JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada %1 lidokain hidroklorür viral bir çözümde küçük hayvanlar için verimli adeno ilişkili virüs teslim edilmesini sağlamak ve iletim verimliliği merkezi tahmin etmek için bir skorlama sistemi kurmak için bir doğrudan intratekal enjeksiyon tekniği mevcut sinir sistemi geçici zayıflık lidokain tarafından indüklenen derecesine göre.

Özet

İntratekal (BT) enjeksiyon adeno ilişkili virüs (AAV) içinde CNS CNS gen terapisi Emanet, noninvasiveness ve mükemmel iletim etkinliği sayesinde önemli ilgi çekmiş olmalı. Önceki çalışmalarda AAV teslim gen terapisi nörodejeneratif hastalıklarda tedavi potens tarafından yönetim gösterdi. Ancak, öngörülemeyen hatası BT yönetim küçük hayvanlarda teknik sınırlandırılması nedeniyle yüksek oranlarda bildirilmiştir. Burada, %1 lidokain hidroklorür enjeksiyonu çözüm içine ekleyerek lumbar ponksiyon küçük hayvanlarda başarı kapsamını belirtmek için bir skorlama sistemi kurduk. Biz daha fazla geçici zayıflık enjeksiyon takip ölçüde AAV iletim verimliliği tahmin edebilirsiniz göstereceğim. Böylece, BT ekleme Buyöntem fare modelleri MSS geniş bölgelerinde eziyet CNS hastalıkları tedavi edici çalışmalarda en iyi duruma getirmek için kullanılabilir.

Giriş

AAV CNS iletim birkaç yan etkisi ile uzun vadeli ve yaygın gen ifadesinde aracılık ve bu nedenle amyotrofik lateral skleroz (ALS), Huntington'ın da dahil olmak üzere CNS hastalıkları tedavi etmek gen tedavisi için en umut verici araçlar haline gelmiştir hastalığı (HD), Alzheimer hastalığı (Ah), lizozomal hastalıklar (LSD), Gaucher hastalığı (GD) ve nöronal ceroid lipofuscinosis (NCL)1. Halen, 100'den fazla AAV serotipleri insan ve hayvan izole edilmiştir. Bunlar arasında en az 12 içinde Preklinik kullanılmıştır ve en çok da dahil olmak üzere klinik çalışmalarda kullanılan gen vektörel çizimler gibi AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 ve rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.

Farklı CNS hastalıkları nedeniyle çeşitli etkilenen CNS bölgeler ve hücre tipleri farklı AAV teslim stratejileri gerektirir. CNS bölgeler ve hücre AAV transduce türleri değişir bağlı olarak serotip yanı sıra teslimat yöntemi. Örneğin, rAAVrh10 nöronlar ve ne zaman intratekal enjeksiyon4,7tarafından teslim glia transduced ise ağırlıklı olarak sistemik damar içi enjeksiyon (IV), tarafından teslim astrocytes transduce gösterilmiştir. İntraventriküler aracılığıyla beyin-omurilik sıvısı (BOS) içine enjeksiyon veya intratekal enjeksiyon yaygın CNS iletim8 sonuçlandı, ancak buna ek olarak, parankimi enjeksiyon enjeksiyon yeri çevresinde için yerel iletim sonuçlandı . Çalışmalar de AAV teslim gen tedavisi nörodejeneratif hastalıklarda tedavi edici etki gücü tarafından Yönetim9,10,11göstermiştir. CNS ALS gibi geniş alanlarda etkileyen hastalıklarda intratekal enjeksiyon bos içine bir sistemik teslim Yöntem4,10' a kıyasla daha düşük bir dozda hastalıkla tarafından tutulmuş çoğu alanları kapsayacak şekilde gösterilmiştir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda da bu lomber ponksiyon laminektomi ve intratekal kateterizasyon4ile ilişkili olası yaralanmaları önler ALS için fare modellerinde AAV enjekte için kullanılan göstermiştir.

Deneysel doğrudan lumbar ponksiyon ilk ajanlar, özellikle anestezi, spinal kord analjezi ve anestezi 188512,13için teslim etmek için kullanılmıştır. Bu raporda, lomber ponksiyon BT enjeksiyon yöntemi %1 lidokain hidroklorür, bir yerel Amid kaynaklı anestezi, değerlendirmek ve enjeksiyon kalite izlemek için enjeksiyon çözümde yardımı ile yetişkin farelerde göstermektedir. Başarısız olan iğneleri bu davranışı belli etmedi, ancak başarılı enjeksiyonları lidokain kaynaklı geçici felç tarafından işaretlenen. Enjeksiyon verimliliği tahmin yardımcı olmak için beş sınıflarda biri olarak geçici zayıflık düzeyini gizli. Son olarak, biz rAAVrh10 iletim düzeyi felç sınıf tarafından tahmin edilebilir gösterir. Bu nedenle, bu kulaklıklar AAV teslim yöntemi AAV aracılı gen-teslimat için deneysel tedavi CNS hastalıkları geliştirmek için kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

FVB/NJ fareler anahtar laboratuvar Hebei Nöroloji hayvan tesiste bred. Tüm fare deneyleri ikinci hastane, Hebei Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve laboratuvar hayvan yönetimi, Çin Halk Cumhuriyeti'nin teknoloji ve Bilim Bakanlığı tarafından yürürlüğe düzenlemelere göre yürütülen Çin.

1. %20 lidokain hidroklorür stok çözelti hazırlanması

  1. Lidokain hidroklorür 2 g ağırlığında. 5-6 mL steril su ve girdap yavaşça ekleyin. 10 mL steril su ile toplam hacmi artar.
  2. 1.2 0.2 mikronluk filtrelerden hisse senedi çözüm filtre. Aliquot hisse senedi çözüm, 1.5 mL microcentrifuge başına 1 mL tüp ve sızdırmazlık bir film ile kapatın. 4 ° C'de mağaza

2. doğrudan intratekal AAV teslim uyanık farelerde

  1. Tablo 1' de belirtildiği gibi gerekli malzemeleri hazırlamak ve çalışma alanının % 70 etanol ile steril gazlı bez kullanarak silin.
  2. RAAVrh10 hisse senedi çözüm (5 x 1012 genom kopya/mL) 95 µL bir steril 200 µL microcentrifuge tüp ekleyerek AAVrh.10/1% lidokain hidroklorür karmaşık 100 µL hazırlamak ve 5 µL % 20 lidokain hidroklorür hisse senedi çözüm ekleyin. Mix de yukarı ve aşağı pipetting. Sonra virüs çözümü buz (4 ° C) depolar.
    Not: fare4 başına 8 µL kullanılacaktır.
  3. AAV çözüm şırınga enjeksiyon için hazırlanıyor
    1. Bir 25 µL Hamilton şırınga ile 27 G iğne ve şırınga eğimli hacimsel ölçek iğneyle ucunda hizalamak bir araya getirin.
    2. 4 x 1010 genom kopyaları virüs çözümü ile 8 µL şırınga hafifçe çizin. Hava kabarcıkları kaldırdığınızdan emin olun.
  4. Fare hazırlanıyor
    Not:     erkek veya kadın FVB/NJ fareler (30-70 gün eski) Bu çalışmada kullanılmıştır. BT enjeksiyon mahallede ameliyat.
    1. KukuIeta % 70 etanol ile çalışma alanında sterilize. Yüzükoyun başlıklı bir bedpiece uyanık fare (erkek veya kadın, 30-70 günlükken, 13-20 gr ağırlığında) koyun. Fare sakin ve ısırılan önlemek için steril gazlı bez ile üst vücut kapak.
    2. Hayvan onun pelvik korse ile diğer tarafta bir yan ve işaret parmağı/orta parmağına bir başparmak üzerinde uygun şekilde ve sıkıca sürükleyici tarafından tamir. Cilt arasında ikili pelvik korse başparmak ve işaret parmağı ile gergin tutmak. Yavaşça hayvan üst vücut üzerinde hurma ile tutun.
    3. Kürk arasında ikili pelvik korse sırtında tıraş sonra cilt yüzeyinde bir iyodür tabanlı fırçalayın ve % 70 etanol ile sterilize.
  5. İntratekal enjeksiyon12
    1. İntervertebral alanı arasında ikili pelvik korse bir başparmak veya diğer elin işaret parmağı ile orta çizgi boyunca hissediyorum ve L5-L6 intervertebral alanı belirtmek için bir tırnak ile bir girinti tuşuna basın (enjeksiyon yeri bulmak).
    2. Kuyruk Bankası biraz ve yavaşça döndürün omurganın orta hat belirtmek için. Hayvan önce enjeksiyon (2.3.1 adımda belirtilen) Başkanı doğru iğne eğim ayarlayın.
    3. Hayvanlar sıkıca sabitlenir ve omurga orta çizgi boyunca iğne hizalamak emin olun.
    4. İğneyi yavaşça ve dikey olarak yerleştirin (veya biraz 70 – 80 ° eğim) girinti ve tutmak belgili tanımlık tenkıye bir merkez sagittal düzlemde kesiştiği. Kemik bağlandığında yaklaşık 30 ° açı yavaş yavaş azaltmak sonra iğne intervertebral uzaya kayma.
      Not: Bir belirgin ani kuyruk flick intradural alan başarılı bir giriş bir ibret vardır. Bir kez iğne intervertebral alanı girer, iğne ucu sıkıca klempe hissedeceksiniz. Bu çalışmada kullanılan 27 G iğne BT teslim fareler ama değil fareler için uygundur.
    5. (2.2 adımda belirtilen) vektör çözüm enjekte. Sayacı başlatmak ve vektör çözüm 1 µL/4 s. koru iğne yaklaşık 1 dk hızında 8 µL bitirdikten sonra enjekte teslim. İğne sızıntı önlemek için nazik döndürme ile geri alıyorum.
    6. Fare geçici zayıflık bacaklarda hemen doğumdan sonra enjeksiyon kalite4değerlendirmek için puan.
      Not: Standart4gibidir. 0 puan edinildi: zayıflık; 1 puan edinildi: küçük zayıflık hind bacaklarda olmadan yürüyüş anormallik; 2 puan edinildi: orta arka bacaklarda zayıflık belirgin yürüyüş anormallik ile; 3 puan edinildi: komple felç hind ekstremitelerin; 4 puan edinildi: tamamlamak hind bacaklarda felç, nefes darlığı ve ılımlı zayıflık ön bacaklarda; ve 5 puan: tüm dört bacaklarda felç ve belirgin darlığı tamamlandı.
    7. Fare kurtarma felç için kafes geri taşıyın.
  6. Temizlik
    1. Şırınga 1 mL steril su ile yıkayın. Laboratuvar malzemeleri sıralamak ve autoclaved sterilizasyon için tüm olmayan tek malzemeleri toplamak. Kürsüye % 70 etanol ile temizleyin.

3. doku hazırlık immunohistokimyasal boyama için

  1. Doku koleksiyonu
    1. Fare ile % 3 kloral hidrat (0.1 mL/10 g) 21 gün sonrası enjeksiyon, derin mayi enjeksiyonu ile anestezi.
    2. Transcardially ile buz gibi 0.01 M PBS (NaCl 147 mM; 20 mL sıvı NaH2PO4 1.9 mM; K2HPO4 8.1 mM, pH 7,4) ilk olarak, o zaman % 4 buz gibi paraformaldehyde (içinde 0.01 M PBS) pompası (10 mL/dk'ya 1 dk, sonra 5 mL/dk'ya 9 dk.) ile.
      Uyarı: Paraformaldehyde kanserojen ve zehirli. Sadece duman mahallede eldiven giyerken başa.
  2. Omurilik ve beyin diseksiyon
    1. Bacaklarda ve her hayvan Başkanı yüzükoyun bir köpük kutusunun kapağında şırınga iğneleri ile fix sonra şerit ve cilt başından sakrum için makas ile kaldırın.
    2. Kafatası gözler arasında küçük, kafatası ve beyincik üzerine yatay çizgi orta rotası yanında kesmek sonra kafatasının her iki tarafı için açın.
    3. Oksipital kemiğin cımbız ile Asansör ve spinal kanal bilateral oftalmik makasla açın. Her iki tarafta kaburga kesti ve vertebra üst yarısı dikkatli bir şekilde çıkarın.
    4. Beyin eğri cımbız ile kaldırın ve kafatası tabanı sinirleri sever, sonra tüm beyin ve omurilik dikkatle incelemek. Dokular %4 paraformaldehyde için 24 saat sonrası düzeltin.
  3. Dokusu dilimlerin hazırlanması
    1. Cryoprotect beyin ve servikal ve lomber spinal kord % 30 sükroz çözüm 4 ° C'de gecede Doku optimum kesim sıcaklığında (OCT) bileşik katıştırmak ve hızlı sıvı azot ile dondurma.
    2. Doku bir cryostat kullanarak 25 µm kesme ve donmuş bölümleri 0.01 M PBS kullanmak için 4 ° C'de depolayın.

4. immünhistokimya

  1. %1 H2O2 10 min için serbest yüzer bölümlerde pretreat sonra 10 dk. Incubate %5 serum ve %0,3 1 h için PBS içinde non-iyonik deterjan içeren bir engelleme çözüm için PBS içinde yıkayın.
  2. Gecede 4 ° C'de karşılık gelen birincil antikorlar dilimlerle kuluçkaya PBST bölümlerde yıkayın (% 0,2 ara 20 dakika sonra PBS) 30 dk (3 kez için 10 dk) için.
  3. Karşılık gelen biotin-ikincil antikor 1 h. PBST makinaya 30 dk (3 kez için 10 dk) için oda sıcaklığında dilimlerle kuluçkaya.
  4. Benzeşme biotin peroksidaz 40 min için karmaşık bölümlerle kuluçkaya ve achromogenic Ajan ile leke. Düzgün, Kuru ve bölümler slaytlar üzerine monte.
  5. 5 min için susuz etanol ve Ksilen 10 min için slaytları emmek, o zaman bir montaj orta slaytlarla mühür. Son olarak, slaytları bir şarj kuplajlı cihaz ile (CCD) donatılmış bir mikroskop ile 100 x 200 x ve 400 x büyütme görüntü.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Fareler farklı derecelerde geçici zayıflık değil peşini enjeksiyon AAV çözüm %1 lidokain hidroklorür nedeniyle çeşitli intratekal enjeksiyon kalitesini gösterdi. Biz kurduk yarı kantitatif 5 dereceli Puanlama sistemine göre AAV iletim şekillerinin farelerde lidokain kaynaklı uzuv zayıflık farklı derecelerde ile test ettik (0, n puan edinildi = 2; 1, n puan edinildi = 1; 4, n puan edinildi = 4; puan edinildi 5, n = 3). EGFP immunostaining spinal iplerden gösterdi ya hi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Teknik olarak, uyanık farelerde BT enjeksiyon sırasında birkaç önemli adımlar vardır. İlk, uygun jest ve firma denetimi tüm operasyon boyunca farelerin başarılı teslimat için bir ön koşul olduğunu. İkinci olarak, değil çok fazla direniş olmadan eklemek veya zorla hayvanlar yaralanmasına veya iğne ucunu bükme durumunda güçlü direnç altında eklemek için gerekli olduğu gibi en zor nokta intervertebral alanı iğne ucu ile hissediyor. Üçüncü olarak, lidokain nedeniyle geçici felç objektif ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser HEBEI İl Müdürlüğü insan kaynakları ve sosyal güvenlik (CY201605) hibe ve Hebei Eyaleti, Doğa Bilimleri Vakfı (H2017206101) bir hibe tarafından finanse edildi, ve biz AAV için sağlanan Guangping Gao için Dr için çok minnettarız Bu çalışmada.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
FVB/NJ miceCharles River Laboratories China
Lidocaine hydrochloride monohydrateHEOWNS73-78-9
AAVViral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School
25 µL  Hamilton syringe/27-30 G needleGASTIGHT1702
O.C.T compondSAKURA4583
H 2O 2SHUI HUAN PAI170401
Goat serumSolarbioS9070
Triton X-100LIFE SCIENCEST8200
Rabbit anti-GFPLife techG103621:333 dilution
The second antibody (goat-anti rabbit)Jackson Immuno Research111-005-1441:1,000 dilution
VECTASTAIN ABC REAGENTVector LabPK-6100
ImmPACT DAB Peroxidase Substrate KitVector LabSK-4105
Mounting medium for fluorescence with DAPIVectorshieldH-1200
NaClYong Da Chemical
NaH2PO4·2H2OYong Da Chemical
Na2HPO4·12H2OYong Da Chemical
ParaformaldehydeYong Da Chemical307699
Adhesion Microscope SlidesCITOGLAS1708325 mm x 75 mm
SUPER-SLIP MICRO-GLASElectro Microscopy Siences72236-6024 mm x 60 mm
15 mL Centrifuge tubeCORNING430790
96 well cell culture clusterCoster3599
24 well cell culture clusterCoster3524
70% EthanolWEN ZHI
GauzeWei AN051711128 cm x 10 cm x 12 cm
1 mL syringeHong Da
MicrotubesPlasmed
Micropipet eppendorf
Peppet tipsRainin
Centirifugeeppendorf5427R
RegeratorHaierBCD-539WT
FilterMILLEX GPR4PA42342
PumpLongerPumpBT-100-2J/YZ1515X
MicroscopeOlympusBX53
Freezing-microtomeLeicaCM1520

Referanslar

  1. Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76(2014).
  2. Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
  3. Yang, B., et al. Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10. Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).
  4. Guo, Y., et al. A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).
  5. Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
  6. Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).
  7. Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36(2015).
  8. Federic, T., et al. Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs. Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).
  9. Ayers, J. I., et al. Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice. Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).
  10. Li, D., et al. Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS. Neuroscience. 365, 192-205 (2017).
  11. Borel, F., et al. Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).
  12. Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).
  13. Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).
  14. Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).
  15. Wang, Y., et al. scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway. Brain Research. 1648, Pt A 1-10 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Neurosciencesay 144kulakl klarAAVgen iletimmerkezi sinir sistemilidokain hidroklor rEGFP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır