حقن Intrathecal المباشر للفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلف في الفئران الكبار

Dongxiao Li; Yundu Li; Yunyun Tian; Zuoshang Xu; Yansu Guo

doi:10.3791/58565

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Method Article

حقن Intrathecal المباشر للفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلف في الفئران الكبار

DOI:

10.3791/58565

⸱

February 15th, 2019

Dongxiao Li*¹, Yundu Li*², Yunyun Tian¹, Zuoshang Xu³, Yansu Guo¹^,⁴

¹Department of Neurology, Second Hospital of Hebei Medical University, ²No.2 Middle School of Shijiazhuang, ³Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, ⁴Key Laboratory of Hebei Neurology

* These authors contributed equally

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Summary

وهنا يقدم تقنية حقن intrathecal مباشرة باستخدام 1% ليدوكائين هيدروكلوريد في حل فيروسية لضمان تسليم الفيروسات الكفاءة المرتبطة بالغدد للحيوانات الصغيرة، وإنشاء نظام لتسجيل النقاط للتنبؤ بكفاءة توصيل في وسط الجهاز العصبي وفقا لدرجة ضعف عابرة الناجمة عن ليدوكائين.

Abstract

حقن Intrathecal (IT) من الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) لفت اهتمام كبير في العلاج الجيني CNS حكم السلامة، نونينفاسيفينيس، وكفاءة توصيل ممتازة في الجهاز العصبي المركزي. أظهرت الدراسات السابقة فاعلية علاجية للعلاج الجيني تسليم إف في اضطرابات الأعصاب به الإدارة. ومع ذلك، سجلت معدلات عالية من الفشل لا يمكن التنبؤ بها بسبب التقادم التقني لإدارة تكنولوجيا المعلومات في الحيوانات الصغيرة. هنا، قمنا بإنشاء نظام لتسجيل النقاط للإشارة إلى مدى نجاح البزل القطني في الحيوانات الصغيرة عن طريق إضافة 1% ليدوكائين هيدروكلوريد في حقن المحلول. نعرض كذلك أنه يمكن التنبؤ بمدى ضعف عابرة بعد حقن كفاءة توصيل إف. وهكذا، يمكن استخدام هذا الأسلوب أنه حقن لتحسين التجارب العلاجية في نماذج الماوس من أمراض الجهاز العصبي المركزي التي تصيب مناطق واسعة من الجهاز العصبي المركزي.

Introduction

إف يمكن التوسط في التعبير الجيني طويلة الأجل وواسعة النطاق في توصيل الجهاز العصبي المركزي مع عدد قليل من الآثار الجانبية، ولذلك أصبحت واحدة من السيارات الأكثر تبشيرا بالنجاح للعلاج الجيني لعلاج أمراض الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك التصلب العضلي الجانبي (المرض)، هنتنغتون المرض (HD) ومرض الزهايمر (AD)، وأمراض التخزين الليزوزومية (LSD)، المرض Gaucher (المدير العام)، والخلايا العصبية سيرويد ليبوفوسسينوسيس (نكل)¹. حاليا، أكثر من 100 إف اللقاح تم عزلها من البشر والحيوانات. ومن بين هذه استخدمت على الأقل 12 في السريرية والتجارب السريرية، بما في ذلك الأكثر شيوعاً استخدام ناقلات الجينات مثل AAV1، 2، 4، 5، 6، 8، 9، rAAVrh.8، و rAAVrh.10¹^،²^،³^،⁴^، ⁵^،⁶.

أمراض الجهاز العصبي المركزي مختلفة تتطلب استراتيجيات تسليم إف مختلفة نظراً لمختلف المناطق المتضررة في الجهاز العصبي المركزي وأنواع الخلايا. مناطق الجهاز العصبي المركزي وخلية الأنواع التي يمكن ترانسدوسي إف يختلف تبعاً للنمط المصلي المسيطر فضلا عن طريقة التسليم. على سبيل المثال، قد تبين rAAVrh10 ترانسدوسي الغالب astrocytes عندما ألقي بالحقن الوريدية الجهازية (الرابع)، في حين أنها ترانسدوسيد كل من الخلايا العصبية وإطلاق عندما ألقي بحقن intrathecal⁴^،⁷. بالإضافة إلى ذلك، أدى حقن حمة توصيل المحلية للمناطق المحيطة بموقع الحقن، بينما أدى حقن في السائل الدماغي النخاعي (CSF) عن طريق داخل البطيني أو حقن intrathecal توصيل الجهاز العصبي المركزي على نطاق واسع⁸. كما أظهرت الدراسات العلاجية فاعلية العلاج الجيني تسليم إف في اضطرابات الأعصاب بأنه الإدارة⁹^،^،من¹⁰¹¹. في الأمراض التي تؤثر على مجالات واسعة للجهاز العصبي المركزي مثل المرض، أظهر حقن intrathecal في إطار الخدمات القطرية لتغطية معظم المناطق التي تعاني من المرض بجرعة أقل، مقارنة⁴^،أسلوب تسليم الجهازية¹⁰. كما أظهرت الدراسات الأخيرة أن البزل القطني يمكن استخدامها لحقن إف في نماذج الماوس للمرض، الذي يتجنب الإصابات المحتملة المرتبطة بالصفيحة و intrathecal قسطرة⁴.

كان أول من استخدم البزل القطني المباشرة التجريبية لتسليم الوكلاء، لا سيما من المسكنات، إلى الحبل الشوكي للتسكين والتخدير في عام 1885¹²^،¹³. في هذا التقرير، نحن توضيح الثقب القطني هو حقن الأسلوب في الفئران الكبار مع المعونة من 1% ليدوكائين هيدروكلوريد، مخدر المستمدة من أميد محلية، في الحل الحقن لتقييم ورصد جودة الحقن. الحقن ناجحة اتسمت بالشلل عابر المستحثة ليدوكائين، بينما فشل الحقن لم تظهر هذا السلوك. نحن تصنيف مستوى ضعف عابرة كواحدة من خمس درجات للمساعدة في التنبؤ بكفاءة الحقن. وأخيراً، نحن إظهار أنه قد يمكن التنبؤ بمستوى توصيل rAAVrh10 بدرجة الشلل. ولذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب تسليم إف إينتراثيكال لتعزيز إيصال الجين إف بوساطة للعلاج التجريبي من أمراض الجهاز العصبي المركزي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

كانت ولدت الفئران ففب/نيو جيرسي في منشأة الحيوان من "المختبرات الرئيسية للأعصاب خبي". جميع الماوس التجارب كانت وافقت "المستشفى من خبي الطبية جامعة أخلاقيات اللجنة الثانية" ونفذت وفقا للوائح إدارة الحيوانات المختبرية أصدرت وزارة العلوم والتكنولوجيا في الجمهورية الشعبية الصين.

1-إعداد 20% ليدوكائين هيدروكلوريد الأسهم الحل

وزن 2 غ ليدوكائين هيدروكلوريد. إضافة 5 – 6 مل من الماء المعقم ودوامه بلطف. زيادة مستوى الصوت إلى ما مجموعة 10 مل بالماء المعقم.
1.2 تصفية الحل الأسهم من خلال مرشحات 0.2 ميكرون. قاسمة الحل الأسهم، 1 مل كل 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة، وختم ذلك بفيلم ختم. مخزن في 4 درجات مئوية.

2-إف Intrathecal التسليم المباشر في الفئران مستيقظا

مسح مساحة العمل باستخدام شاش معقم مع الإيثانول 70% وإعداد اللوازم المطلوبة كما ورد في الجدول 1.
إعداد 100 ميليلتر AAVrh.10/1% ليدوكائين هيدروكلوريد المعقدة عن طريق إضافة ميليلتر 95 حل الأسهم rAAVrh10 (5 × 10¹² الجينوم نسخ/mL) في أنبوب ميكروسينتريفوجي ميليلتر 200 عقيمة، وإضافة 5 ميليلتر من 20% ليدوكائين هيدروكلوريد الأسهم الحل. مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً. ثم تخزين الفيروسات الحل على الجليد (4 درجات مئوية).
ملاحظة: سيتم استخدام ميليلتر 8 كل الماوس⁴ .
إعداد المحاقن مع الحل إف لحقن
1. تجميع من 25 ميليلتر هاملتون المحاقن بإبرة ز 27 ومحاذاة طرف مشطوف الإبرة مع حجم الحجمي في المحاقن.
2. رسم ميليلتر 8 4 × 10¹⁰ الجينوم نسخاً من الفيروسات الحل في المحاقن بلطف. تأكد من إزالة فقاعات الهواء.
إعداد الماوس
ملاحظة: الذكور أو الإناث من الفئران ففب/نيو جيرسي (30 – 70 يوما) واستخدمت في هذه الدراسة. تم تشغيل تكنولوجيا الحقن في غطاء محرك السيارة.
1. تعقيم منطقة العمل في غطاء مع الإيثانول 70%. وضع الماوس مستيقظا (ذكرا كان أو أنثى، 30 – 70 يوما القديمة، 13 – 20 غ الوزن) في بيدبيسي في موقف معرضة في غطاء محرك السيارة. تغطية الجزء العلوي من الجسم مع شاش معقم لتهدئة الماوس وتجنب الملدوغ.
2. إصلاح الحيوان التي تجتاح على نحو ملائم وراسخا على بحزام الحوض مع إبهام على إصبع السبابة الأوسط والجانب واحد على الجانب الآخر. الحفاظ على الجلد بين الثنائية الحزام الحوضي مشدود مع الإبهام والسبابة. اضغط برفق على الجزء العلوي من الجسم للحيوان مع النخيل.
3. يحلق الفراء على ظهرها بين الحزام الحوضي الثنائية، ثم تعقيم سطح الجلد مع إيثانول فرك و 70% على أساس يوديد.
حقن Intrathecal¹²
1. يشعر المسافة الفقرية على طول الخط الأوسط بين الحزام الحوضي الثنائية مع الإبهام أو السبابة في اليد الأخرى واضغط المسافة بادئة مع ظفر للإشارة إلى المسافة L5-L6 الفقرية (تحديد موقع الحقن).
2. تدوير قاعدة الذيل قليلاً لطف للإشارة إلى خط الوسط للعمود الفقري. ضبط الإبرة المجسم مشطوف الحواف نحو رأس الحيوان قبل الحقن (المذكور في الخطوة 2.3.1).
3. تأكد من أن الحيوانات ثابتة بثبات ومحاذاة الإبرة على طول خط الوسط للعمود الفقري.
4. أدخل الإبرة برفق وعمودياً (أو إمالة قليلاً من 70-80 درجة مئوية) في تقاطع المسافة البادئة وإبقاء المحاقن في طائرة السهمي مركزية. تقليل الزاوية إلى حوالي 30 درجة ببطء عند اتصاله العظام، ثم تنزلق الإبرة إلى الفضاء الفقرية.
  ملاحظة: نفض الغبار ذيل مفاجئ واضحا علامة النجاح في دخول الفضاء إينترادورال. بمجرد دخول الإبرة مساحة الفقرية، سوف يشعر نصيحة إبرة فرضت بشدة. ز 27 الإبرة المستخدمة في هذه الدراسة هي مناسبة لإيصال تكنولوجيا المعلومات في الفئران ولكن لا الفئران.
5. حقن الحل مكافحة ناقلات (المذكورة في الخطوة 2، 2). بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت وحقن ميليلتر 8 الحل ناقل بسرعة 1 ميليلتر/4 س الاحتفاظ إبرة تقريبا 1 دقيقة بعد الانتهاء من تسليم. سحب الإبرة مع تناوب لطيف لتجنب تسرب.
6. نقاط ضعف عابرة للفأرة أطرافه فورا بعد الولادة لتقييم نوعية الحقن⁴.
  ملاحظة: المعيار كما يلي⁴. نقاط 0: لا ضعف؛ نقاط 1: قاصر ضعف أطرافه هند دون شذوذ مشيه؛ نقاط 2: معتدلة ضعف أطرافه هند مع شذوذ مشيه واضحة؛ نقاط 3: استكمال شلل أطرافه هند؛ 4 نقاط: الانتهاء من شلل أطرافه هند، وضيق في التنفس، وضعف معتدل من أطرافه الصدارة؛ ونقاط 5: إتمام الشلل في جميع أطرافه الأربعة، ويتضح ضيق في التنفس.
7. حرك الماوس مرة أخرى إلى القفص للشفاء من الشلل.
تنظيف
1. مسح المحاقن مع 1 مل من الماء المعقم. فرز اللوازم المختبرية وجمع جميع المواد غير المتاح للتعقيم يعقم. تنظيف مقاعد البدلاء مع الإيثانول 70%.

3-الأنسجة التحضير لتلطيخ المناعي

جمع الأنسجة
1. تخدير الفئران في حقن بعد 21 يوما مع 3% كلورال هيدرات (0.1 مل/10 غرام) عميق بالحقن داخل.
2. نتخلل ترانسكارديالي مع 20 مل من المثلج 0.01 متر PBS (كلوريد الصوديوم 147 مم؛ نة₂بو₄ 1.9 مم؛ ك₂هبو₄ 8.1 ملم، ودرجة الحموضة 7.4) أولاً، ثم 4% المثلج بارافورمالدهيد (في برنامج تلفزيوني 0.01 M) مع مضخة (10 مل/دقيقة لمدة 1 دقيقة، ثم 5 مل/دقيقة بدقيقة 9).
  تنبيه: بارافورمالدهيد السرطنة، والسمية. التعامل معها إلا في غطاء الدخان أثناء ارتداء القفازات.
تشريح المخ والحبل الشوكي
1. إصلاح على أطرافه ورأسه كل حيوان في موضع عرضه على غطاء مربع رغوة مع إبر المحاقن، ثم تجريد وإزالة الجلد من الرأس إلى عجز مع المقص.
2. مقطع الجمجمة بين العينين، وقطع جنبا إلى جنب مع الطريق الأوسط من الجمجمة وخط أفقي عند المخيخ، ثم فتح الجمجمة لكل جانب.
3. رفع عظم قذالي مع ملاقط وفتح القناة الفقرية ثنائيا مع مقص العيون. قطع الأضلاع على الجانبين وإزالة النصف العلوي من فقرات بعناية.
4. رفع الدماغ مع منحنى ملاقط وقطع أعصاب قاعدة الجمجمة، ثم تشريح كامل الدماغ والحبل الشوكي بعناية. بعد إصلاح الأنسجة في بارافورمالدهيد 4% عن 24 ساعة.
إعداد شرائح الأنسجة
1. كريوبروتيكت المخ والحبل الشوكي العنقي والقطني في محلول السكروز 30% بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تضمين الأنسجة في قطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) مركب وتجميد سريع مع النتروجين السائل.
2. قطع الأنسجة في 25 ميكرومتر كريوستات استخدام وتخزين المقاطع المجمدة في برنامج تلفزيوني 0.01 متر في 4 درجات مئوية للاستخدام.

4-إيمونوهيستوتشيميستري

بريتريت أبواب التعويم الحر في % 1 ح₂س₂ لمدة 10 دقائق، ثم غسل في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة إينكوباتي في حل حظر المحتوية على مصل 5% والمنظفات غير الأيونية 0.3% في برنامج تلفزيوني عن ح 1.
احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الأولية المقابلة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. أغسل المقاطع في ببست (0.2% 20 توين في برنامج تلفزيوني) لمدة 30 دقيقة (3 مرات لكل 10 دقائق).
احتضان الشرائح مع جسم البيوتين-الثانوية المقابلة في درجة حرارة الغرفة ل 1 حاء – المياه والصرف الصحي في ببست مدة 30 دقيقة (3 مرات لكل 10 دقائق).
احتضان الفروع مع تقارب البيوتين البيروكسيديز معقدة لمدة 40 دقيقة، ووصمة عار مع وكيل أتشروموجينيك. تحميل المقاطع على الشرائح وجاف بشكل صحيح.
نقع الشرائح في الإيثانول اللامائى لمدة 5 دقائق وزيلين نفط لمدة 10 دقائق، ثم ختم الشرائح مع وسيلة متزايدة. وأخيراً، صورة الشرائح مع مجهر مزودة جهاز اقتران (اتفاقية مكافحة التصحر) في 100 x و 200 x و 400 x تكبير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وأظهرت الفئران درجات مختلفة من الضعف عابر الحق بعد ذلك حقن إف الحل في 1% ليدوكائين هيدروكلوريد نظراً لنوعية مختلفة من حقن intrathecal. وفقا لشبه كمي نظام التهديف الصف 5 وقد أنشأنا، اختبرنا أنماط توصيل إف في الفئران بدرجات مختلفة من الضعف الناجم عن ليدوكائين أطرافهم (نقاط 0، ن = 2؛...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

من الناحية الفنية، هناك العديد من الخطوات الحاسمة خلال تكنولوجيا الحقن في الفئران مستيقظا. أولاً، سليم لفتة وشركة مراقبة الفئران طوال العملية برمتها شرط مسبق للنجاح في إيصال. ثانيا، النقطة الأكثر صعوبة هو شعور المسافة الفقرية بطرف الإبرة، أنه من الضروري عدم إدراج عميقا جداً دون مقاومة أ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل بمنحه مقدمة من إدارة مقاطعة خبي من الموارد البشرية والضمان الاجتماعي (CY201605)، ومنحة من "مؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة خبي" (H2017206101)، ونحن ممتنون جداً للدكتور قاو شوانغبينغ، الذين قدموا إف هذه الدراسة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FVB/NJ mice	Charles River Laboratories China
Lidocaine hydrochloride monohydrate	HEOWNS	73-78-9
AAV	Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School
25 µL Hamilton syringe/27-30 G needle	GASTIGHT	1702
O.C.T compond	SAKURA	4583
H₂O₂	SHUI HUAN PAI	170401
Goat serum	Solarbio	S9070
Triton X-100	LIFE SCIENCES	T8200
Rabbit anti-GFP	Life tech	G10362	1:333 dilution
The second antibody (goat-anti rabbit)	Jackson Immuno Research	111-005-144	1:1,000 dilution
VECTASTAIN ABC REAGENT	Vector Lab	PK-6100
ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit	Vector Lab	SK-4105
Mounting medium for fluorescence with DAPI	Vectorshield	H-1200
NaCl	Yong Da Chemical
NaH₂PO₄·2H₂O	Yong Da Chemical
Na₂HPO₄·12H₂O	Yong Da Chemical
Paraformaldehyde	Yong Da Chemical	307699
Adhesion Microscope Slides	CITOGLAS	17083	25 mm x 75 mm
SUPER-SLIP MICRO-GLAS	Electro Microscopy Siences	72236-60	24 mm x 60 mm
15 mL Centrifuge tube	CORNING	430790
96 well cell culture cluster	Coster	3599
24 well cell culture cluster	Coster	3524
70% Ethanol	WEN ZHI
Gauze	Wei AN	05171112	8 cm x 10 cm x 12 cm
1 mL syringe	Hong Da
Microtubes	Plasmed
Micropipet	eppendorf
Peppet tips	Rainin
Centirifuge	eppendorf	5427R
Regerator	Haier	BCD-539WT
Filter	MILLEX GP	R4PA42342
Pump	LongerPump	BT-100-2J/YZ1515X
Microscope	Olympus	BX53
Freezing-microtome	Leica	CM1520

References

Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76(2014).
Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
Yang, B., et al. Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10. Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).
Guo, Y., et al. A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).
Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).
Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36(2015).
Federic, T., et al. Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs. Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).
Ayers, J. I., et al. Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice. Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).
Li, D., et al. Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS. Neuroscience. 365, 192-205 (2017).
Borel, F., et al. Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).
Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).
Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).
Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).
Wang, Y., et al. scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway. Brain Research. 1648, Pt A 1-10 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated:

حقن Intrathecal المباشر للفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلف في الفئران الكبار

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

النتائج

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Explore More Articles