために現在のランプを確認 s 選択した値に放置上下連続ランプダウンと最後に選択した値を最終的な傾斜路の刺激周期の残りのための 1。
   5. 刺激のセッションが完了したら、慎重に 10 分のために予め温めておいた (37 ° C) ケージに動物を転送します。
      注意してください。動物は、3 分後に目を覚ますを開始します。
   6. 吸入麻酔システムをオフにします。

結果

外科プロトコルは、誘導サイトでない炎症性の信号やその他の望ましくない効果を少なくとも 1 ヶ月、インプラントの長期安定性を提示しました。すべての動物が生き残った外科プロシージャと Tdc のセッション (n = 8)。この実験では、Tdc インプラントされた M1 と M2 野 (+1.0 mm 前後と前 0.0 mm 外側) 上に置かれました。一週間後、tDCS (n = 3-4) と偽 (n = 3) マウスは 0.35 で ...

ディスカッション

サスカチュワン神経テクニックでは、近年、精神神経疾患²³の治療に有望なプロシージャとして臨床実習を入力されています。神経のメカニズムの知識の欠乏によって課される制約を減らすためには、我々 は脳の領域を対象とする電極を運ぶ tDCS マウス モデルをここで紹介。電極は慢性埋込型なのでこの動物モデルは複雑な刺激パターンで (少なくとも 1 ヶ月) の tDCS によ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Ultra-Fine 50U Syringe	BD	10033430026	For intraperitonially injection.
Shaver (Philips Multigroom)	Philips (Brazil)	QG3340/16	For surgical site trimming.
Surgical Equipment
Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	KOPF	940	For animal surgical restriction and positioning.
Model 922 Non-Rupture 60 Degree Tip Ear Bars	KOPF	922	For animal surgical restriction and positioning.
Cannula Holder	KOPF	1766-AP	For implant positioning.
Precision Stereo Zoom Binocular Microscope (III) on Boom Stand	WPI	PZMIII-BS	For bregma localization and implant positioning.
Temperature Control System Model	KOPF	TCAT-2LV	For animal thermal control.
Cold Light Source	WPI	WA-12633	For focal brightness
Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System with Scavenging	VetEquip	901820	For isoflurane delivery and safety.
VaporGuard Activated Charcoal Adsorption Filter	VetEquip	931401	Delivery system safety measures.
Model 923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder	KOPF	923-B	For animal restriction and O2 and isoflurane delivery.
Oxygen regulator, E-cylinder	VetEquip	901305	For O2 regulation and delivery.
Oxygen hose – green	VetEquip	931503	For O2 and isoflurane delivery.
Infrared Sterilizer 800 ºC	Marconi	MA1201	For instrument sterilization.
Surgical Instruments
Fine Scissors - ToughCut	Fine Science Tools	14058-11	For incision.
Surgical Hooks	INJEX	1636	In House Fabricated - Used to clear the surgical site from skin and fur.
Standard Tweezers or Forceps	-	-	For skin grasping.
Surgical Consumables
Vetbond	3M	SC-361931	For incision closing.
Cement and Catalyzer KIT (Duralay)	Reliance	2OZ	For implant fixation.
Sterile Cotton Swabs (Autoclaved)	JnJ	75U	For surgical site antisepsis.
24 Well Plate (Tissue Culture Plate)	SARSTEDT	831,836	For cement preparation.
Application Brush	parkell	S286	For cement mixing and application.
Pharmaceutics
Xylazin (ANASEDAN 2%)	Ceva Pharmaceutical (Brazil)	P10160	For anesthesia induction.
Ketamine (DOPALEN 10%)	Ceva Pharmaceutical (Brazil)	P30101	For anesthesia induction.
Isoflurane (100%)	Cristália (Brazil)	100ML	For anesthesia maintenance.
Lidocaine (XYLESTESIN 5%)	Cristal Pharma	-	For post-surgical care.
Ketoprofen (PROFENID 100 mg)	Sanofi Aventis	20ML	For post-surgical care.
Ringer's Lactate Solution	SANOBIOL LAB	7898153652145	For post-surgical care.
TobraDex (Dexamethasone 1 mg/g)	Alcon	631	For eye lubrification and protection.
Stimulation
Animal Transcranial Stimulator	Soterix Medical	2100	For current generation.
Pin-type electrode Holder (Cylindrical Holder Base)	Soterix Medical	2100	Electrode support (Implant).
Pin-type electrode (Ag/AgCl)	Soterix Medical	2100	For current delivery (electrode).
Pin-type electrode cap	Soterix Medical	2100	For implant protection.
Body Electrode (Ag/AgCl Coated)	Soterix Medical	2100	For current delivery (electrode).
Saline Solution (0.9%)	FarmaX	7896902206441	Conducting medium for current delivery.
Standard Tweezers or Forceps	-	-	For tDCS setup.
Real Time Polymerase Chain Reaction
BioRad CFX96 Real Time System	BioRad	C1000	For qPCR
SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix (5 X 1mL)	BioRad	1725271	For qPCR
Hard Shell PCR Plates PCT COM 50 p/ CFX96	BioRad	HSP9601	For qPCR
Microseal "B" seal pct c/ 100	BioRad	MSB1001	For qPCR