JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем технику инъекций непосредственно Интратекальное, с использованием 1% лидокаина гидрохлорида в вирусного решение для обеспечения эффективного аденоассоциированный вирус доставки мелких животных и создать систему скоринга для прогнозирования эффективности трансдукции в Центральной нервной системы по степени переходных слабость, вызванных лидокаина.

Аннотация

Интратекальное (ИТ) для инъекций аденоассоциированный вирус (AAV) привлекла большой интерес в ЦНС генной терапии в силу его безопасность, неивназивности и отличные трансдукции эффективность в ЦНС. Предыдущие исследования продемонстрировали терапевтического потенции AAV-доставлены генной терапии нейродегенеративных расстройств, его администрации. Однако были зарегистрированы высокие темпы непредсказуемым отказа из-за технического ограничения ИТ-администрирования в мелких животных. Здесь мы создали систему скоринга для обозначения степени успех поясничный прокол в мелких животных, добавив 1% лидокаина гидрохлорида в инъекционного раствора. Далее мы покажем, что степень переходных слабость после инъекции может предсказать эффективность трансдукции AAV. Таким образом этот метод впрыска ИТ может использоваться для оптимизации лечебные испытания в моделях мыши ЦНС заболеваний, которые поражают широким регионов центральной нервной системы.

Введение

AAV может посредничать экспрессии генов долгосрочный и широко распространенных в ЦНС трансдукция с несколько побочных эффектов и таким образом стал одним из наиболее перспективных транспортных средств для генной терапии для лечения заболеваний ЦНС, включая боковой амиотрофический склероз (ALS), Хантингтон болезнь (HD), болезни Альцгеймера (AD), хранения лизосомных заболеваний (ЛСД), болезнь Гоше (GD) и нейрональных цероид lipofuscinosis (NCL)1. В настоящее время более чем 100 AAV серотипов были изолированы от людей и животных. Среди них, по крайней мере 12 были использованы в доклинических и клинических испытаний, в том числе наиболее часто используемые гена векторов, таких как AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 и rAAVrh.101,2,3,,4, 5,6.

Различные заболевания ЦНС требуют разных стратегий AAV доставки из-за различных пострадавших регионов ЦНС и типы клеток. CNS регионов и клеток типы, которые могут передают AAV варьируется в зависимости от серотип а также способ доставки. Например было показано rAAVrh10 передавать преимущественно астроциты при доставке системных внутривенном (IV), в то время как он преобразованы нейронов и глии при доставке Интратекальное инъекций4,7. Кроме того паренхима инъекций привели к местных трансдукции в близости от укола, тогда как в спинномозговой жидкости (CSF) через внутрижелудочкового или Интратекальное инъекции привело к широко распространенной ЦНС трансдукции8 . Исследования также продемонстрировали терапевтических потенции AAV-доставлены генной терапии нейродегенеративных расстройств, его администрации9,10,11. Заболеваний, которые влияют на широких областях ЦНС как ALS было показано Интратекальное инъекции в РСУ охватывают большинство областей, которые страдают от болезни с низкой дозы, по сравнению с системными доставки метод4,10. Недавние исследования также показали, что Люмбальная пункция может использоваться для вставки AAV в моделях мыши для ALS, что позволяет избежать возможных травм, связанных с Ламинэктомия и Интратекальное катетеризация4.

Экспериментальные прямые Люмбальная пункция был впервые использован для доставки агентов, особенно анестетики, спинного для анестезии и наркоза в 1885 году12,13. В настоящем докладе мы иллюстрируем Поясничная пункция это инъекционный метод у взрослых мышей с помощью 1% лидокаина гидрохлорид, местной анестезии Амид производные, в инъекционного раствора для оценки и контроля качества инъекций. Успешное инъекции были отмечены лидокаин индуцированной временный паралич, тогда как неудачных инъекций не показывать это поведение. Мы классифицировать уровень переходных слабость как один из пяти классов, чтобы помочь предсказать эффективность инъекции. Наконец мы покажем, что уровень трансдукции rAAVrh10 могут быть предсказаны класс паралич. Таким образом этот метод доставки AAV Интратекальное может использоваться для повышения AAV-опосредованной ген поставка для экспериментальной терапии заболеваний ЦНС.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

FVB/NJ мышей были разведены в объекте животных ключ лаборатории неврологии Хэбэй. Все мыши эксперименты были утверждены второй больницы из провинции Хэбэй медицинского университета этики Комитетом и осуществляется согласно положениям о лабораторных животных управления, принятые министерством науки и техники Китайской Народной Республики Китай.

1. Подготовка 20% раствор лидокаина гидрохлорид

  1. Весят 2 г лидокаина гидрохлорида. Добавьте 5 – 6 мл стерильной воды и вихревой мягко. Увеличьте громкость в общей сложности 10 мл стерильной водой.
  2. 1.2 фильтр Стоковый раствор через фильтры 0,2 мкм. Алиготе Стоковый раствор, 1 мл на 1,5 мл microcentrifuge трубки и запечатать его с уплотнительной фильм. Хранить при 4 ° C.

2. прямой доставки Интратекальное AAV проснулся мышей

  1. Удаление рабочей области с помощью стерильных марлевых с 70% этанола и подготовить необходимые материалы, как указано в таблице 1.
  2. Подготовка 100 мкл AAVrh.10/1% лидокаина гидрохлорида комплекс, добавив 95 мкл rAAVrh10 раствор (5 x 1012 генома копий/мл) в стерильных трубку microcentrifuge 200 мкл и 5 мкл 20% раствор лидокаина гидрохлорида. Смешайте хорошо закупорить вверх и вниз. Затем Храните вирус раствор на льду (4 ° C).
    Примечание: 8 мкл на мыши4 будет использоваться.
  3. Подготовки шприц с AAV раствор для инъекций
    1. Соберите 25 мкл Гамильтон шприц с иглой 27 G и выровнять скошенный кончик иглы с объемной шкалы на шприц.
    2. Аккуратно нарисуйте 8 мкл с 4 x 1010 копии генома вируса раствора в шприц. Убедитесь в том удалить пузырьки воздуха.
  4. Подготовка мыши
    Примечание:     в этом исследовании использовались мужского или женского пола FVB/NJ мышей (30-70 дней). Это инъекции эксплуатировался в капюшоне.
    1. Стерилизуйте области работы в капюшон с 70% этиловом спирте. Положите проснулся мышь (мужского или женского пола, 30 – 70 дней, 13 – 20 гр) на bedpiece в положении лежа в капюшоне. Покрытие верхней части тела с стерильной марли, чтобы успокоить мыши и избегать укусов.
    2. Фиксация животного захвата надлежащим образом и твердо на своем тазового пояса с большой палец на одной стороне и указательный палец/средний палец на другой стороне. Держите кожу между двусторонними тазового пояса тугой с большим и указательным пальцами. Аккуратно возьмите на верхней части тела животного с ладони.
    3. Брить шерсть на спине между двусторонним тазового пояса, а затем стерилизовать поверхности кожи с йодидом скраб и 70% этанола.
  5. Интратекальное инъекций12
    1. Почувствовать межпозвонкового пространства вдоль средней линии между двусторонним тазового пояса с большим или указательным пальцем другой руки и нажать углубление с ногтем для обозначения L5-L6 межпозвонкового пространства (найти место инъекции).
    2. Повернуть основание хвоста слегка и мягко указать срединной линии позвоночника. Отрегулируйте скос иглы сторону головы животного перед инъекцией (упомянутый в шаге 2.3.1).
    3. Убедитесь, что животных зафиксированы твердо и выровнять иглу вдоль средней линии позвоночника.
    4. Вставить иглу осторожно и вертикально (или слегка наклоните 70 – 80°) в пересечении отступы и держать шприца в сагиттальной плоскости. Медленно уменьшить угол около 30°, когда она соединяет кости, а затем вставьте иглу в межпозвонкового пространства.
      Примечание: Проявляется внезапным хвост Флик является признаком успешного вступления в intradural пространство. После того, как игла входит межпозвонкового пространства, кончик иглы будут чувствовать себя прочно зажимается. 27 G иглы, используемые в данном исследовании подходит для доставки ИТ в мышей, но не крысы.
    5. Придать вектор решения (упомянутый в шаге 2.2). Запустите таймер и придать 8 мкл раствора вектор со скоростью 1 мкл/4 s. сохранить иглы приблизительно 1 мин после окончания поставки. Снять иглу с нежным вращения, чтобы избежать утечки.
    6. Оценка переходных слабость мыши конечностей, сразу же после родов для оценки качества инъекций4.
      Примечание: Стандартом является следующим4. Оценка 0: не слабость; Оценка 1: незначительные слабость задних конечностей без походка аномалии; Оценка 2: умеренный слабость задних конечностей с очевидным походка аномалии; Оценка 3: полный паралич задних конечностей; Оценка 4: полный паралич задних конечностей, затрудненное дыхание и умеренной слабости передних конечностей; и Оценка 5: полный паралич всех четырех конечностей и проявляется одышкой.
    7. Переместите мышь обратно в отсек для восстановления от паралича.
  6. Очистка
    1. Шприц 1 мл стерильной водой промойте. Сортировать лабораторных принадлежностей и собирать все материалы не disposable для газобетона стерилизации. Очистите скамейке с 70% этиловом спирте.

3. ткань подготовка иммуногистохимическое окрашивание

  1. Коллекция тканей
    1. Анестезировать мышей на впрыск 21 дней с 3% хлораль гидрат (0,1 мл/10 g) глубоко внутрибрюшинной инъекцией.
    2. Perfuse transcardially с 20 мл ледяной 0,01 М PBS (NaCl 147 мм; NaH2PO4 1.9 мм; K2HPO4 8,1 мм, рН 7,4) во-первых, затем 4% ледяной параформальдегида (в PBS 0,01 М) с насосом (10 мл/мин на 1 мин., затем 5 мл/мин за 9 мин).
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Параформальдегида канцерогенные и токсичные. Обрабатывать его только в вытяжной шкаф при ношении перчатки.
  2. Рассечение спинного и головного мозга
    1. Прикрепите конечностей и руководитель каждого животного в лежачем положении на крышке коробки пены с иглы для шприцов, а затем полосы и удалить кожу от головы до крестца с ножницами.
    2. Клип черепа между глазами, вырезать вместе с средней маршрут черепа и горизонтальной линии на мозжечка, затем откройте черепа с каждой стороны.
    3. Поднимите затылочной кости с помощью пинцета и открыть позвоночного канала на двусторонней основе офтальмологических ножницами. Cut off ребра с обеих сторон и осторожно извлеките верхнюю половину позвонков.
    4. Поднимите мозга с помощью пинцета, изогнутые и разорвать нервы основания черепа, а затем тщательно анализировать весь мозг и спинной мозг. После исправления тканей в параформальдегида 4% за 24 часа.
  3. Подготовка фрагментов тканей
    1. Cryoprotect мозга и шейного и поясничного отдела спинного мозга в 30% раствора сахарозы на ночь при 4 ° C. Внедрить ткани оптимального резки температуры (OCT) соединения и заморозить быстро с жидким азотом.
    2. Разрезать ткань на 25 мкм с помощью криостат и хранить Замороженные разделы в 0,01 М PBS на 4 ° C для использования.

4. иммуногистохимии

  1. Предварительной обработки свободно плавающего секций в 1% H2O2 за 10 мин, затем промыть в PBS на 10 мин инкубировать в блокирующий раствор, содержащий 5% сыворотки и 0,3% неионные моющего средства в PBS на 1 ч.
  2. Инкубировать ломтики с соответствующих первичных антител на ночь при 4 ° C. Мыть в подразделах PBST (0.2% 20 анимации в PBS) за 30 мин (3 раза по 10 минут каждый).
  3. Инкубируйте ломтики с соответствующими биотин среднее антител при комнатной температуре в течение 1 ч. мыть в PBST 30 мин (3 раза по 10 минут каждый).
  4. Инкубировать секции с сходства пероксидазы Биотин комплекс для 40 мин и пятно с агентом achromogenic. Смонтировать разделы на слайды и высыхания.
  5. Замочите слайды в безводном этаноле за 5 мин и ксилола за 10 мин, а затем уплотнение слайды с монтажа средних. Наконец изображение слайды с микроскопом с зарядовой (связью ПЗС) на 100 x, 200 x и 400 x увеличениях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мышей показал разной степени переходных слабость сразу после его инъекционного раствора AAV лидокаина гидрохлорид 1% из-за различных качества Интратекальное инъекции. Согласно полуколичественного 5-класс скоринговая система мы создали, мы протестировали трансдукции ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Технически есть несколько критических шагов во время инъекции IT проснулись мышей. Во-первых, надлежащий контроль жест и фирма мышей на протяжении всей операции является необходимым условием для успешной доставки. Во-вторых самые сложные точки чувство межпозвонкового пространства с к?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа финансировалась грант от ХЭБЭЙ провинций Департамент людских ресурсов и социального обеспечения (CY201605) и гранта от фонда естественных наук провинции Хэбэй (H2017206101), и мы очень благодарны доктора для ГАО Гуанпин, которые предоставили AAV для Это исследование.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
FVB/NJ miceCharles River Laboratories China
Lidocaine hydrochloride monohydrateHEOWNS73-78-9
AAVViral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School
25 µL  Hamilton syringe/27-30 G needleGASTIGHT1702
O.C.T compondSAKURA4583
H 2O 2SHUI HUAN PAI170401
Goat serumSolarbioS9070
Triton X-100LIFE SCIENCEST8200
Rabbit anti-GFPLife techG103621:333 dilution
The second antibody (goat-anti rabbit)Jackson Immuno Research111-005-1441:1,000 dilution
VECTASTAIN ABC REAGENTVector LabPK-6100
ImmPACT DAB Peroxidase Substrate KitVector LabSK-4105
Mounting medium for fluorescence with DAPIVectorshieldH-1200
NaClYong Da Chemical
NaH2PO4·2H2OYong Da Chemical
Na2HPO4·12H2OYong Da Chemical
ParaformaldehydeYong Da Chemical307699
Adhesion Microscope SlidesCITOGLAS1708325 mm x 75 mm
SUPER-SLIP MICRO-GLASElectro Microscopy Siences72236-6024 mm x 60 mm
15 mL Centrifuge tubeCORNING430790
96 well cell culture clusterCoster3599
24 well cell culture clusterCoster3524
70% EthanolWEN ZHI
GauzeWei AN051711128 cm x 10 cm x 12 cm
1 mL syringeHong Da
MicrotubesPlasmed
Micropipet eppendorf
Peppet tipsRainin
Centirifugeeppendorf5427R
RegeratorHaierBCD-539WT
FilterMILLEX GPR4PA42342
PumpLongerPumpBT-100-2J/YZ1515X
MicroscopeOlympusBX53
Freezing-microtomeLeicaCM1520

Ссылки

  1. Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76(2014).
  2. Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
  3. Yang, B., et al. Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10. Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).
  4. Guo, Y., et al. A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).
  5. Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
  6. Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).
  7. Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36(2015).
  8. Federic, T., et al. Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs. Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).
  9. Ayers, J. I., et al. Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice. Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).
  10. Li, D., et al. Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS. Neuroscience. 365, 192-205 (2017).
  11. Borel, F., et al. Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).
  12. Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).
  13. Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).
  14. Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).
  15. Wang, Y., et al. scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway. Brain Research. 1648, Pt A 1-10 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

144EGFP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены