Directa de la inyección intratecal de virus Adeno-asociado recombinantes en ratones adultos

Resumen

Aquí presentamos una técnica de inyección directa intratecal con clorhidrato de lidocaína 1% en una solución viral para asegurar la entrega eficiente de virus adeno-asociado a pequeños animales y establecer un sistema de puntuación para predecir la eficiencia de la transducción de señales en la central sistema nervioso según el grado de debilidad transitoria inducida por la lidocaína.

Resumen

La inyección intratecal (IT) de virus adeno-asociado (AAV) ha atraído un considerable interés en la terapia génica del CNS en virtud de su eficacia de transducción excelente, seguridad y noninvasiveness en el SNC. Estudios anteriores han demostrado la potencia terapéutica de terapia génica AAV-entregado en trastornos neurodegenerativos por su administración. Sin embargo, se han reportado altas tasas de fracaso impredecible debido a la limitación técnica de administración de TI en pequeños animales. Aquí, hemos establecido un sistema de puntuación para indicar el grado de éxito de la punción lumbar en pequeños animales mediante la adición de clorhidrato de lidocaína 1% en la solución de la inyección. Se muestra más que el grado de debilidad transitoria después de la inyección puede predecir la eficiencia de la transducción de AAV. Por lo tanto, puede utilizarse este método de inyección de TI para optimizar los ensayos terapéuticos en modelos murinos de enfermedades del SNC que afligen a grandes regiones del SNC.

Introducción

AAV puede mediar la expresión génica a largo plazo y generalizados en la transducción del CNS con pocos efectos secundarios y por lo tanto, se ha convertido en uno de los vehículos más prometedoras para la terapia génica para el tratamiento de enfermedades del SNC incluyendo la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), Huntington enfermedad (HD), enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedades de depósito lisosomal (LSD), la enfermedad de Gaucher (GD) y neuronal ceroid lipofuscinosis ceroid (NCL)¹. En la actualidad, más de 100 serotipos AAV se han aislado de los seres humanos y animales. Entre ellos, al menos 12 han sido utilizados en preclínicos y ensayos clínicos, incluyendo el más comúnmente utilizan vectores del gene como AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 y rAAVrh.10^{1,2,3,4, 5,6}.

Enfermedades del SNC diferentes requieren diferentes estrategias de entrega AAV debido a las diversas regiones afectadas de CNS y tipos de la célula. Las regiones de CNS y célula tipos que AAV puede transducir varía según el serotipo así como método de entrega. Por ejemplo, rAAVrh10 ha demostrado que transduce predominantemente astrocitos al entregado por la inyección intravenosa sistémica (IV), mientras que transduced las neuronas y glia entrega intratecal inyectable^4,7. Además, inyección de parénquima dio lugar en la transducción de local a los alrededores del sitio de inyección, mientras que la inyección en el líquido cerebroespinal (CSF) a través de intraventricular o intratecal inyectable resultó en la transducción generalizada de CNS⁸ . Estudios también han demostrado potencia terapéutica de terapia génica AAV-entregado en trastornos neurodegenerativos por él administración^9,10,11. En enfermedades que afectan a amplias zonas del SNC como ALS, inyección intratecal en el LCR se ha demostrado para cubrir la mayoría de las áreas que es afligida por la enfermedad con una dosis más baja, en comparación con un método de entrega sistémica^4,10. Estudios recientes también han demostrado que la punción lumbar se puede utilizar para inyectar AAV en modelos de ratón de ALS, que evita posibles lesiones asociadas con cateterización de laminectomía e intratecal⁴.

Una punción lumbar directa experimental primero fue utilizada para entregar a agentes, especialmente los anestésicos, a la médula espinal para analgesia y anestesia en 1885^12,13. En este informe, nos ilustran el método de inyección es en ratones adultos con la ayuda del 1% clorhidrato de lidocaína, un anestésico local derivado de amida, en la solución de la inyección para evaluar y controlar la calidad de la inyección la punción lumbar. Inyecciones de éxito fueron marcadas por parálisis transitoria inducida por la lidocaína, mientras que inyecciones no mostró este comportamiento. Clasificamos el nivel de debilidad transitoria como uno de cinco grados para ayudar a predecir la eficacia de la inyección. Finalmente, nos muestran que el nivel de la transducción de rAAVrh10 puede predecirse por el grado de parálisis. Por lo tanto, este método de la entrega intratecal AAV puede utilizarse para mejorar el AAV-mediated gene-entrega para el tratamiento de enfermedades del SNC.

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Protocolo

Ratones FVB/NJ fueron criados en las instalaciones de animales de laboratorio clave de Hebei Neurología. Todos los experimentos de ratón fueron aprobados por el segundo Hospital de Hebei médica Universidad Comité de ética y llevado a cabo conforme a las normas de la gerencia del animal de laboratorio promulgada por el Ministerio de ciencia y tecnología de la República Popular de China.

1. preparación de solución madre del clorhidrato de lidocaína 20%

1. Pesar 2 g de clorhidrato de lidocaína. Añadir 5-6 mL de agua estéril y agitar suavemente. Aumentar el volumen a un total de 10 mL con agua estéril.
2. 1.2 filtro de la solución a través de filtros de 0.2 micrones. Alícuota de la solución, 1 mL por microcentrífuga de 1.5 mL del tubo y sellar con una película. Almacenar a 4 ° C.

2. dirigir la entrega intratecal AAV en despiertas ratones

1. Limpie el área de trabajo utilizando una gasa estéril con etanol al 70% y prepare los suministros necesarios como se menciona en la tabla 1.
2. Preparar 100 μl de clorhidrato de lidocaína AAVrh.10/1% complejo agregando 95 μl de la solución madre de rAAVrh10 (5 x 10¹² genoma copias/mL) en un tubo de microcentrífuga estéril de 200 μl y añadir 5 μl de solución stock de clorhidrato de lidocaína 20%. Mezclar por pipeteo arriba y abajo. A continuación, guarde la solución antivirus en hielo (4 ° C).
   Nota: se utilizarán 8 μl por ratón⁴ .
3. Preparar la jeringa con la solución de AAV para inyección
   1. Montar un 25 μl de Hamilton de la jeringuilla con una aguja de 27 G y alinear la punta biselada de la aguja con la escala volumétrica en la jeringa.
   2. Dibujar 8 μl con 4 x 10¹⁰ copias de genoma de la solución de virus dentro de la jeringa suavemente. Asegúrese de eliminar burbujas de aire.
4. Preparando el ratón
   Nota: hombre o mujeres ratones FVB/NJ (30-70 días de edad) fueron utilizados en este estudio. Inyección de ti fue operada en la campana.
   1. Esterilizar el área de trabajo en una campana con etanol al 70%. Ponga el ratón despierto (masculinos o femeninos, 30-70 días de edad, 13-20 g de peso) en un bedpiece en una posición prona en la campana. Cubrir la parte superior del cuerpo con una gasa estéril para calmar el ratón y evitar ser mordido.
   2. Fijar el animal sujetando apropiadamente y firmemente en su faja pélvica con un pulgar en un lado y el dedo índice, medio dedo en el otro lado. Mantenga la piel entre fajas de pélvica bilaterales tensos con el dedo pulgar y el índice. Sostenga suavemente en la parte superior del cuerpo del animal con la palma.
   3. Afeitar el pelo en la espalda entre los cinturones pélvico bilaterales, entonces esterilizar la superficie de la piel con un yoduro scrub y el 70% etanol.
5. Intratecal de inyección¹²
   1. Sentir el espacio intervertebral a lo largo de la línea media entre los cinturones pélvico bilaterales con un dedo pulgar o el dedo índice de la otra mano y presione una mella con la uña del dedo para indicar el espacio intervertebral de L5-L6 (localizar el sitio de inyección).
   2. Gire la base de la cola un poco y suavemente para indicar la línea media de la columna vertebral. Ajustar el bisel de la aguja hacia la cabeza del animal antes de la inyección (mencionada en el paso 2.3.1).
   3. Asegúrese de que los animales están fijados firmemente y alinean la aguja a lo largo de la línea media de la columna vertebral.
   4. Inserte la aguja suavemente y vertical (o ligeramente la inclinación 70 – 80°) en la intersección de la indentación y mantenga la jeringa en un plano sagital central. Reducir el ángulo de aproximadamente 30° lentamente cuando se conecta el hueso, luego deslizar la aguja en el espacio intervertebral.
      Nota: Una película de evidente cola repentino es una señal de entrada exitosa en el espacio intradural. Una vez que la aguja entra en el espacio intervertebral, punta de la aguja se siente firmemente sujeta. La aguja de 27 G, utilizada en este estudio es adecuada para la entrega es en ratones pero no ratas.
   5. Inyecte la solución de vector (mencionada en el paso 2.2). Iniciar el temporizador e inyecte 8 μl de la solución del vector a una velocidad de 1 μl/4 s. retener la aguja aproximadamente 1 min después de acabar entrega. Retire la aguja con rotación suave para evitar fugas.
   6. Anotar la debilidad transitoria del ratón miembros inmediatamente después del parto para evaluar la calidad de la inyección⁴.
      Nota: El estándar es el siguiente⁴. Puntuación 0: ninguna debilidad; Puntuación 1: menor debilidad de los miembros posteriores sin anormalidad de la marcha; puntuación 2: moderada debilidad de las extremidades traseras con anormalidad obvia marcha; puntuación 3: completa parálisis de las extremidades posteriores; puntaje 4: completa parálisis de las extremidades posteriores, dificultad para respirar y debilidad moderada de las extremidades anteriores; y la puntuación 5: completa parálisis de las cuatro extremidades y evidente falta de aliento.
   7. Mueva el ratón hacia atrás a la jaula para la recuperación de la parálisis.
6. Limpiar
   1. Enjuague la jeringa con 1 mL de agua estéril. Ordenar suministros de laboratorio y recoger todos los materiales no desechables para la esterilización en autoclave. Limpie el Banco con etanol al 70%.

3. tejido preparación para la coloración de Immunohistochemical

1. Colección de tejido
   1. Anestesiar ratones después de la inyección 21 días con hidrato de cloral 3% (0,1 mL/10 g) profundamente por inyección intraperitoneal.
   2. Perfusión transcardially con 20 mL de PBS de 0,01 M helada (NaCl 147 mM; NaH₂PO₄ 1,9 mM; K₂HPO₄ 8,1 mM, pH 7,4) en primer lugar, luego helada paraformaldehído al 4% (en PBS de 0.01 M) con la bomba (10 mL/min durante 1 minuto, luego 5 mL/min por 9 min).
      PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es cancerígeno y tóxico. Manejar sólo en la campana usando guantes.
2. Disección de la médula espinal y el cerebro
   1. Fijar las extremidades y cabeza de cada animal en una posición prona en una caja de la espuma cubierta con agujas de jeringa, luego tira y quitar la piel de la cabeza al sacro con tijeras.
   2. Clip del cráneo entre los ojos, corte al lado de la ruta media del cráneo y la línea horizontal sobre el cerebelo, y abrir el cráneo a cada lado.
   3. Levante el hueso occipital con las pinzas y abrir el canal espinal bilateral con tijeras oftálmicas. Corte las costillas en ambos lados y retire la mitad superior de las vértebras con cuidado.
   4. Levante el cerebro con pinzas curvas y cortar los nervios de la base del cráneo, luego disecar cuidadosamente todo el cerebro y médula espinal. -Fijar los tejidos en paraformaldehído al 4% durante 24 h.
3. Preparación de cortes de tejido
   1. Cryoprotect el cerebro y la médula espinal cervical y lumbar en solución de sacarosa al 30% durante la noche a 4 ° C. Incrustar el tejido en la temperatura de corte óptimo (OCT) compuesto y congelar con nitrógeno líquido.
   2. Cortar el tejido en 25 μm con un criostato y guarde las secciones congeladas en PBS de 0.01 M a 4 ° C para su uso.

4. inmunohistoquímica

1. Trate previamente las secciones flotan libremente en el 1% H₂O₂ durante 10 minutos, luego lavar en PBS durante 10 minutos incubar en una solución de bloqueo que contiene 5% de suero y detergente no iónico de 0.3% en PBS durante 1 hora.
2. Incubar las rebanadas con anticuerpos primarios correspondientes durante la noche a 4 ° C. Lávese las secciones en SAFT (0.2% Tween 20 en PBS) durante 30 minutos (3 veces por 10 minutos cada uno).
3. Incubar las rebanadas con el anticuerpo secundario biotina correspondiente a temperatura ambiente durante 1 h. lavado en SAFT durante 30 minutos (3 veces por 10 minutos cada uno).
4. Incubar las secciones con peroxidasa de afinidad biotina complejo durante 40 min y mancha con agente de achromogenic. Monte las secciones en diapositivas y secar correctamente.
5. Sumerja los portaobjetos en etanol anhidro por 5 min y xileno durante 10 min, luego sellar las diapositivas con un medio de montaje. Finalmente, imágenes de las diapositivas con un microscopio equipado con un dispositivo de carga acoplada (CCD) en 100 x, 200 x y 400 aumentos de x.

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Resultados

Los ratones mostraron diferentes grados de debilidad transitoria justo después de que inyección de solución AAV en clorhidrato de lidocaína 1% debido a varios calidad de inyección intratecal. Según el sistema de puntuación grado 5 semi cuantitativo hemos establecido, hemos probado los patrones de transducción de AAV en ratones con diferentes grados de debilidad de la extremidad inducida por lidocaína (puntuación de 0, n = 2; puntuación 1, n = 1, puntuación 4, n = 4; puntuació...

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Discusión

Técnicamente, hay varios pasos críticos durante la inyección de IT en ratones despiertos. En primer lugar, adecuado gesto y firma el control de los ratones a lo largo de toda la operación es un requisito previo para la entrega exitosa. En segundo lugar, el punto más difícil es sentir el espacio intervertebral con la punta de la aguja, ya que es necesario no introducir demasiado profundamente sin resistencia o introduzca por la fuerza bajo fuerte resistencia en el caso de herir a los animales o doblar la punta de la...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
FVB/NJ mice	Charles River Laboratories China
Lidocaine hydrochloride monohydrate	HEOWNS	73-78-9
AAV	Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School
25 µL  Hamilton syringe/27-30 G needle	GASTIGHT	1702
O.C.T compond	SAKURA	4583
H 2O 2	SHUI HUAN PAI	170401
Goat serum	Solarbio	S9070
Triton X-100	LIFE SCIENCES	T8200
Rabbit anti-GFP	Life tech	G10362	1:333 dilution
The second antibody (goat-anti rabbit)	Jackson Immuno Research	111-005-144	1:1,000 dilution
VECTASTAIN ABC REAGENT	Vector Lab	PK-6100
ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit	Vector Lab	SK-4105
Mounting medium for fluorescence with DAPI	Vectorshield	H-1200
NaCl	Yong Da Chemical
NaH2PO4·2H2O	Yong Da Chemical
Na2HPO4·12H2O	Yong Da Chemical
Paraformaldehyde	Yong Da Chemical	307699
Adhesion Microscope Slides	CITOGLAS	17083	25 mm x 75 mm
SUPER-SLIP MICRO-GLAS	Electro Microscopy Siences	72236-60	24 mm x 60 mm
15 mL Centrifuge tube	CORNING	430790
96 well cell culture cluster	Coster	3599
24 well cell culture cluster	Coster	3524
70% Ethanol	WEN ZHI
Gauze	Wei AN	05171112	8 cm x 10 cm x 12 cm
1 mL syringe	Hong Da
Microtubes	Plasmed
Micropipet	eppendorf
Peppet tips	Rainin
Centirifuge	eppendorf	5427R
Regerator	Haier	BCD-539WT
Filter	MILLEX GP	R4PA42342
Pump	LongerPump	BT-100-2J/YZ1515X
Microscope	Olympus	BX53
Freezing-microtome	Leica	CM1520